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Metodi analitici per la determinazionedegli additivi alimentari

Prof. Alessandro BagnoUniversità di Padova

http://www.chimica.unipd.it/[email protected]

Corso Gli additivi alimentari: sicurezzaalimentare e produttiva, Arezzo, 4 ottobre 2013

A. Bagno: Metodi analitici per la determinazione degli additivi alimentari, ottobre 2013. Riproduzione vietata.

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Additivi: sostanze aggiunte intenzionalmente agli alimenti durante ilciclo produttivo, per raggiungere un obiettivo tecnologicoLa crescente domanda di cibi preparati richiede:•Aumento della durata di conservazione: antimicrobici, antiossidanti•Incremento del valore nutritivo: vitamine, sali minerali, amminoacidi•Incremento/stabilizzazione del valore sensoriale (pH, colore, aroma,sapore, consistenza): pigmenti, aromi, esaltatori di sapidità,emulsionanti

L'uso di conservanti in realtà è antico (sale, olio, aceto, alcool, fumo…)

L'uso è regolato per legge in tutti i Paesi, con limiti qualitativi equantitativi•La loro necessità tecnologica deve essere dimostrata•Gli additivi e i loro prodotti di degradazione non debbono esseretossici (es. nitriti)•Non devono indurre il consumatore in errore

Additivi alimentari: cosa sono e perché si usano


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Additivi nelle etichette e nella pubblicità


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Principali categorie di additivi

Tartrazina, riboflavina, caramelloetc.

Coloranti

Iodio (I), ferro (Fe), calcio (Ca),magnesio (Mg), rame (Cu), zinco(Zn) etc.

Minerali (come additivi)

BHT, acido ascorbico etc.Conservanti: antiossidanti

SO2, nitriti, acido benzoico etc.Conservanti: antimicrobici

Aspartame, saccarina, acesulfame KEdulcoranti

Glutammato monosodico, maltolo,xilitolo

Esaltatori di sapidità,sostituti dello zucchero

VanillinaAromi naturali e artificialiEsempioCategoria


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Tecniche cromatografiche:Gascromatografia (GC), Cromatografia liquida(LC, HPLC, High-Performance LiquidChromatography)

Come funzionano:•I componenti di una miscela vengono separatitramite interazione tra gas/liquido (GC), oliquido/liquido (LC)•Ciascun componente ha un “tempo diritenzione” caratteristico delle condizioni adottate•Analisi quantitativa

Prestazioni:•Alta sensibilità, strumentazione relativamentepoco costosa•Molto versatili•Tecniche principali per l’analisi delle sostanzeorganiche (quindi la maggior parte degli additivi)

Panoramica sui metodi analitici. 1

GC: sostanze volatili etermicamente stabili

LC: sostanze non volatili opoco stabili termicamente


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Panoramica sui metodi analitici. 2Spettrofotometria di assorbimentomolecolare UV/visibile

Come funziona:•Viene misurato l’assorbimento dellaradiazione UV/visibile, emessa da unalampada, da parte delle molecole pertransizioni elettroniche tra i livelli più esterni•Lo spettro di emissione e di assorbimentoè a bande•Analisi (qualitativa) e quantitativa

Prestazioni:•Alta sensibilità, purché la molecola diinteresse abbia assorbimenti adatti;strumentazione poco costosa•Adatta per molte sostanze organiche•Tecnica ampiamente usata anche comerivelatore per HPLC

Spettro di assobimento diuna molecola organica


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Panoramica sui metodi analitici. 3

Spettrofotometria di assorbimentoatomico (AAS)

Come funziona:•Una soluzione, contenente ioni metallici,viene nebulizzata in una fiamma•Si producono atomi metallici, cheassorbono selettivamente la luce emessada una lampada specifica per transizionielettroniche tra i livelli più esterni•Lo spettro di emissione e diassorbimento è a righe•Analisi qualitativa e quantitativa

Prestazioni:•Una delle tecniche più sensibili perl'analisi degli elementi metallici•Possibile per circa 70 elementi

