1

Regolazione dell’espressione

genica

2

-le cellule differenziate sono prodotte da popolazioni di cellule immature,

non specializzate, dette cellule staminali, attraverso un processo noto come differenziamento cellulare.

Eucarioti pluricellulari

-un singolo organismo, utilizzando un unico genoma, deve produrre centinaia di tipi cellulari differenti e specializzati.

3

I meccanismi di controllo usati per regolare l’espressione deigeni umani a differenza di quelli dei procarioti, devono riuscire a gestire quantità molto superiori di DNA, “impacchettati” in strutture apparentemente inaccessibili.

4

•Regolazione trascrizionale

•Regolazione post-trascrizionale

•Meccanismi epigenetici e controllo dell’espressione genica a lunga distanza

5

Cellula umana contiene circa 24000 geni

RNA genes (rRNA, tRNA, miRNA o MIR)

Geni per proteine

Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola

parte di questo potenziale (˜ 5000 geni)

Geni housekeeping Geni tessuto - specifici

metabolismobiosintesimembrane cellulariistoniRNA ribosomiali DIFFERENZIAMENTO

CELLULARE

6

NUCLEO

controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi responsivi di geni inducibili

controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessuto-specifico

controllo del trasporto

mRNA

controllo della stabilità

degradazionetraduzione

PROTEINA

controllo post-traduzionale

PROTEINA attiva o inattiva

DNA Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina

Trascritto primario(precursore)

mRNA

controllo traduzionale

CITOPLASMA

Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica negli eucarioti

7

Controllo Genomico

Decondensazione della cromatina e espressione genica

8

�Se si procede all’estrazione della cromatina dalle cellule, la si tratta con endonucleasi aspecifiche e si procede quindi all’estrazione del DNA, si nota, dopo corsa elettroforetica, che la maggior parte del DNA viene rotto in frammenti di 200 bp o in multipli di tale lunghezza.

�Il DNA cromosomico è protetto dall’azione delle nucleasi perché associato alle proteine istoniche.

9

Globina

BamHI BamHI4,6 kb

Globina

BamHI BamHI4,6 kb

Eritroblasto embrionale di 14 giorni

DNAseI DNAseI

Cellule non differenziate MSB

�Isolamento dei nuclei e digestione con quantità crescente di DnasiI.

�Estrazione DNA

�digestione con BamHI

�Analisi mediante Southern Blot

�Ibridazione con globina

Negli eucarioti superiori i geni inattivi da un punto di vista trascrizionale hanno una struttura cromatinica meno accessibile

10

DnaseI (µg/ml) 0 1,50,01 0,05 0,1 0,5 1 1,5

4,6kb

DNA da Eritroblasti di 14 giorni

Geni attivi da un punto trascrizionale sono più suscettibili di quelli inattivi alla digestione con DNAsiI

Sono in una conformazione cromatinica particolare che li rende più accessibili a

DNAsiI

Il DNA trascrizionalmente inattivo assume una conformazione cromatinica piùcondensata che protegge il gene globinico dalla digestione con DNAsiI

DNA da cellule MBS

11

�Esistono anche siti di ipersensibilità alla DnasiI, evidenziabili con trattamenti più blandi.

�Sono siti probabilmente localizzati al 5’ dei geni nelle regioni regolatorie dei geni e sono considerate regioni in cui i nucleosomi sono stati rimossi e quindi più accesibili alle proteine regolatorie

12

Gene ExpressionLa regolazione dell’espressione

genica può avvenire ad ogni passaggio

Per la maggior parte dei geni avviene a livello dell’inizio della trascrizione.

Esso coinvolge cambiamenti della struttura della cromatina al promotore, accompagnati dal legame del apparato basale di trascrizione (inclusa RNA polymerase II) al promotore.

Eventi successivi possono modificare il tipo di proteina che viene espressa.

13

La decondensazione della cromatina rappresenta un prerequisito dell’attivazione trascrizionale

14

•EUCROMATINA -> TRASCRIZIONE POTENZIALE

a) geni housekeeping

b) geni tessuto-specifici

•ETEROCROMATINA FACOLTATIVA -> inattiva quando condensata.

Fornisce un meccanismo di compensazione:

rapporto geni autosomici/geni X-linked

•ETEROCROMATINA COSTITUTIVA ->

sempre inattiva; Localizzata nelle regioni

peri - e centromeriche

CROMATINA

15

I geni mappano tutti in regioni le cui caratteristiche generali possono essere definite inizialmente eucromatiche.

In questa regioni, ancora una volta, agiscono i meccanismi epigenetici per tenerle più o meno aperte e quindi più o meno disponibili ad interagire con i meccanismi di controllo trascrizionale.

