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Metodi analitici per la determinazionedegli additivi alimentari
Prof. Alessandro BagnoUniversità di Padova
http://www.chimica.unipd.it/[email protected]
Corso Gli additivi alimentari: sicurezzaalimentare e produttiva, Arezzo, 4 ottobre 2013
A. Bagno: Metodi analitici per la determinazione degli additivi alimentari, ottobre 2013. Riproduzione vietata.
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Additivi: sostanze aggiunte intenzionalmente agli alimenti durante ilciclo produttivo, per raggiungere un obiettivo tecnologicoLa crescente domanda di cibi preparati richiede:•Aumento della durata di conservazione: antimicrobici, antiossidanti•Incremento del valore nutritivo: vitamine, sali minerali, amminoacidi•Incremento/stabilizzazione del valore sensoriale (pH, colore, aroma,sapore, consistenza): pigmenti, aromi, esaltatori di sapidità,emulsionanti
L'uso di conservanti in realtà è antico (sale, olio, aceto, alcool, fumo…)
L'uso è regolato per legge in tutti i Paesi, con limiti qualitativi equantitativi•La loro necessità tecnologica deve essere dimostrata•Gli additivi e i loro prodotti di degradazione non debbono esseretossici (es. nitriti)•Non devono indurre il consumatore in errore
Additivi alimentari: cosa sono e perché si usano
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Additivi nelle etichette e nella pubblicità
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Principali categorie di additivi
Tartrazina, riboflavina, caramelloetc.
Coloranti
Iodio (I), ferro (Fe), calcio (Ca),magnesio (Mg), rame (Cu), zinco(Zn) etc.
Minerali (come additivi)
BHT, acido ascorbico etc.Conservanti: antiossidanti
SO2, nitriti, acido benzoico etc.Conservanti: antimicrobici
Aspartame, saccarina, acesulfame KEdulcoranti
Glutammato monosodico, maltolo,xilitolo
Esaltatori di sapidità,sostituti dello zucchero
VanillinaAromi naturali e artificialiEsempioCategoria
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Tecniche cromatografiche:Gascromatografia (GC), Cromatografia liquida(LC, HPLC, High-Performance LiquidChromatography)
Come funzionano:•I componenti di una miscela vengono separatitramite interazione tra gas/liquido (GC), oliquido/liquido (LC)•Ciascun componente ha un “tempo diritenzione” caratteristico delle condizioni adottate•Analisi quantitativa
Prestazioni:•Alta sensibilità, strumentazione relativamentepoco costosa•Molto versatili•Tecniche principali per l’analisi delle sostanzeorganiche (quindi la maggior parte degli additivi)
Panoramica sui metodi analitici. 1
GC: sostanze volatili etermicamente stabili
LC: sostanze non volatili opoco stabili termicamente
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Panoramica sui metodi analitici. 2Spettrofotometria di assorbimentomolecolare UV/visibile
Come funziona:•Viene misurato l’assorbimento dellaradiazione UV/visibile, emessa da unalampada, da parte delle molecole pertransizioni elettroniche tra i livelli più esterni•Lo spettro di emissione e di assorbimentoè a bande•Analisi (qualitativa) e quantitativa
Prestazioni:•Alta sensibilità, purché la molecola diinteresse abbia assorbimenti adatti;strumentazione poco costosa•Adatta per molte sostanze organiche•Tecnica ampiamente usata anche comerivelatore per HPLC
Spettro di assobimento diuna molecola organica
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Panoramica sui metodi analitici. 3
Spettrofotometria di assorbimentoatomico (AAS)
Come funziona:•Una soluzione, contenente ioni metallici,viene nebulizzata in una fiamma•Si producono atomi metallici, cheassorbono selettivamente la luce emessada una lampada specifica per transizionielettroniche tra i livelli più esterni•Lo spettro di emissione e diassorbimento è a righe•Analisi qualitativa e quantitativa
Prestazioni:•Una delle tecniche più sensibili perl'analisi degli elementi metallici•Possibile per circa 70 elementi