Spettro di emissione del ferro


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•I componenti di una miscela vengono separati sfruttando le interazioni con unliquido viscoso adsorbito su un materiale solido (fase fissa o stazionaria)•La fase stazionaria è posta in una colonna cromatografica (alcuni m)•Si esegue iniettando il campione in testa alla colonna e facendo fluire un gas ditrasporto (fase mobile; un gas inerte come azoto, argon o idrogeno) lungo lacolonna

Le specie da separare si sciolgono nella fase stazionaria liquidaRipartizione del soluto tra la fase fissa (il liquido immobilizzato) e il gasinerte (l'eluente)Interazioni più o meno forti con la fase solidaScambio dei soluti tra la fase gassosa e la fase solida

Gascromatografia (GC): lo strumento

Colonnacromatograficae termostato

Rivelatore

Iniettore

Flusso difase mobile


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•Il gas di trasporto trascina icomponenti che si trovano nella fasemobile gassosa (eluizione)•Ciascun componente migraall'interno della colonna con propriavelocità•Se il flusso di gas è costante, icomponenti vengono trattenuti perun tempo caratteristico (tempo diritenzione) e quindi escono dallacolonna a tempi diversi•La colonna deve esseretermostatabile: aumentando latemperatura il tempo di ritenzionediminuisce

Gascromatografia (GC): Eluizione

GC di una miscela disostanze organiche

Tempo diritenzione

La riuscita dell'analisi (cioè la separazione dei componenti) dipende dallascelta di condizioni appropriate (temperatura, tipo di colonna)

L'area dei picchi cromatografici è proporzionalealla quantità del componente eluito

Analisi qualitativa (tempo di ritenzione) equantitativa (area del picco)


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Preparazione dei campioni•Le sostanze da separare devono essere portate ad una temperaturasufficiente a renderle gassose o allo stato di vapore•Il campione (1-5 l) viene posto in colonna tramite un iniettore termostatatoad alta temperatura•Solitamente nell'iniettore il campione viene diviso in due porzioni, così dainviare alla colonna 1% del campione iniettato

RivelatoreIl più comune per sostanze organiche è a ionizzazione di fiamma (FID)Il soluto eluito in uscita dalla colonna viene miscelato ad un gas combustibile(idrogeno) ed aria, e accesoLa fiamma è posta tra due elettrodi (ddp 300 V). In assenza di soluto eluito, lafiamma contiene radicali neutri; in presenza di sostanze organiche anchespecie ioniche corrente elettrica. Molto versatile.•Sensibilità elevata: dell’ordine di 10-6 – 10-9 g/l.

Limitazione: l’analita deve essere volatile e stabile alla temperaturarichiesta; altrimenti derivatizzazione (pre-trasformazione in derivati volatili)

Gascromatografia (GC): problemi


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•Fase stazionaria: un liquido che riveste con uno strato sottile un solido inerte•Fase mobile: un liquido immiscibile con la fase stazionaria (eluente)•L'equilibrio di ripartizione è liquido-liquido•L'eluente attraversa la colonna sotto alte pressioni flussi notevoli ancheattraverso colonne capillari

Cromatografia liquida (HPLC): lo strumento

Serbatoiosolvente

Pompa

IniettoreColonna

Compartimentotermostatato

Rivelatore


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Cromatografia liquida (HPLC): problemi

Preparazione dei campioni•Le sostanze da analizzare si trovano a temperatura ambiente; non ènecessario che siano volatili No derivatizzazione•Il campione (1-5 l) viene posto in colonna tramite un iniettore termostatato.Solitamente nell'iniettore il campione viene diviso in due porzioni, così dainviare alla colonna 1% del campione iniettato

ColonneTradizionalmente la fase mobile è polare e l’eluente poco polare (fasenormale); se vale l’opposto si dice a fase inversa

RivelatoreIl più comune per sostanze organiche è di tipo spettrofotometrico(assorbimento a 260 nm).•Sensibilità elevata: dell’ordine di 10-6 – 10-9 g/l. Molto sensibile, ma…

