Lezione 3

Applicazioni delle colture cellulari

Cos’è un tumore ? Una proliferazione incontrollata di cellule atipiche

Conseguenza di un’alterazione a livello del codice genetico

Differenza tra le cellule normali e quelle tumorali

Aspetto istologicamente diverso

Funzione afinalistica

Comportamento moltiplicazione indefinita, infiltrazione tessuti circostanti, ripetizione a distanza (metastasi), cachessia neoplastica.

Carcinogenesi Danni ripetuti e molteplici che colpiscono la cellula, se la cellula non è in grado di riparare il danno può insorgere un tumore maligno

Interazioni complesse tra agenti cancerogeni, suscettibilità individuale e diminuzione delle difese organiche

La possibilità di individuare tali mutazioni in anticipo consente di prevenire il cancro

I 15 tipi di tumore più diffusi al mondo nei maschi

I 15 tipi di tumore più diffusi nel mondo nelle donne

Fattori di rischio

1.Fattori di rischio generali2. Fattori di rischio specifici

Fattori di rischioTra i fattori di rischio generali:1. Età (il rischio aumenta con l’età)

2. Razza

3. Sesso (ormoni)

4. Geografia

5. Dieta

6. Familiarità (genetici)

7. Ambiente

Fattori di rischio specifici1. Virus2. Batteri3. Radiazioni ionizzanti4. Fumo (tabacco)5. Alcol6. Intossicazioni

Si stima che il 70% dei tumori potrebbe essere evitato.

Il fenotipo morfologico di una cellula maligna è quello di una cellula

diversa, ma non totalmente diversa o aberrante; la microscopia elettronica non è riuscita a dimostrare differenze

eclatanti, se non la occasionale presenza di virus.

La cellula neoplastica

Il fenotipo maligno può essere caratterizzato da:1)Comportamento in colturaImmortalità: crescono in modo indefinito in netto contrasto con le cellule normali che possono replicarsi esclusivamente un numero finito e definito di volte-numero di Hayflick. Perdita della dipendenza dall’ancoraggio: le cellule normali crescono se ancorate ad una superficie; le cellule trasformate crescono bene anche in un mezzo semifluido come l’agar mollePerdita della inibizione da contatto: le cellule normali crescono fino a formare un monostrato compatto. Le cellule trasformate continuano a crescere le une sulle altre in maniera del tutto disordinataDiminuita necessità di fattori di crescita: generalmente se li producono da sole

I meccanismi della invasione locale Quasi tutti i tumori benigni si accrescono come masse coese che si espandono (spesso incapsulati) La crescita delle neoplasie maligne, invece, si accompagna ad una progressiva infiltrazione, invasione e distruzione del tessuto circostante I carcinomi in situ mostrano le caratteristiche citologiche di malignità fatta eccezione per l’invasione della membrana basale Dopo la capacità di dare metastasi, l’invasività è la più tipica delle caratteristiche che differenziano i tumori maligni da quelli benigni

I meccanismi della metastasi Le metastasi identificano in modo inequivocabile un tumore come maligno,in quanto le neoplasie benigne non danno metastasi Con poche eccezioni, tutti i cancri possono metastatizzare (gliomi, carcinoma basocellulare della cute, altamente invasivi ma non metastatizzano) In generale, più il tumore è aggressivo, cresce rapidamente e presenta elevate dimensioni, più è probabile che metastatizzi o che abbia già metastatizzato

Esistono però numerose eccezioni. Talvolta tumori piccoli, ben differenziati e a lenta crescita danno metastasi diffuse, mentre tumori che crescono rapidamente possono rimanere localizzati per anni

Sedi di impianto delle metastasiSede del tumore primario Sede di impianto delle metastasiMammella e prostata ossaPolmone Ogni distretto, encefalo compresoColon-retto Fegato-polmoneTesticolo Polmone, fegatoOvaio Cavità addominale, peritoneo e diaframma

La valutazione della potenziale cancerogenicità di agenti per l’uomo avviene attraverso diversi tipi di studi:

• Epidemiologici - Si indaga su popolazioni esposte in confronto con gruppi di controllo sicuramente non esposti, o con indici medi della popolazione. Questi studi spesso non portano a conclusioni statisticamente certe e anche quando non emergono differenze tra esposti e non esposti, non possono escludere che la sostanza indagata sia effettivamente cancerogena, ma semplicemente che non è stata rilevata una differenza significativa di rischio di cancro tra il gruppo degli esposti e i termini di riferimento.