Durante il differenziamento alcune di queste regioni possono eterocromatizzare definitivamente.

I meccanismi epigeneticiI meccanismi epigenetici

Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono

direttamente attribuibili alla sequenza del DNA.

16

L’INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X

È UN PROCESSO EPIGENETICO

17

� L’inattivazione del cromosoma X è un processo epigenetico, cioè un processo che influenza l’espressione di geni specifici ed è ereditato dalle cellule figlie senza che avvenga alcuna variazione nella sequenza del DNA.

� L’attività dei geni del cromosoma X nelle femmine dei mammiferi ècontrollata da strutture cromatiniche piuttosto che dalla sequenza nucleotidica del DNA che forma il cromosoma.

� Il cromosoma X inattivato (sia esso Xmaterno o Xpaterno) è mantenuto nello stato di cromosoma inattivo nella progenie che deriva dalle future divisioni cellulari poiché gli istoni, modificati in modo da determinare repressione trascrizionale, sono fedelmente ereditati in questo stato ad ogni divisione della cellula.

18

I meccanismi epigeneticiI meccanismi epigenetici

•Metilazione del DNA

Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della Citosina.

Solo il 3% delle Citosine sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la Citosina della doppietta CpG (dinucleotidecitosina-guanina).

•Modificazioni degli istoni

Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina.

19

Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA

La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La metilazione del DNA èquindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l’inibizione dell’espressione genica a livello trascrizionale.

20

CpG islands sono bersagli di

regolazione

• CpG islands circondano i promotori di geni espressi costitutivamente e sono non-metilate.

• Si trovano anche ai promotori di qualche gene tessuto-regolato.

• Ci sono ~29,000 CpG islands nel genoma umano.

• La metilazione di una CpG island impedisce la attivazione di un promotore.

• La repressione è causata da proteine che si legano alle doppietta CpG metilate.

21

•Nel genoma umano il 56% dei geni sono associati a isole CpG: tutti i geni housekeeping ed il 40% dei geni con espressione tessuto-specifica

•I geni tessuto-specifici sono metilati in CpG nei tessuti dove non sono espressi in quanto i geni metilati sono silenti.

Quali regioni sono bersaglio della metilazione?

(B)

22

Cambiamenti dello stato di metilazione del DNA durante lo sviluppo dei mammiferi

Durante la segmentazione si ha subito una fase didemetilazione, seguita da una metilazione “de novo”dispersa su tutto il genoma, dopo l’impianto.

La metilazione de novo è rara dopo la gastrulazione, ma èstata vista frequentemente durante la stabilizzazionedi colture in vitro e nei tumori.

23

Metilazione del DNA e divisione cellulare

La metilazione del DNA è mantenuta durante la replicazione

24

espressione genica è associata

alla demetilazione

• Demetilazione al 5 ′ del gene ènecessaria per la trascrizione.

25

I residui amminoacidici all’N-terminale di ciascun istone (20-60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma.Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione.

Meccanismi epigenetici: Modificazioni degli Istoni

26

27

Modificazioni degli istoni H3 e H4

�La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata.

�L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmenteattiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG).

� Le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni.

� Il risultato è la condensazione della cromatina.

28

L’acetilazione degli istoni è associata al controllo dell’espressione genica.

Il grado di acetilazione degli istoni regola l’espressione genica.

Gli istoni acetilati hanno un’affinità ridotta per il DNA, quindi la cromatina è più aperta.

La repressione delle sequenze CpG metilate nei promotori è legata a due proteine che si legano a CpG metilati ed attivano la deacetilazione degli istoni.

MeCP1 e MeCP2 (methylated Cpg-binding proteins 1 and 2)

29

L’acetilazione degli istoni è associata al controllo dell’espressione genica

MeCP2 è essenziale per lo sviluppo embrionale e si comporta come repressore funzionale.

MeCP2 silenzia l’espressione di geni mediante il reclutamento dell’attività di HDAC (histone deacetylase) che causa il rimodellamento della cromatina.

La rimozione del gruppo acetile dell’istone 3 lisina 9 (H3-K9) è seguita dalla metilazione che rappresenta il segnale per proteine quali HP1 che causa la condensazione della cromatina

MeCP2 acts as a trascriptional repressor and recruits a corepressor complex

consisting of the tracription factor repressor mSin3A and histone deacetylase.