Limitazione: Le sostanze da analizzare debbono contenere gruppi cromoforiadatti


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Spettrofotometria molecolare: lo strumentoLa soluzione viene posta in una cella (cuvetta) di quarzo, e viene attraversatada un fascio di luce monocromatico prodotto da una lampada policromaticaattraverso il monocromatore.Le molecole posseggono una propria energia di eccitazione (UV/visibile). Seuna radiazione di lunghezza d’onda opportuna attraversa la cella, laassorbiranno selettivamente (se posseggono le transizioni adatte): si ha quindidiminuzione (assorbimento) dell'intensità della radiazione proporzionale allaconcentrazione delle molecole•Viene rivelata la radiazione trasmessa

Lampada(sorgente)

Monocromatore Cella (cuvetta) e campione

Rivelatore


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Spettrofotometria molecolare: problemi

Preparazione dei campioni•Il campione deve essere presente in soluzione limpida•Sensibilità elevata: dell’ordine di 10-6 – 10-9 g/l; dipende molto dallanatura dell’analita•Metodo adatto per rivelare molte sostanze organiche, spesso usato comerivelatore per cromatografia


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La soluzione viene nebulizzata in una fiamma (acetilene, idrogeno o propano;T > 2000 °C) dissociazione in atomi•Una radiazione di lunghezza d’onda opportuna attraversa la fiamma e vieneassorbita selettivamente dagli atomi•Gli atomi posseggono una propria energia di eccitazione (UV-visibile). Se unaradiazione di lunghezza d’onda opportuna attraversa la fiamma, gli atomi laassorbiranno selettivamente: si ha quindi diminuzione (assorbimento)dell'intensità della radiazione proporzionale al numero di atomi•Viene rivelata la radiazione trasmessa

Spettrofotometria di assorbimento atomico: lo strumento

Sorgente (lampadaa catodo cavo)

Atomizzatore

Campione

FiammaRivelatore


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Preparazione dei campioni•Il metodo lavora su atomi piuttosto che molecole. Vienedeterminata non una specie molecolare ma un tipo di atomo(ad es. ferro, calcio, zinco)•Il campione deve essere completamente mineralizzato, cioètrasformato in una specie inorganica ionica (ione ferro, calcio,zinco etc.)•Necessaria una “lampada a catodo cavo" specifica perciascun elemento, che emette la radiazione opportuna: unascarica elettrica ionizza l'elemento in esame, emettendo cosìla radiazione necessaria

•Sensibilità elevata: dell’ordine di 10-6 – 10-9 g/l. Metodomolto adatto per rivelare tracce di metalli

Spettrofotometria di assorbimento atomico: problemi


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Additivi alimentari: conservanti

Molto comuni. Attivi contromuffe e lieviti. Presenti nei

prodotti da forno, formaggi(l’acido propionico è un

costituente naturale)

Acido benzoicoE210

Acido sorbicoE200

Acido ascorbico(vitamina C) E300

Antiossidantemolto comune

CH3—CH2—COOH Acido propionicoE280


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Analisi degli additivi alimentari: conservanti

HPLC a fase inversa. Eluente:acetonitrile/acetato di sodio/acidoacetico, pH 4.5Rivelatore UV a 257 nm

in fase acquosacon metanolo

Prodotti da forno,polenta, gnocchi dipatate, pasta conripieno

Acido sorbico

GC a 220 °C. Gas di trasporto: elioin fase acquosacon acidoformico

Prodotti da fornoAcidopropionico

HPLC a fase inversa. Eluente:acetonitrile/acetato di sodio/acidoacetico, pH 4.5Rivelatore UV 254 nm

in fase acquosacon acidofosforico

Tutti gli alimentiAcidobenzoico

HPLC a fase inversa. Eluente:acetonitrileRivelatore UV 210 nm

in fase acquosacon acidofosforico

Tutti gli alimentiAcidoascorbico eacido citrico

DeterminazioneEstrazioneFonteAdditivo


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Additivi alimentari: edulcoranti