• Sperimentali - Si tratta del risultato di studi effettuati su animali da laboratorio e/o in vitro, con metodiche molto diverse, che hanno comunque come risultato una osservazione di casi di tumore su un gruppo di cavie o cellule in vitro esposte in confronto con un gruppo di cavie dello stesso tipo non esposte.

In vitro studies of asbestiform fibrous minerals related to the

development of lung disease and cancer

Asbestosinorganic mineral silicates

properties

high tensile strength heat resistance

sub-grouped

serpentine amphibolecrysotile amosite

crocidoliteanthophillitetremoliteactinolite

Le fibre minerali naturaliDecreto legislativo

n. 257 del 25 luglio 2006

AmphiboleAmphibole

SerpentineSerpentine

AnthophylliteAnthophyllite AmositeAmosite TremoliteTremolite

ActinoliteActinolite CrocidoliteCrocidolite

ChrysotileChrysotile

Utilizzo delle fibre

Harmful effects of asbestos fibers

Patologie legate all’amianto

Placche pleuriche

Asbestosi

Carcinoma polmonare

Mesotelioma

Fibre di amianto

Over the last few years, the awareness of possible health hazards not related to professional exposure to

asbestos, but related instead to the back ground of such fibers generated both natural and anthropic events, has

been increasing.

CASES OF ENVIRONMENTAL POLLUTION BY MINERAL FIBERS NOT CLASSIFIED AS ASBESTOS ARE BECOMING MORE FREQUENT, IN ITALY AND

FOREINGN COUNTRIES, AND NATURAL AND SYNTHETIC FIBERS ARE BECOMING A GROUP OF

SUBSTANCES OF POTENTIAL TOXICOLOGICAL AND PUBLIC HEALTH CONCERN.

500 MINERAL SPECIES

low levels of cytotoxicity

high levels of cytotoxicity

causing a wide variety of

respiratory diseases ranging

from inflammation and fibrosis to

cancer

THE RISK OF DEVELOPING BREATHABLE MINERAL-RELATED LUNG DISEASES OR

CANCER VARIES BETWEEN FIBRE TYPES, BECAUSE OF THE VARIOUS PHYSIOCHEMICAL

PROPERTIES:

• fibre dimensions• fibre structure• surface charge• ability to generate reactive oxygen species• biopersistance

UNDERSTANDING how asbestos-like fibers interact with target cells of diseases (i.e. epithelial, mesothelial, macrophage and fibroblastic cells) how these events contribute to the pathogenesis of diseases

are critical to designing preventive and therapeutic approaches to lung and pleural

disorders

In an epidemiological study on mortality from malignant pleural neoplasms in Italy, it was

found that some subjects who resided in Biancavilla were diagnosed with malignant

pleural mesothelioma.These residents had never any relevant

exposure to asbestos during their professional life.

A possible cause for fibrous mineral exposure of Biancavilla population was the stone

quarries present in Monte Calvario.The materials extracted from the quarries are widely used in the local building industry and contain large quantities of fibrous amphibole.

FLUORO–EDENITE Approvazione CNMMN dell’IMA come nuovo anfibolo approvato in data 31/01/2000 con il numero 2000/49

Il caso Biancavilla

Fluoro-edenite prismatica

Formula idealeNaCa2Mg5(Si7Al)O22F2

BIANCAVILLA(SICILY, ITALY)

Il “caso Biancavilla”

Cava di Monte Calvario (Biancavilla, CT)

Biancavilla (CT)

Visione satellitare Sicilia

The quarries of Monte Calvario

Monte Calvario

Biancavilla

Fluoro-Fluoro-edeniteedenite

Ideal formula: NaCa2Mg5(Si7Al)O22F2

Length of the fibres: 12-40 m

Diameters of the fibres: 0.4-1 m

Fluoro-edeniteprismatica

asbestiforme

Fluoro-edenite del Monte Calvario

aciculare

Cytological examination

WESTERN ALPS (PIEMONTE, ITALY)

In the veins of serpentine rocks, the asbestiform minerals, carlosturanite, balangeroite, antigorite, diopside, olivine,

brugnatellite, brucite and the crysotile, tremolite, and actinolite asbestos were found, probably involved in lung

disease risk or development.

The harmfulness of chrysotile is known, whereas nothing is recognized about fibrous

antigorite, that has very similar chemical composition to chrysotile

but fairly different in atomic arrangements.