30

Nelle cellule umane, la proteina HP1 silega alle code dell’istone H3, metilato a livello della lisina 9

99Me Me

HP1

31

Silenziamento del telomero

• I telomeri (e centromeri) sono generalmente nell’eterocromatina. I geni sono silenziati

• Nel telomeri agisce la prot Rap1 che recluta SIR. Sir2 è una deacetilasi, Sir3 e 4 reclutano altri SIR ed espandono il silenziamento

• SIR = Silent Information Regulator

32

Le modificazioni delle code istoniche sono importanti per ilsuccessivo assemblamento di fattori di eterocromatinizzazione.

In lievito, le proteine SIR si leganoalla coda di H4 non acetilata

99Me Me

33

Le proteine eterocromatiniche condensanola fibra di 30nm in una strutturamaggiormente impaccata

34

Le modificazioni delle code istoniche controllano la

condensazione e la funzione della Cromatina

�Le code istoniche sono necessarie affinchè la cromatina possa

condensarsi da una struttura a filo di perle ad una fibra di 30nm.

�Recenti esperimenti indicano che le estrmità N-terminali dell’istone

H4, in particolare la lisina 16, sono elementi cruciali per la formazione

della fibra da 30 nm.

�Le code istoniche sono soggette a modificazioni post-trduzionali

multiple, quali acetilazione, metilazione, fosforilazioe, e ubiquitinazione.

�Una proteina istonica non ha mai tutte queste modificazioni

simultaneamente, ma gli istoni di un singolo nucleosoma possono

contenere diversi tipi di modificazioni.

35

Attivazione per alterazione della struttura della cromatina

L’attivatore recluta:– Istone acetilasi o chromatin remodeling complexes

– Facilita il reclutamento di proteine con bromodomini (es. TFIID)

36

Legame cooperativo degli attivatori

• Gli attivatori agiscono in modo sinergico.

• Ciò può avvenire in diversi modi, e con legami cooperativi

37

Modificazioni covalenti delle code degli istoni

alterano l’accessibilità della cromatina.

Lisine: acetilate o metilate

Serine: fosforilate

Acetilazione: trascrizione attiva

Deacetilazione: trascrizione repressa

Metilazione: sia attivazione che repressione

Proteine con bromodominio riconoscono code

istoniche acetilate

Proteine con cromodominio riconoscono code

istoniche metilate

38

�Il cromodominio HP1 lega la coda N-terminale dell’ istone H3 solo quando

la lisina 9 è trimetilata.

� HP1 contiene un secondo dominio, chiamato dominio cromo-ombra, che

si trova frequentemente in proteine che contengono cromo domini.

� Il dominio cromo-ombra, lega altri domini cromo-ombra ed è per

questo che la cromatina con la lisina 9 di H3 trimetilata tende a

condensarsi per mezzo di HP1.

� Oltre a legare se stesso il dominio cromo –ombra lega l’enzima che

metila la lisina 9 di H3, noto come meliltrasferasi istonica H3K9 (HMT-

H3K9).

39

Gli attivatori alterano la cromatina

• Acetilazione degli istoni e rimodellamento dei nucleosmisono indotti dagli attivatori

40

Acetilazione degli istoni

• L’attivatore lega HAT la cui attività chiama altri attivatori

• Il bromodomain di TFIID riconosce alcune lisine acetilate della coda di H4, che sono associate a regioni della cromatina attive nella trascrizione

41

Caratteristica Cromatina

attiva

Cromatina

inattiva

Conformazione

della cromatina

Estesa, aperta Condensata

Metilazione del

DNA

Poco metilata

specialmente

nelle regioni

del promotore

Metilata

Acetilazione

degli istoni

Istoni acetilati Istoni non

acetilati

CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA

42

Controllo Trascrizionale

Il metodo principale col quale avviene il controllo dell’espressione genica negli eucarioti è una trascrizione selettiva, che si ottiene grazie a specifiche “DNA binding proteins”.

43

LA REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE AVVIENE ATTRAVERSO IL LEGAME DI FATTORI PROTEICI A SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI REGOLAZIONE.

I FATTORI PROTEICI IMPEGNATI A REGOLARE L’ESPRESSIONE GENICA AGISCONO IN TRANS LEGANDOSI ALLE SEQUENZE DI DNA CHE SONO IN PROSSIMITA’ DEL GENE (IN CIS)

REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE

44

Fattori coinvolti in gene expression

• I fattori basali insieme alla RNA polymerase, si legano allo startpoint e TATA box

• Gli Attivatori sono fattori di trascrizione che riconoscono specifici elementi di corte sequenze consenso.

• Si legano a siti nel promotore o negli enhancers.

• Le sequenze che legano vengano chiamate response elements.

• I Coattivatori danno un collegamento tra gli attivatori e l’apparato basale.