SNH

O

O OOSN-

O

H3CO

O

K+

Edulcoranti molto comuni, con potere dolcificante moltosuperiore allo zucchero (spesso con retrogusto amaro)Usati in prodotti dolciari e bibite “dietetiche”. L’aspartame èperò poco stabile termicamente

Acesulfame KE950

SaccarinaE954

AspartameE951

CH2COOHHC

CNHCH CH2COOCH3

NH2

O


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Analisi degli additivi alimentari: edulcoranti

HPLC a fase inversa. Eluente:acido acetico/metanoloRivelatore UV a 254 nm

nessunaBevande,dolcificanti

Saccarina

HPLC a fase inversa. Eluente:metanolo/tampone fosfatoRivelatore UV 210 nm

con eluenteBevande,dolcificanti

Aspartame

HPLC a fase inversa. Eluente:metanolo/tampone fosfatoRivelatore UV 210 nm

con eluenteBevande,dolcificanti

Acesulfame K



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Additivi alimentari: esaltatori di sapidità

Glutammato monosodicoE621

Il più noto esaltatore di sapidità peralimenti a base proteica

Problema analitico: sostanza non volatile, non stabile termicamente (noGC); senza assorbimento nell’UV (no HPLC) derivatizzazione con ilfluorenilmetil cloroformiato (FMOC), che conferisce intenso assorbimento

FMOC


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Additivi alimentari: emulsionanti

Mono- e di-acilgliceroli (mono- e di-gliceridi degli acidi grassi)E471

Comuni emulsionanti usati perdare morbidezza ai prodotti daforno

CH2OH

CH-O

CH2O

C

C

OR2

OR3

CH2OH

CH-OH

CH2O CO

R3

Problema analitico: sostanze non volatili ma stabili termicamentederivatizzazione con metile solfato formazione di esteri metilici degliacidi grassi, che sono volatili (GC)


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Analisi degli additivi alimentari: esaltatori disapidità, emulsionanti

Saponificazioneed esterificazione

Fluorenilmetilcloroformiato(FMOC)

Derivatizzazione

GCCloroformio**Prodottida forno

Mono- e di-gliceridi degliacidi grassi

HPLC. Eluente:acetonitrile/metanolo/tampone citratoRivelatore UV 265 nm

Acidocloridrico*

Tutti glialimenti

Glutammatomonosodico


*Dopo precipitazione delle proteine con acido solfosalicilico**Dopo digestione enzimatica


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Additivi alimentari: nitriti e nitrati

Conservanti molto attivi per prevenire intossicazioni daClostridium botulinum (botulismo)Uso prevalente nella carne conservata;Potenzialmente tossici (precursori di nitrosammine)

NaNO2 (E250), KNO2 (E249); NaNO3 (E251), KNO3 (E252)

Problema analitico: sostanze non volatili, poco stabili termicamente, prive diassorbimento all’UV reazione con solfanilammide e naftilendiamminaformazione di una sostanza fortemente colorata (spettrofotometria)

NHCH2CH2NH2N2

+

SO2NH2

+

NHCH2CH2NH2

N

N SO2NH2


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Additivi alimentari: sali minerali

I sali minerali sono i componenti che rimangono (ceneri) dopo iltrattamento a 500 °C dei tessuti animali e vegetaliElementi principali (Ca, P, K, Cl, Na, Mg)Elementi in tracce (oligoelementi; Fe, Zn, Cu, Mn, I, Mo, etc.)Elementi essenziali (ruolo biologico conosciuto); elementi non essenziali(funzione sconosciuta), ed elementi tossici

La loro importanza non è solo nutrizionale: contribuisconoall'aroma degli alimenti, possono attivare o inibire reazionienzimatiche, modificano la consistenza

Il contenuto di sali minerali negli alimenti viene determinatoprincipalmente mediante spettrofotometria di assorbimento atomicoEsempio: calcio, ferro e zinco


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Analisi degli additivi alimentari: Ca, Fe, Zn

AAS in fiammaaria/acetilene213.9 nm

Zinco


Ferro


Mineralizzazione a secco,per via umida o in forno amicroonde

Tutti gli alimenti

Calcio



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