Balangero (Turin)

BalangeroiteBalangeroite

AIMS to understand how asbestos-like fluoro-edenite and/or antigorite fibres interact with target cells of lung diseases

to understand how these events contribute to the pathogenesis of fibre-associated and malignant diseases

to evaluate the possible use of some parameters as a biomarker of fibrous minerals exposure

Fluoro-edenite5, 50 and 100 µg/ml

24, 48 and 72 hrs

Human lung fibroblasts

Mouse monocyte-macrophage J774

Human alveolar epithelial A549

chemical formula [(Na0.307K0.157)0.464(Ca1.505Na0.495)2.000(VIAl0.104Fe3

+0.333Fe2+

0.162Mg4.255Ti0.062Mn0.063)4.980(Si7.520IVAl0.4

80)8.000O22(F1.970Cl0.020)1.990]

Examined biofunctional parameters

cell viability

cytotoxicity

oxidative stress

DNA damage

MTT test

LDH determination

ROS determinationNO•

determinationCOMET test

MTTE’ un saggio colorimetrico che sfrutta la capacità delle

deidrogenasi mitocondriali di scindere l’anello tetrazolico della molecola di MTT (sale di tetrazolio) di colore giallo per

dare un sale di formazano violetto. La quantità di formazano prodotta viene misurata allo spettrofotometro

ed è proporzionale al numero di cellule vive.

Per poter eseguire il saggio le cellule vengono cresciute su di una piastra multi-pozzetto e trattate con concentrazioni crescenti della sostanza da analizzare in triplicato per un

tempo predeterminato. Al termine del trattamento, la soluzione contenente l’MTT viene aggiunta alle cellule.

Dopo circa tre ore, tempo necessario affinché si formi il sale di formazano, viene misurata l’assorbanza a 550 nm. I dati così ottenuti vengono normalizzati rispetto al controllo ed

utilizzati per costruire le curve dose-risposta.

NN +

NN

S

N

C H3

C H3

N

NN

N H

S

NC H3

C H3

NADH

NAD+

MTT (sale di tetrazolio)

Formazano

Saggio colorimetrico basato sul reagente MTT

•Assorbimento delle molecole di MTT da parte delle cellule in esame

•Metabolizzazione dell’MTT a livello mitocondriale da parte degli enzimi deidrogenasi dipendenti da NADH

•Formazione e precipitazione dei cristalli di Formazano che sono insolubili in soluzioni acquose

Sospensione cellulare +

MTTIncubazione

(3 – 4 ore) a 37° C

Misurazione dell’assorbanza

dei campioni tramite ELISA Reader con

filtro da 550 nm

Solubilizzazione dei sali di formazano

tramite Isopropanolo

0,1N HCl o DMSO

SAGGIO MTT

Test di citotossicità: saggio MTTCOLTURA

CELLULARE+ MTT

INCUBAZIONE (3 – 4 h) a 37°C

METABOLIZZAZIONE DEI SALI DI

TETRAZOLIO

LETTURA SPETTRO-

FOTOMETRICA

2) Nelle cellule attive metabolicamente il sale di colore giallo è ridotto a cristalli insolubili di colore blu

3) Il valore dell’ assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di cellule vitali

1) Aggiunta del sale di tetrazolio alle cellule trattate

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Control5 μg/ml FE50 μg/ml FE100 μg/ml FE5 μg/ml Croc.50 μg/ml Croc.100 μg/ml Croc.

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Control5 μg/ml FE50 μg/ml FE 100 μg/ml FE 5 μg/ml Croc.50 μg/ml Croc. 100 μg/ml Croc.

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Control5 μg/ml FE50 μg/ml FE100 μg/ml FE5 μg/ml Croc. 50 μg/ml Croc. 100 μg/ml Croc.

Fibroblasts Fibroblasts

MTT assay

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Monocyte-macrophage J774Monocyte-macrophage J774

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Control5 μg/ml FE50 μg/ml FE100 μg/ml FE5 μg/ml Croc.50 μg/m Croc.100 μg/ml Croc.

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Alveolar epithelial A549Alveolar epithelial A549

Determinazione della lattico deidrogenasi

La quantità di lattico deidrogenasi (LDH), rilasciata nel terreno di coltura, rispetto alla

quantità di LDH totale, è misurata spettrofotometricamente nelle cellule di

controllo e in quelle trattate ad una lunghezza d’onda di 340 nm, analizzando l’ossidazione del

NADH durante la trasformazione del lattato-piruvato

Ossidazione del NADH durante la trasformazione lattato-piruvato

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Fibroblasts Fibroblasts

LDH releaseLDH release


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Lo stress ossidativo costituisce uno dei fattori di rischio emergenti per la salute;

non esibisce una propria sintomatologia; non dà luogo ad un vero e proprio quadro clinico; non fornisce al medico elementi tali da suggerire un adeguato approfondimento diagnostico. Il medico, per una serie di ragioni, non sempre è informato sull’argomento; l’analista di laboratorio non è generalmente attrezzato per l’esecuzione di test mirati alla valutazione dello stress ossidativo.