• Non legano il DNA• Alcuni regolatori inducono cambiamenti nella cromatina

45

Sinergia nella trascrizione

• Gli attivatori agiscono su molti passaggi diversi e la loro azione è sinergica

46

Attivatori hanno domini di legano il DNA-binding e di attivazione

Le attività DNA-binding e di attivazione della trascrizione sono in domini indipendenti di un attivatore. Il ruolo del dominio DNA-binding è di portare il dominio di attivazione della trascrizione vicino al promotore.

Gal4 regola la trascrizione del gene del galattosio in S. cerevisiae. Si lega a un sito di 17 bp.

Ci sono 4 siti, ciascuno lega un dimero di Gal4, che formano la UASG (Upstream Activating Sequence di Gal)

47

Come fa un attivatore a stimolare la trascrizione

Due modelli generali :• Il modello di reclutamento implica che il solo effetto è di aumentare il legame della RNA polimerase al promotore.

• Un modello alternativo è che esso induca dei cambiamenti conformazionali nel complesso trascrizionale, che ne aumenta l’efficienza.

48

Attivazione per reclutamento

• L’attivatore può legare il mediatore che èassociato alla pol-II o a fattori di trascrizione (TFII-D)

49

• I coattivatori sono fattori di trascrizione la cui specificità èdata dalla capacità di legare DNA-binding transcriptionfactors invece di legare direttamente il DNA.

• Quando un attivatore funziona tramite un coattivatore la connessione prevede legami non covalenti tra le due proteine

I contatti con l’apparato basale

possono essere fatti con ognuno

dei vari fattori basali,

tipicamente TFIID, TFIIB, or

TFIIA.

50

• Tutti i componenti necessari per una trascrizione efficiente:

• basal factors, • RNA polymerase,• activators, • coactivatorsformano un apparato molto grande, di >40 proteine.

• Alcuni attivatori, coattivatori, e fattori basali possono assemblarsi uno dopo l’altro al promotore, ma poi possono unirsi ad un complesso molto grande fatto dalla RNA polimerasi preassemblata con altri attivatori e coattivatori.

51Elementi distali Elementi

prossimali

Promotore basale

• Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi.

• Quindi se la RNA polimerasi potrà iniziare la trascrizione dipenderà anche dal legame di proteineregolatorie, attivatori e repressori.

52

Il promotore del gene umano dell’insulina

Nero: fattori ubiquitariRossi: fattori specifici delle cellule beta pancreatiche

53

Gli attivatori trascrizionali sono proteine modularicomposte da distinti domini funzionali

54

Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a

livello di specifici geni

Importanza della struttura modularee delle interazioni proteina-proteina

55

56

Attività a distanza: anse e isolatori

• Gli enhancers agiscono anche a 100 kb dal gene.

• Essi possono essere portati sul gene dalla formazione di anse e dalla struttura della cromatina

• Gli insulators bloccano l’attivazione promossa dagli enhancers

57

EnhancerUna sequenza enhancer classica contiene al suo interno parecchi elementi di controllo differenti, ognuno dei quali è costituito da una corta sequenza di DNA che funziona da sito di legame per uno specifico fattore di trascrizione regolativo (attivatore).

Spesso i siti di legame possono essere gli stessi presenti nelle sequenze prossimali.

I silencer sono meno abbondanti, legano fattori in grado di ridurre l’efficienza di trascrizione (repressori).

58

L’enhanceosome dell’interferone beta

• IFN-beta è indotto da infezione virale

• Questa causa la sintesi di NFkB, IRF e Jun/ATF

• Questi si legano ad unsito 1 kb upstream il promotore in un complesso cui partecipa HMG, un fattore strutturale

59

Insulators• Gli insulators delimitano un dominio di espressione

• si localizzano preferenzialmente nelle interbande

• possono bloccare il passaggio degli effetti attivanti o disattivanti dagli enhancers, silencers, o LCRs.

• possono agire da barriera contro la propagazione della heterochromatin

60

Insulators e struttura della cromatina

• Forse gli insulatorsagiscono sulla struttura del DNA

• Possono organizzare anse di DNA che limitano le interazioni attivatore-promotore

61

Il cluster dei geni delle beta-globine

• L’espressione dei 5 geni cambia con lo sviluppo

• Tutti i geni sono sotto il controllo di LCR

• LCR controlla la condensazione della cromatina

62

Regioni di controllo: LCR• Il Locus Control Region (LCR) è 30-50 kb a monte dei geni della beta-globina. Regola l’apertura della cromatina per l’accesso dei fattori di regolazione

63

10_23_2.jpgCOMPETIZIONE

l’espressione di alcuni geni (geni umani delle globine) è coordinata da una regione di controllo dominante LCR localizzata a monte dei geni delle globine

64

Le LCR funzionano da enhancer per la trascrizione dei geni globinici

Siti ipersensibili a DNAsi I Eritroide-specifici (enhancer)

Altri siti ipersensibili nella regione dei promotori dei singoli geni -> specificità dello stadio di sviluppo.