Spettro di emissione del ferro
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•I componenti di una miscela vengono separati sfruttando le interazioni con unliquido viscoso adsorbito su un materiale solido (fase fissa o stazionaria)•La fase stazionaria è posta in una colonna cromatografica (alcuni m)•Si esegue iniettando il campione in testa alla colonna e facendo fluire un gas ditrasporto (fase mobile; un gas inerte come azoto, argon o idrogeno) lungo lacolonna
Le specie da separare si sciolgono nella fase stazionaria liquidaRipartizione del soluto tra la fase fissa (il liquido immobilizzato) e il gasinerte (l'eluente)Interazioni più o meno forti con la fase solidaScambio dei soluti tra la fase gassosa e la fase solida
Gascromatografia (GC): lo strumento
Colonnacromatograficae termostato
Rivelatore
Iniettore
Flusso difase mobile
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•Il gas di trasporto trascina icomponenti che si trovano nella fasemobile gassosa (eluizione)•Ciascun componente migraall'interno della colonna con propriavelocità•Se il flusso di gas è costante, icomponenti vengono trattenuti perun tempo caratteristico (tempo diritenzione) e quindi escono dallacolonna a tempi diversi•La colonna deve esseretermostatabile: aumentando latemperatura il tempo di ritenzionediminuisce
Gascromatografia (GC): Eluizione
GC di una miscela disostanze organiche
Tempo diritenzione
La riuscita dell'analisi (cioè la separazione dei componenti) dipende dallascelta di condizioni appropriate (temperatura, tipo di colonna)
L'area dei picchi cromatografici è proporzionalealla quantità del componente eluito
Analisi qualitativa (tempo di ritenzione) equantitativa (area del picco)
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Preparazione dei campioni•Le sostanze da separare devono essere portate ad una temperaturasufficiente a renderle gassose o allo stato di vapore•Il campione (1-5 l) viene posto in colonna tramite un iniettore termostatatoad alta temperatura•Solitamente nell'iniettore il campione viene diviso in due porzioni, così dainviare alla colonna 1% del campione iniettato
RivelatoreIl più comune per sostanze organiche è a ionizzazione di fiamma (FID)Il soluto eluito in uscita dalla colonna viene miscelato ad un gas combustibile(idrogeno) ed aria, e accesoLa fiamma è posta tra due elettrodi (ddp 300 V). In assenza di soluto eluito, lafiamma contiene radicali neutri; in presenza di sostanze organiche anchespecie ioniche corrente elettrica. Molto versatile.•Sensibilità elevata: dell’ordine di 10-6 – 10-9 g/l.
Limitazione: l’analita deve essere volatile e stabile alla temperaturarichiesta; altrimenti derivatizzazione (pre-trasformazione in derivati volatili)
Gascromatografia (GC): problemi
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•Fase stazionaria: un liquido che riveste con uno strato sottile un solido inerte•Fase mobile: un liquido immiscibile con la fase stazionaria (eluente)•L'equilibrio di ripartizione è liquido-liquido•L'eluente attraversa la colonna sotto alte pressioni flussi notevoli ancheattraverso colonne capillari
Cromatografia liquida (HPLC): lo strumento
Serbatoiosolvente
Pompa
IniettoreColonna
Compartimentotermostatato
Rivelatore
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Cromatografia liquida (HPLC): problemi
Preparazione dei campioni•Le sostanze da analizzare si trovano a temperatura ambiente; non ènecessario che siano volatili No derivatizzazione•Il campione (1-5 l) viene posto in colonna tramite un iniettore termostatato.Solitamente nell'iniettore il campione viene diviso in due porzioni, così dainviare alla colonna 1% del campione iniettato
ColonneTradizionalmente la fase mobile è polare e l’eluente poco polare (fasenormale); se vale l’opposto si dice a fase inversa