Lo stress ossidativo

è una condizione patologica che viene a determinarsi nell’organismo umano

quando la produzione di specie chimiche reattive non è più

adeguatamente controllata dai sistemi di difesa antiossidanti.

I radicali liberisono atomi o raggruppamenti di atomi aventi in uno degli orbitali esterni delle

specie che li costituiscono uno o più elettroni spaiati, indipendentemente dalla

carica espressa.

Vengono classificati sulla base della natura dell’atomo al quale appartiene l’orbitale con

l’elettrone spaiato.

Specie chimiche radicaliche

I radicali liberi, al contrario degli atomi, possiedono sempre elettroni spaiati

Radicali liberi dell’ossigeno (instabili)

Il radicale idrossile (HO.) Un elettrone spaiato

O H

L’atomo di O Due elettroni spaiati

O

L’atomo di NeSolo elettroni appaiati

Ne

Atomo (stabile)

sono responsabili della lipoperossidazione e di alterazioni aspecifiche della permeabilità delle membrane plasmatiche; possono reagire con le

proteine denaturandole ed anche intercalarsi con gli acidi nucleici

Anione superossido

cancerogenesi

http://it.wikipedia.org/wiki/Immagine:Superoxide.svg

Specie reattive dell’ossigeno (ROS)

endogeni generati nel corso della normale attività metabolica cellulare, esogeni generati da agenti (fisici, chimici e biologici).

Specie reattive dell’azoto (RNS)

di maggiore rilevanza biomedica comprendono varietà sia radicaliche (ossido nitrico, NO* e

biossido nitrico, NO2*) che non radicaliche (acido nitroso, HNO2 e perossinitrito).

Anione perossinitrito

H2O2 + NO2- → ONOO- + H2O

http://it.wikipedia.org/wiki/Immagine:Peroxynitrite-ion-2D.png

Sintesi schematica dell’ossido nitrico a partire dalla L-arginina

(NOS, ossido nitrico sintetasi, ONOO-, perossinitrito)

Biodisponibilità dell’ossido nitrico e malattie

Diverse specie chimiche reattive sono implicate nella patogenesi dello STRESS OSSIDATIVO

Le specie reattive di rilevante interesse biologico sono centrate su pochi elementi (O, N, C, Cl, S)

Non radicaleHOClOAcido ipocloroso

Radicale-STiile

Non radicaleROONO(Alchil)perossinitrito

Non radicaleNO2+Catione nitronio

Non radicaleONOOHAcido perossinitroso

Non radicaleONOO-Perossinitrito

Non radicaleN2O3Triossido nitrico

Non radicaleN2O4Tetrossido nitrico

Non radicaleHNO2Acido nitroso

RadicaleNOOssido nitricoNon radicaleO3Ozono

RadicaleE-OFenossile (dalla vitamina E)

RadicaleQSemichinone (dal Coenz. Q)

Non radicaleROOH(Alchil)idroperossido

RadicaleROO(Alchill-)perossil radicale

RadicaleRRadicale alchilico

RadicaleHORadicale ossidrile

Non radicaleH2O2Perossido di idrogeno

Radicale (?)1O2*Ossigeno singoletto

RadicaleO2Anione superossido

ClasseFormulaSpecie chimica ClasseFormulaSpecie chimica

Un organismo umano di 70 kg utilizza normalmente 3,5 ml di ossigeno al minuto per kg

di peso e se si assume che circa l’1% dell’ossigeno viene convertito a radicale

superossido, vengono prodotti circa 1,72 kg di radicale superossido all’anno.

Per ogni 1012 molecole di ossigeno che entrano nella cellula ogni giorno 1/100 danneggia proteine

1/200 il DNA.

Le specie reattive più conosciute

- O2·- anione superossido: prodotto da cellule del sistema immunitario

che aggrediscono i microrganismi e nel corso del normale metabolismo cellulare; gioca un ruolo cruciale nella formazione di altre specie radicaliche come il perossido di idrogeno, il radicale idrossile, l’ossigeno singoletto;- OH· radicale idrossile: possiede il più elevato potenziale di elettro-riduzione (2310 mV) ed è in grado di attaccare tutte le strutture biochimiche basilari come lipidi, polipeptidi, proteine e le basi del DNA;- 1O2 ossigeno singoletto coinvolto nell’ossidazione del colesterolo;- ROO· radicale perossile: possiede un elevato potenziale standard di riduzione (> 1000 mV) ed è coinvolto nella fasi di propagazione delle reazioni a catena radicaliche di perossidazione lipidica;- LOO· radicale lipoperossido: prodotto dell’ossidazione lipidica;- NO2