Siti ipersensibili del fegato fetale

Siti ipersensibili nel midollo osseo adulto

z2e2, Emoglobina Embrionale (espressione nel sacco vitellino)

a2g2 HbF Emoglobina fetale (espressione nel fegato e nella milza)

a2d2 HbA2 Emoglobina dell’adultoa2b2 HbA

65

Esempio: beta globina• Proteine regolatorie:

• GATA-1 (fattore di trascrizione) è eritroide-specifica

• CP1 (fattore di trascrizione) ubiquitaria

66

Alcune proteine che legano il

promotore sono repressori.

• La repressione solitamente avviene

modificando la struttura della cromatina, ma ci sono repressori che agiscono legandosi a promotori specifici.

• repressori Eucariotici che bloccano la trascrizione sono relativamente rari. Un esempio è il repressore globale NC2/Dr1/DRAP1, un eterodimero che lega TBP(TATA Box-Bindingprotein) per impedirne la interazione con altri componenti del apparato basale

67

Repressori

68

SWI/SNF: (proteine che rimodellano la cromatina)HAT: (histon acetiltransferasi)

Gli attivatori interagiscono con i coattivatori e stimolano il rimodellamento della cromatina e l’acetilazione degli istoni

Un grosso complesso multiproteico, detto mediatore funge da ponte, legando sia le proteine attivatrici, associate all’enhancer, sia la RNA pol., in modo da connettere gli enhancer con i componenti coinvolti nell’inizio della trascrizione genica.

69

� Ciascun elemento presente in un promotore possiede una specifica sequenza

consenso che lega i fattori di attivazione ubiquitari della trascrizione.

� Il legame dei fattori trascrizionali avviene nel sito consenso che include un numero variabile di nucleotidi a seconda del promotore.

� CTF è un membro di una famiglia proteica di fattori trascrizionali� NF-1 è un fattore nucleare-1� SP-1 è un fattore trascrizionale ubiquitario

70

�Gli ormoni lipofili diffondono attraverso la membrana plasmatica, ma

solo nelle cellule bersaglio trovano il loro recettore specifico ad elevata

affinità, con cui si associano.

�Il complesso ormone-recettore va incontro ad una “reazione di

attivazione” temperatura e concentrazione salina dipendente, che ne

determina un cambiamento delle dimensioni, della conformazione e della

carica superficiale che lo rendono capace di legarsi alla cromatina.

�In alcuni casi, come nel caso del recettore per i glucocorticoidi,

l’attivazione provoca la dissociazione del recettore da un’altra proteina

come la proteina 90 da shock termico (HSP 90).

Regolazione della trascrizione da glucocorticoidi

Elementi di Fisiologia – A.A. 2004-2005

SR hsp90hsp90

HSP90 maschera il sito legante il DNA dei Recettori per

gli steroidi

DNA

Elementi di Fisiologia – A.A. 2004-2005

Attivazione della trascrizione genica operata da recettori nucleari per gli ormoni steroidei (ER)

E2

hsp70hsp70 ER

hsp90

hsp50ER

hsp90

hsp50

HAT

TATAERER

ERER

hsp90

hsp50

hsp90

hsp50

hsp70 hsp70Histone-Acetyl-Transferase

73

�Il complessso recettore-ormone si lega a specifici regioni del DNA

(dette elementi di risposta dell’ormone) determinando l’attivazione

oppure l’inattivazione di specifici geni.

�Si ha cosi una selettiva modulazione della trascrizione di particolari

geni e della produzione delle corrispondenti molecole di mRNA, in

questo modo gli ormoni riescono a controllare la sintesi di specifiche

proteine e a influenzare i processi metabolici della cellula.

74

�L’HRE deve associarsi con altri elementi per agire in modo ottimale.

Questi complessi di DNA sono detti unita’ di risposta all’ormone (HRU) .

Quindi una HRU è costituita da una o più HRE e uno o più elementi di DNA

asssociati con fattori accessori.

�La comunicazione tra un HRU e l’apparato trascrizionale di base è resa

possibile dall’intervento di una o piu’ molecole appartenenti a una classe di

coregolatori.