RivelatoreIl più comune per sostanze organiche è di tipo spettrofotometrico(assorbimento a 260 nm).•Sensibilità elevata: dell’ordine di 10-6 – 10-9 g/l. Molto sensibile, ma…
Limitazione: Le sostanze da analizzare debbono contenere gruppi cromoforiadatti
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Spettrofotometria molecolare: lo strumentoLa soluzione viene posta in una cella (cuvetta) di quarzo, e viene attraversatada un fascio di luce monocromatico prodotto da una lampada policromaticaattraverso il monocromatore.Le molecole posseggono una propria energia di eccitazione (UV/visibile). Seuna radiazione di lunghezza d’onda opportuna attraversa la cella, laassorbiranno selettivamente (se posseggono le transizioni adatte): si ha quindidiminuzione (assorbimento) dell'intensità della radiazione proporzionale allaconcentrazione delle molecole•Viene rivelata la radiazione trasmessa
Lampada(sorgente)
Monocromatore Cella (cuvetta) e campione
Rivelatore
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Spettrofotometria molecolare: problemi
Preparazione dei campioni•Il campione deve essere presente in soluzione limpida•Sensibilità elevata: dell’ordine di 10-6 – 10-9 g/l; dipende molto dallanatura dell’analita•Metodo adatto per rivelare molte sostanze organiche, spesso usato comerivelatore per cromatografia
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La soluzione viene nebulizzata in una fiamma (acetilene, idrogeno o propano;T > 2000 °C) dissociazione in atomi•Una radiazione di lunghezza d’onda opportuna attraversa la fiamma e vieneassorbita selettivamente dagli atomi•Gli atomi posseggono una propria energia di eccitazione (UV-visibile). Se unaradiazione di lunghezza d’onda opportuna attraversa la fiamma, gli atomi laassorbiranno selettivamente: si ha quindi diminuzione (assorbimento)dell'intensità della radiazione proporzionale al numero di atomi•Viene rivelata la radiazione trasmessa
Spettrofotometria di assorbimento atomico: lo strumento
Sorgente (lampadaa catodo cavo)
Atomizzatore
Campione
FiammaRivelatore
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Preparazione dei campioni•Il metodo lavora su atomi piuttosto che molecole. Vienedeterminata non una specie molecolare ma un tipo di atomo(ad es. ferro, calcio, zinco)•Il campione deve essere completamente mineralizzato, cioètrasformato in una specie inorganica ionica (ione ferro, calcio,zinco etc.)•Necessaria una “lampada a catodo cavo" specifica perciascun elemento, che emette la radiazione opportuna: unascarica elettrica ionizza l'elemento in esame, emettendo cosìla radiazione necessaria
•Sensibilità elevata: dell’ordine di 10-6 – 10-9 g/l. Metodomolto adatto per rivelare tracce di metalli
Spettrofotometria di assorbimento atomico: problemi
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Additivi alimentari: conservanti
Molto comuni. Attivi contromuffe e lieviti. Presenti nei
prodotti da forno, formaggi(l’acido propionico è un
costituente naturale)
Acido benzoicoE210
Acido sorbicoE200
Acido ascorbico(vitamina C) E300
Antiossidantemolto comune
CH3—CH2—COOH Acido propionicoE280
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Analisi degli additivi alimentari: conservanti
HPLC a fase inversa. Eluente:acetonitrile/acetato di sodio/acidoacetico, pH 4.5Rivelatore UV a 257 nm
in fase acquosacon metanolo
Prodotti da forno,polenta, gnocchi dipatate, pasta conripieno
Acido sorbico
GC a 220 °C. Gas di trasporto: elioin fase acquosacon acidoformico
Prodotti da fornoAcidopropionico
HPLC a fase inversa. Eluente:acetonitrile/acetato di sodio/acidoacetico, pH 4.5Rivelatore UV 254 nm
in fase acquosacon acidofosforico
Tutti gli alimentiAcidobenzoico
HPLC a fase inversa. Eluente:acetonitrileRivelatore UV 210 nm
in fase acquosacon acidofosforico
Tutti gli alimentiAcidoascorbico eacido citrico
DeterminazioneEstrazioneFonteAdditivo
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Additivi alimentari: edulcoranti
SNH
O
O OOSN-