·- biossido di azoto radicale anione: può innescare reazioni di perossidazione lipidica;- OONO- perossinitrito: causa ossidazione diretta di proteine e del DNA;- H2O2 perossido d’idrogeno o acqua ossigenata: chimicamente non rappresenta un radicale libero, e sebbene non possegga un potenziale di pericolosità al pari di altre specie radicaliche può, nondimeno, causare un danneggiamento ossidativo nelle cellule.

L’acqua ossigenata è una specie dannosa in quanto è capace di ossidare composti

sulfidrici come i residui di metionina nelle proteine e, a concentrazioni basse, può portare alla lisi degli eritrociti umani. La pericolosità dell’acqua ossigenata non è

dovuta ad un suo attacco diretto a livello dei componenti cellulari, bensì all’interazione con le forme ridotte di alcuni metallo-ioni

come il ferro bivalente o il rame monovalente, che porta alla formazione

dell’idrossi radicale e dello ione ossidrilico. Reazione di Fenton

Step nelle reazioni radicaliche a catena:

1.inizio: scissione omolitica (divisione di una molecola a livello di uno dei suoi legami covalenti per effetto della somministrazione di energia per es. termica o radiante con generazione di due nuove specie chimiche, ciascuna con un elettrone spaiato), interazione con i metalli di transizione (l’elettrone generato dall’ossidazione di un metallo di transizione in forma ionica, per es. Fe2+ a Fe3+ o da Cu+ a Cu2+, spezza un legame covalente di una molecola bersaglio, generando così un radicale libero ed un anione) o decomposizione degli azocomposti;

2.propagazione: trasferimento, addizione, frammentazione o riarragiamento;

3.termine: combinazione o disproporzione.

Fonti metaboliche primarie di radicali liberi:

la membrana plasmatica; i mitocondri; i perossisomi; il reticolo endoplasmatico liscio

(microsomi); il citosol.

possono essere classificati secondo diversi criteri:

sulla base dell’origine in endogeni ed esogeni;sulla base della natura chimica in enzimatici e non enzimatici;sulla base della solubilità in liposolubili ed idrosolubili;sulla base del meccanismo di azione prevalente in antiossidanti preventivi, scavenger, agenti di riparo e agenti di adattamento.

Gli antiossidanti

Meccanismo d’azione degli antiossidanti

Antiossidanti preventivi

Bloccano la formazione dei radicali

Antiossidanti scavenger

Bloccano la reazione di inizio

Bloccano la reazione di propagazione

Riparano il danno e ricostituiscono le membrane

Antiossidanti di riparo e de novo

Inquinanti, fumo, radiazioni, metalli pesanti,farmaci, alcool, ischemia-riperfusione, …

Specie Chimiche Reattive

Attacco di biomolecole(glicidi, lipidi, proteine,

ecc)

Reazioni radicaliche a catena

Danno ossidativo

Invecchiamento, malattie

Il sistema di difesa antiossidanteè regolarmente distribuito nell’organismo sia a livello extracellulare che a livello intracellulare.

Enzimi antiossidanti

Superossido dismutasiCatalasiGlutatione PerossidasiGlutatione Transferasi

Molecole antiossidanti

Vitamina EVitamina CCoenzima Q10Acido uricoCarotenoidiGlutatione

Il potenziale di riduzione è una misura della reattività di un antiossidante come

donatore di idrogeno o di elettroni in condizioni standard

Potenziali di riduzione di alcuni polifenoli e antiossidanti naturali della dieta

Antiossidante Potenziale di riduzione*(mV)

Ascorbato (vitamina C)Epigallocatechina gallato-tocoferolo (vitamina E)TeaflavinaAcido caffeicoepicatechina

282430500510540570

*potenziali di riduzione standard a pH 7, 20°C

Cause di aumentata produzione di specie reattive

Fattori ambientali (radiazioni, inquinamento)

Stati fisiologici (gravidanza)

Stile di vita (alimentazione, alcool, fumo di sigaretta, esercizio incongruo)

Fattori psicologici (stress psico-emotivo?)