�La prima di queste molecole ad essere stata descritta è la proteina legante

CREB (la proteina legante l’elemento di risposta al cAMP) detta CBP.

75

�CBP attraverso un dominio amminoterminale, lega il residuo fosforilato di

serina 137 di CREB mediante la transattivazione in risposta al cAMP.

�CBP e un’altra proteina strettamente correlata, la P300, interagiscono con

diverse molecole segnalatrici tra cui la proteina attivatrice-1 (AP-1), trasduttori

del segnale, attivatori della trascrizione (STAT), recettori nucleari e CREB.

�E’ importante notare che il complesso CBP/P300 presenta anche un’attivita’

intrinseca istone acetil-transferasica (HAT).

76

�In molti geni regolati dagli ormoni steroidei è stato individuato un

secondo elemento di risposta (HRE) che si trova all’estremita’ 5’ rispetto

all’elemento promotore.

�L’HRE presumibilmente modula la frequenza di inizio della trascrizione

e dipende in misura minore dalla posizione e dall’orientamento. Sembra

che sia simile agli elementi amplificatori della trascrizione presenti in altri

geni.

Regolazione della trascrizione da ormoni

steroidi

77

� Diversi elementi hanno effetti diversi sul livello di trascrizione, alcuni con

effetti maggiori di altri, e alcuni possono anche attivare la risposta tessuto

specifica.

� Il legame dei fattori trascrizionali all’elemento di risposta per gli steroidi,

modula la frequenza di trascrizione del messaggero.

�MyoD è un fattore specifico delle cellule muscolari

�GRE è l’elemento di risposta ai glucocorticoidi

78

Nei recettori steroidei, le regioni di legame per il DNA e quelle di legame per

gli ormoni condividono un alto grado di omologia.

Il recettore per gli estrogeni è meno simile al recettore dei glucocorticoidi di

quanto non lo siano gli altri recettori steroidei.AR=recettore degli androgeni; ER=recettore per gli estrogeni; GR=recettore per i

glucocorticoidi; MR=recettore per i mineralcorticoidi; PR=recettore per il

progesterone.

I numeri indicano il grado di omologia

Somiglianza fra i diversi recettori steroidei

79

A) Motivo helix-turn-helix (elica-giro-elica), consiste di due a eliche separate da un ripiegamento della catena polipeptidica.

Il motivo è sempre lo stesso: una a elica di riconoscimento, che con le catene laterali dei suoi residui amminoacidici riconosce specifiche sequenze di DNA (posizionate nel solco maggiore della doppia elica) alle quali si lega (leg. idrogeno). La seconda a elica stabilizza la conformazione generale.

C) Motivo Zinc finger (a dita di zinco), è constituito da una a elica e da due segmenti a foglietti b, tenuti insieme da residui di cisteina o istidina, posti in modo preciso, con un atomo di zinco .

Il numero di zinc finger varia tra un fattore di trascrizione e un altro. Le strutture zinc finger protrudono dalla superficie della proteina e servono da punto di contatto con specifiche sequenze di DNA posizionate nel solco maggiore della doppia elica.

Come avviene l’interazione DNA-proteine?

Le proteine con DNA bindingdomains hanno dei motivi particolari:

80

Le dita di zinco sono sequenze molto comuni che permettono alla proteina di legare il

DNA a doppio filamento.

X= qualsiasi amminoacido

81

D) Motivo leucine zipper (a cerniera di leucine), èformato dall’interazione di due catene polipeptidiche, ognuna contenente una α elica con residui di leucina (a.a. idrofobico) regolarmente spaziati.

Le leucine, interagendo tra di loro, provocano un attorcigliamento delle due eliche. Il motivo èutilizzato per unire due polipeptidi uguali o diversi. Il legame al DNA è reso possibile dalla presenza di due ulteriori regioni ad α elica che interagiscono con le sequenze del solco maggiore.

E) Motivo helix-loop-helix (elica-ansa-elica), consiste di due αeliche una più piccola e una piùgrande, separate da un’ansa. I motivi helix-loop-helixcontengono regioni idrofobiche che permettono di connettere due polipeptidi uguali o diversi.

La formazione di un fascio di 4 αeliche provoca la giustapposizione dell’elica di riconoscimento di un polipeptide con quella dell’altro, creando così un dominio di legame al DNA bipartito.

82

Il legame dei fattori trascrizionali al DNA coinvolge una piccola

porzione di proteina, la quale entra in contatto con il solco maggiore

e/o solco minore della doppia elica del DNA che deve essere trascritto.