O
H3CO
O
K+
Edulcoranti molto comuni, con potere dolcificante moltosuperiore allo zucchero (spesso con retrogusto amaro)Usati in prodotti dolciari e bibite “dietetiche”. L’aspartame èperò poco stabile termicamente
Acesulfame KE950
SaccarinaE954
AspartameE951
CH2COOHHC
CNHCH CH2COOCH3
NH2
O
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Analisi degli additivi alimentari: edulcoranti
HPLC a fase inversa. Eluente:acido acetico/metanoloRivelatore UV a 254 nm
nessunaBevande,dolcificanti
Saccarina
HPLC a fase inversa. Eluente:metanolo/tampone fosfatoRivelatore UV 210 nm
con eluenteBevande,dolcificanti
Aspartame
HPLC a fase inversa. Eluente:metanolo/tampone fosfatoRivelatore UV 210 nm
con eluenteBevande,dolcificanti
Acesulfame K
DeterminazioneEstrazioneFonteAdditivo
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Additivi alimentari: esaltatori di sapidità
Glutammato monosodicoE621
Il più noto esaltatore di sapidità peralimenti a base proteica
Problema analitico: sostanza non volatile, non stabile termicamente (noGC); senza assorbimento nell’UV (no HPLC) derivatizzazione con ilfluorenilmetil cloroformiato (FMOC), che conferisce intenso assorbimento
FMOC
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Additivi alimentari: emulsionanti
Mono- e di-acilgliceroli (mono- e di-gliceridi degli acidi grassi)E471
Comuni emulsionanti usati perdare morbidezza ai prodotti daforno
CH2OH
CH-O
CH2O
C
C
OR2
OR3
CH2OH
CH-OH
CH2O CO
R3
Problema analitico: sostanze non volatili ma stabili termicamentederivatizzazione con metile solfato formazione di esteri metilici degliacidi grassi, che sono volatili (GC)
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Analisi degli additivi alimentari: esaltatori disapidità, emulsionanti
Saponificazioneed esterificazione
Fluorenilmetilcloroformiato(FMOC)
Derivatizzazione
GCCloroformio**Prodottida forno
Mono- e di-gliceridi degliacidi grassi
HPLC. Eluente:acetonitrile/metanolo/tampone citratoRivelatore UV 265 nm
Acidocloridrico*
Tutti glialimenti
Glutammatomonosodico
DeterminazioneEstrazioneFonteAdditivo
*Dopo precipitazione delle proteine con acido solfosalicilico**Dopo digestione enzimatica
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Additivi alimentari: nitriti e nitrati
Conservanti molto attivi per prevenire intossicazioni daClostridium botulinum (botulismo)Uso prevalente nella carne conservata;Potenzialmente tossici (precursori di nitrosammine)
NaNO2 (E250), KNO2 (E249); NaNO3 (E251), KNO3 (E252)
Problema analitico: sostanze non volatili, poco stabili termicamente, prive diassorbimento all’UV reazione con solfanilammide e naftilendiamminaformazione di una sostanza fortemente colorata (spettrofotometria)
NHCH2CH2NH2N2
+
SO2NH2
+
NHCH2CH2NH2
N
N SO2NH2
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Additivi alimentari: sali minerali
I sali minerali sono i componenti che rimangono (ceneri) dopo iltrattamento a 500 °C dei tessuti animali e vegetaliElementi principali (Ca, P, K, Cl, Na, Mg)Elementi in tracce (oligoelementi; Fe, Zn, Cu, Mn, I, Mo, etc.)Elementi essenziali (ruolo biologico conosciuto); elementi non essenziali(funzione sconosciuta), ed elementi tossici
La loro importanza non è solo nutrizionale: contribuisconoall'aroma degli alimenti, possono attivare o inibire reazionienzimatiche, modificano la consistenza
Il contenuto di sali minerali negli alimenti viene determinatoprincipalmente mediante spettrofotometria di assorbimento atomicoEsempio: calcio, ferro e zinco
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Analisi degli additivi alimentari: Ca, Fe, Zn
AAS in fiammaaria/acetilene213.9 nm
Zinco
AAS in fiammaaria/acetilene248.3 nm
Ferro
AAS in fiammaaria/acetilene422.7 nm
Mineralizzazione a secco,per via umida o in forno amicroonde
Tutti gli alimenti
Calcio
DeterminazioneEstrazioneFonteAdditivo
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