Malattie (traumi, infiammazioni, infezioni, patologie da ischemia-riperfusione, neoplasie)

Fattori iatrogeni (farmacoterapia, radioterapia, raggi X)

Cause di riduzione delle difese antiossidanti

Fattori genetici

Fattori ambientali

Ridotta assunzione di antiossidanti (ipovitaminosi, diete monotone, sindromi da malassorbimento, malattia celiaca)

Ridotta capacità di utilizzazione di antiossidanti (deficit dei meccanismi di captazione o di trasporto)

Fattori iatrogeni (assunzione di farmaci)

OssidantOssidantii AntiossidanAntiossidantiti

Stress ossidativoPossiamo quindi definire lo stress ossidativo come una particolare forma di stress chimico indotto dalla presenza di una quantità eccessiva di specie reattive per un’aumentata produzione delle

stesse e/o per una ridotta capacità di smaltirne le quantità.

Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi proossidanti e processi antiossidanti

Le specie chimiche reattive possono essere sia la causa che l’effetto dello STRESS OSSIDATIVO

Specie reattive Difese antiossidanti

Radiazioni, farmaci, metalli pesantiFumo di sigaretta, alcool, inquinamentoEsercizio fisico inadeguato, sedentarietàInfezioni ed altre malattie

Ridotta assunzione e/o diminuita sintesie/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti

Danno cellulare

Invecchiamento precoce

Malattie cardiovascolari

Altre malattie

Demenza, M. di Parkinson

Infiammazioni,tumori

Danno tissutaleDanno d’organo

Danno sistemico

L’organizzazione mondiale della Sanità raccomanda una dieta con

cinque pasti giornalieri, che comprende:

•15% proteine•60% carboidrati•25% lipidi

ROSspecie reattive dell’ossigeno

DCFH-DA diffuses through the cell membrane and is enzymaticallyhydrolyzed by intracellular esterases to monofluorescent

DCFH in the presence of ROS. The intensity of fluorescenceis parallel to the levels of intracellular ROS.


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otei

n

Control5 μg/ml FE 50 μg/ml FE 100 μg/ml FE 5 μg/ml Croc. 50 μg/ml Croc. 100 μg/ml Croc.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

I.F./m

g pr

otei

n

Control5 μg/ml FE 50 μg/ml FE 100 μg/ml FE 5 μg/ml Croc. 50 μg/ml Croc. 100 μg/ml Croc.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

I.F./m

g pr

otei

n

Control5 μg/ml FE 50 μg/ml FE 100 μg/ml FE5 μg/ml Croc. 50 μg/ml Croc. 100 μg/ml Croc.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

I.F./m

g pr

otei

n


0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

I.F./m

g pr

otei

n



FibroblastsFibroblasts

ROSROS determination determination

Analisi colorimetrica dei nitritiLa determinazione dei nitriti è eseguita con il metodo spettrofotometrico al reattivo di Griess, metodo molto sensibile, capace di rivelare piccole quantità di nitriti.

Lo ione NO2- può essere determinato per via fotometrica,

poiché reagendo con il reattivo di Griess, forma un azocomposto che mostra estese coniugazioni e pertanto assorbe nel visibile, presentando un massimo di assorbimento a 520 nm.

In ambiente acido lo ione nitrito viene fatto reagire con il reattivo di Griess, formato da una miscela di acido Solfanilico (oppure Solfanilammide) e N-(1-naftil)-etilendiammina.La solfanilammide in ambiente acido viene diazotata dallo ione nitrito.Successivamente il diazocomposto viene copulato con la N-(1-naftil)-etilendiammina formando un colorante azoico che presenta un massimo di assorbimento intorno a 520 nm.

Determinazione dei nitriti

Fluoro-edenite5, 50 and 100 µg/ml 96 ore

Monocyte-macrophage J774

Griess assay Immunocytochemistry

0

0,51

1,52

2,5

Opt

ical

Den

sity

Control

FE 50 µg/ml

FE 100 µg/ml

**

FE 100 µg/mlFE 100 µg/ml

ControlControl

FE 50 µg/mlFE 50 µg/ml

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

NO

(µM

)

ControlFE 50 µg/mlFE 100 µg/ml *

*

NO• production on J774 treated with fluoro-edenite for 96 hrs

iNOS expression on J774 treated with fluoro-edenite for

96 hrs

Nel 1984 Ostling e Johanson furono i primi a sviluppare un metodo per l’indagine al fine di

rilevare i danni indotti al DNA su singole cellule utilizzando l’elettroforesi su gel di agarosio.

Questa tecnica che prende il nome di elettroforesi su gel a singola cellula (SCGE) o

più comunemente Comet Assay (test della cometa), permette lo studio del danno primario al

DNA rilevato come rotture a singolo o doppio filamento, siti alcalo-labili e cross-link in cellule

eucariotiche in vitro e in vivo in diversi tessuti di diversi organismi (uomo e roditori, pesci,

molluschi, uccelli, organismi vegetali, etc…).