Le cerniere di leucina possiedono sempre dei residui idrofobici di

leucina da un lato dell’elica, che permettono a due cerniere di leucina

d’interagire tra loro attraverso legami idrofobici.

HTL= elica-ansa-elica; HTH= elica-giro-elica

83

Controllo post-trascrizionale

84

L’uso di promotori alternativi, di splicing alternativi, di poliadenilazionialternative e di editing, può dare luogo a isoforme diverse con proprietàdifferenti quali :

•Isoforme tessuto-specifiche. Gene DMD (gene mutato nella distrofia muscolare di

Duchenne) presenta otto promotori diversi a seconda del tessuto, che danno origine a 8 diverse proteine

•Isoforme stadio di sviluppo specifiche

•Isoforme transmembrana o solubili

•Diversa localizzazione cellulare

•Funzione cambiata -> isoforme di fattori trascrizionali che agiscono da attivatori o repressori a seconda dei domini contenuti

Lo splicing alternativo è controllato da proteine che si legano alle molecole di pre-mRNA e fanno in modo che alcuni siti di splicing non vengano utilizzati e altri siano invece attivati.

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Nell’intestino tenue, l’editing del nucleotide 6666 del mRNA di ApoB, cambia una citosina in uracile, converte un codone per la glutammina nel mRNA per ApoB 100 in un codone stop prematuro e quindi produce la proteina troncataApoB 48.

L’editing ( modifica ) dell’RNA del gene APOB nell’uomo genera

trascritti

tessuto-specifici

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Il legame di proteine specifiche all’elemento di risposta per il ferro (IRE) dell’mRNA di un gene che risponde alle variazioni delle concentrazioni di ferro, può alterare in diversi modi la traduzione dell’mRNA in proteine funzionali.Quando si manifesta una carenza di ferro, la proteina che lega l’elemento di risposta al ferro (IRE-BP) è attiva e può legarsi all’estremità 3’ dell’mRNA per il recettore della trasferrina.Questo evento previene la degradazione dell’mRNA e quindi aumenta la quantità di recettore per la trasferrina che può essere sintetizzata (parte sinistra della figura) aumentando di conseguenza la quantità di ferro che il recettore può inviare alla cellula. La IRE-BP lega anche l’estremità 5’ dell’mRNA per la ferritina e blocca la traduzione. La ferritina è una proteina che sequestra e immagazzina nel citoplasma il ferro e risulta meno richiesta in condizione di carenza di ferro.

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�I cromosomi sessuali sono di due tipi, X e Y, con l’X sostanzialmente più grande dell’Y.

�Le femmine possiedono due cromosomi X, mentre i maschi hanno un cromosoma X e uno Y.

�Una regione del cromosoma Y è identica a una regione del cromosoma X, ma il cromosoma X contiene anche geni che non sono presenti sul cromosoma Y, per esempio SRY un gene determinante il sesso.

�Questi geni sono monoallelici e non hanno alcuna possibilità di scelta per quale allele verràscelto.

�Nell’uomo, i geni sono stati identificati come biallelici, ma solo un allele, materno o paterno, èespresso prevalentemente, nonostante entrambi gli alleli siano perfettamente normali e identici.

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�Il risultato è che il 50% dei prodotti genici viene sintetizzato, ma il prodotto èfunzionalmente attivo.

�Quindi, in ogni caso , nelle femmine uno dei due cromosomi X è inattivato durante una fase precoce dell’embriogenesi.

�Il cromosoma X-inattivato può ancora esprimere alcuni geni, incluso l’XIST ( trascritto specifico dell’X inattivato ) il quale codifica per un RNA che gioca un ruolo fondamentale nella inattivazione dell’X.

�Il cromosoma X-inattivato viene riattivato nelle femmine durante l’ovogenesi.

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Controllo della traduzioneControllo della traduzione

La sintesi della globinaLa sintesi della globina nei reticolociti ( globuli rossi immaturi )

procede rapidamente, ma solo se è disponobile eme. eme.

L’inibizione della sintesi della globina avviene a livello

dell’inizio della traduzione.

In assenza di eme i reticolociti accumulano una proteina detta

inibitore regolato dall’eme ( HRI).

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L’ HRI è una chinasi che fosforila un residuo di Ser 51 della

subunità α del fattore eIF2 ( il fattore d’inizio che trasporta GTP e

Met-tRNAimet sul ribosoma).

Il fattore eIF2 fosforilato può partecipare all’inizio della

traduzione così come il fattore eIF2 non fosforilato, ma non è

rigenerato.

Dopo aver completato il processo d’inizio, il fattore IF2 non

modificato scambia il GDP legato con il GTP, in una reazione

innescata da un altro fattore di inizio “eIF2B” .