Elettroforesi E’ una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente

cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le

particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa; nel primo caso il processo è detto cataforesi, nel secondo

anaforesi.

L’ elettroforesi è senza dubbio una delle tecniche maggiormente utilizzate nei laboratori di biologia molecolare, che permette la separazione la visualizzazione e la purificazione di molecole di interesse biologico quali acidi nucleici e proteine.

Tale separazione è resa possibile e dal peso molecolare e dalla carica elettrica di cui sono dotate le particelle, ioni o macromolecole.

Tali particelle poste in un campo elettrico generatosi dalla d.d.p. applicata a due elettrodi, si muoveranno in direzione dell'elettrodo di carica opposta, quelle cariche positivamente verso il polo negativo e viceversa.Gli acidi nucleici migrano sempre verso il polo positivo per la presenza nella loro molecola di

cariche negative dei gruppi fosfato (PO4-- ).

L’elettroforesi può avvenire su vari supporti

Quelli maggiormente utilizzati sono:

1- Carta (elettroforesi delle globuline del sangue)

2- Fase liquida (all’interno di capillari)

3- Gel

ELETTROFORESI SU GELSupporto elettivo nei laboratori di biologia molecolare è costituito dal gel, che rispetto agli altri supporti presenta diversi vantaggi:

1)il gel non contiene cariche in quanto non sono presenti gruppi ionizzanti;

2) è possibile avere gel con maglie di grandezza variabile (in base alla concentrazione della matrice da usare), per tale motivo si effettua una separazione non solo in base alla carica ma anche in base al peso molecolare;

3) si possono facilmente recuperare i campioni dopo la separazione elettroforetica.

I gel maggiormente utilizzati nei laboratori di biologia molecolare sono costituiti da :- poliacrilamide (PAGE),- agarosio.

Usualmente per la separazione di molecole :

-a più basso peso molecolare si usa come supporto del gel l'acrilamide (<500 bp)

-a più alto peso molecolare si usa come supporto l'agarosio (da 500 bp a 20 Kb)

I gel possono essere neutri o denaturanti a seconda che essi permettano la migrazione di doppie o singole eliche.La denaturazione è di solito permessa grazie all'aggiunta di agenti quali la formamide, urea, ecc.

% DEL GEL RISOLUZIONE KB 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2

In entrambi i supporti acrilamide o agarosio, si assembla il sistema su un apparecchio per elettroforesi o CELLA ELETTROFORETICA.

Esistono in commercio un gran numero e modelli di celle elettroforetiche, di varia:- forma- grandezza- verticali- orizzontali

VERTICALE

ORIZZONTALE

Il sistema è collegato ad un alimentatore in grado di creare il campo elettrico.Grazie al campo elettrico generatosi la miscela di frammenti comincerà a migrare verso il polo positivo in base al loro diverso peso molecolare:quelle più pesanti (a maggior PM) migreranno più lentamente rispetto a quelle più leggere (a minor PM), che a loro volta migreranno più velocemente.

Il risultato della corsa elettroforetica consisterà in una serie di bande.

Sul gel si depone anche una miscela di frammenti a PM noto (MARKER) che servirà per il calcolo della lunghezza in basi delle

bande incognite.

DNA

Elettroforesi di DNA

I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammideI campioni di DNA vengono caricati ed e’ applicata una differenza di potenzialeIl DNA, carico negativamente, migra verso l’elettrodo “+”I frammenti di DNA piu’ piccoli migrano piu’ velocemente

Elettroforesi di Proteine

• Piu’ complessa dell’elettroforesi di DNA– Proteine diverse hanno cariche

diverse– Le proteine variano molto per forma

• Generalmente il gel e’ di poliacrilammide

Perche’ usare gel di poliacrilammide per separare le

proteine? • I gel di poliacrilammide hanno una trama piu’

compatta

• I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio

• Le proteine sono molto piu’ piccole del DNA– Amminoacido medio = 110 Da– Paio di nucleotidi medio = 649 Da

– 1 kilobase di DNA = 650 kDa– 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa

Southern blot: per l’analisi del DNA. (sonda = DNA o RNA).

Northern blot: per l’analisi dell’RNA. (sonda = DNA o RNA).