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L’IF2 fosforilato forma un complesso molto più stabile con il fattore “eIF2B”rispetto a quello formato con il fattore IF2 non foforilato.

Ciò determina il sequestro di “eIF2B”che è presente in quantità inferiori rispetto a eIF2, e impedisce la rigenerazione del complesso eIF2-GTP necessario per la traduzione.

In presenza di eme, i siti di legame dell’eme su HRI sono occupati e la chinasi è inattiva.

Le molecole di eIF2 già fosforilate sono riattivate dalla eIF2 fosfatasi, che non èinfluenzata dall’eme.

Il reticolocita coordina quindi la sua sintesi di globina e di eme.

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Le chinasi ciclina dipendenti regolano la

crescita cellulare

�Le cicline presenti in molti eucarioti, si combinano con una proteina con una massa di 34 kD e formano una proteina chinasi Ser/Thr attiva detta proteina

chinasi ciclina-dipendente (CDK) che per essere attiva può richiedere una sua fosforilazione.

�Il cico cellulare dell’uomo è governato da diverse CDK.

� Esse fosforilano numerose proteine nucleari, tra cui l’istone H1, diverse proteine oncogeniche e proteine coinvolte nell’organizzazione del citoscheletro

e nella disgregazione del nucleo.

�CDK2 nell’uomo è stata determinata in diverse condizioni conformazionali:(1) legata all’ATP

(2) legata all’ATP e al frammento C-terminale della ciclina A

(3) legata all’ATPγS ( un analogo dell’ATP che si idrolizza moltolentamente) e al frammento C-terminale della ciclina A, e con il residuo Thr 160 della CDK2 fosforilato.

93

94

Fattori di trascrizione

95

Fattori di trascrizione

� La trascrizione del gene è iniziata e regolata da numerose e diverse proteine che legano il DNA in maniera sequenza specifica, conosciute col nome di fattori di trascrizione.

� Questi fattori si legano a specifiche sequenze nucleotidiche e producono la differente espressione del gene, non solo durante lo sviluppo, ma anche all’interno dei tessuti e dell’organo adulto.

� Molti fattori trascrizionali agiscono in maniera positiva, promuovendo la trascrizione, mentre altri agiscono in maniera negativa promuovendo la repressione.

� I fattori di trascrizione qualche volta vengono chiamati fattori trans-agenti,

per enfatizzare che, come proteine solubili, essi possono diffondere all’interno del nucleo e agire su più geni diversi localizzati su cromosomi diversi.

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Modello d’azione dei fattori di trascrizione

�T1, T2, T3, T4, si legano alle loro sequenze di DNA bersaglio e contemporaneamente in gruppi di due mediante interazioni relativamente non specifiche al complesso di pre-inizio (PIC).

�L’interazione fattore di trascrizione-PIC inizialmente debole, si rafforza consentendo alla RNA polimerasi di attaccarsi al PIC e di iniziare la trascrizione.

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Struttura a raggi X del complesso CDK2-

ciclina A-ATPγγγγS, in cui la CDK2 è fosforilata

a livello del residuo di Thr 160

Il ciclo cellulare degli eucarioti

La progressione delle cellule nel ciclo è determinata da modificazioni covalenti quali aggiunta o eliminazioni di gruppi fosfato.

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Alcune forme di cancro derivano dalla soppressione dei repressori

dei tumori

�Uno dei bersagli delle CDK è la proteina del retinoblastoma (Rb), che inibisce la crescita cellulare bloccando la funzione del fattore di trascrizione E2F.

�Questo fattore attiva i geni che innescano la proliferazione cellulare, compresi quelle delle cicline.

�La fosforilazione della proteina Rb da parte di CDK blocca l’attivitàantiproliferativa di Rb . La proteina Rb è nota come soppressore di tumori, in quanto la sua assenza può portare al retinoblastoma ( un cancro della retina) e altri tipi di tumori.

�L’attività di E2F è anch‘essa inibita dalla fosforilazione catalizzata da alcune forme di CDK.

� Il fattore di trascrizione e soppressore di tumori p53 viene attivato, a differenza di E2F, dalla fosforilazione catalizata da CDK. La proteina p53

fosforilata si lega a specifici geni e agisce come un potente fattore di trascrizione.

�Nel 50% di tipi di cancro dell’uomo sono presenti mutazioni della proteina

p53.

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Struttura ai raggi X del dominio che lega il DNA della proteina p53 dell’uomo

unita al suo DNA bersaglio

Alcune forme di cancro derivano dalla soppressione

dei repressori di tumori

100

FINE