Western blot: per l’analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=saggio%2Bcomet&source=images&cd=&cad=rja&docid=RxaEw5vYbZY0mM&tbnid=DQhSyk0KBjsV8M:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fhost.uniroma3.it%2Fdocenti%2Fcozzi%2Fcitogen.html&ei=_6vCUe3jDcO-PeWRgOgL&bvm=bv.48175248,d.ZWU&psig=AFQjCNFDNUjKFC4i-zYTA4Y_dBEX1PTxbQ&ust=1371798778912037

Comet test o elettroforesi su gel di agarosio di una singola

cellula

danno al DNA,

apoptosi,

riparazione del DNA.

Biomarker per lo stress ossidativo

L’estrema sensibilità del Comet assay e la capacità che ha di

misurare il danno al DNA a livello di ciascuna cellula, lo hanno reso uno strumento mediante il quale risulta estremamente rapida la valutazione della genotossicità di agenti fisici o chimici. La capacità di registrare il

danno in un numero alto di cellule dà forza statistica al metodo e, allo

stesso tempo, permette di rilevare l’eterogeneità di risposta in una

popolazione di cellule.

Il Comet assay si basa sulla capacità del DNA di migrare, in presenza di un

campo elettrico, fuori dalla cellula. Il DNA di cellule danneggiate, visualizzato

al microscopio, appare come una cometa con la testa (regione nucleare) e una coda determinata dai frammenti

o filamenti di DNA che migrano più velocemente nella direzione dell’anodo;

il DNA non danneggiato migra invece molto poco e rimane prevalentemente

ai confini del nucleo.

Il Comet assay si articola in diverse fasi principali:

Preparazione delle cellule su vetrini da microscopia immerse in agarosio Lisi delle cellule per rompere le membrane e liberare il DNA “Unwinding” del DNA (srotolamento del DNA) tramite buffer alcalino di elettroforesi (pH>13)

Elettroforesi Neutralizzazione degli alcali Colorazione del DNA e visualizzazione dei vetrini al microscopio a fluorescenza

Lo scopo della visualizzazione dei campioni al microscopio a

fluorescenza è la quantificazione del numero di cellule che presentano il DNA frammentato rispetto a quelle

con nucleo intatto, e la quantificazione del danno genetico

subito attraverso misurazioni di determinati parametri strutturali

della cometa stessa.

testa - superficie occupata dal nucleo; coda – superficie DNA migrato; densità - rapporto tra il numero di pixel e la superficie dell’immagine.

Questi parametri vengono elaborati dal software consentendo di procedere all’analisi quantitativa e la scelta dei valori da attribuire è fondamentale e può

risultare estremamente variabile a seconda delle condizioni sperimentali adottate. Le misure necessarie a

determinare l’entità del danno genotossico subito vengono effettuate su n. 50 immagini prese random tra

100 cellule.

Sulla base di queste misure vengono calcolate:

% di DNA migrato

tail moment % DNA migrato x lunghezza coda (tail)

tail moment olive % DNA migrato x distanza tra la testa e il centro di massa del DNA nella coda

Saggio della Comet

Il test della cometa è in grado di stabilire se un agente induce la formazione di danni al DNA,

ma non permette di determinare l'entità del danno o la porzione di genoma che lo

ha subito. Per questo, per avere dei risultati sperimentali

più specifici, deve essere accompagnato da altri test di

mutagenesi.

Test della Comet

A) la lunghezza della coda (TL); l’intensità della coda (TI); l’area della coda (TA).

B) la lunghezza della testa (HT); l’intensità della testa (HI); la superficie della testa (HA). Questi parametri sono stati usati per determinare il

livello del danno al DNA come: percentuale di DNA frammentato (TDNA) momento della coda (TMOM)

0

500

1000

1500

2000

2500

TMO

M

Control5 μg/ml FE 50 μg/ml FE100 μg/ml FE5 μg/ml Croc. 50 μg/ml Croc. 100 μg/ml Croc.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

TDN

A


100 μg/ml 100 μg/ml

controlcontrol

55 μg/ml μg/ml

550 μg/ml 0 μg/ml


0

10

20

30

40

50

60

70

80

TDN

A

Control5 μg/ml FE50 μg/ml FE100 μg/ml FE 5 μg/ml Croc. 50 μg/ml Croc. 100 μg/ml Croc.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

TDN

A


0

500

1000

1500

2000

2500

TMO

M

Control5 μg/ml FE 50 μg/ml FE100 μg/ml FE5 μg/ml Croc. 50 μg/ml Croc. 100 μg/ml Croc.

0

500

1000

1500

2000

2500

TMO

MControl5 μg/ml FE50 μg/ml FE100 μg/ml FE5 μg/ml Croc. 50 μg/ml Croc. 100 μg/ml Croc.

Fibroblasts Fibroblasts Monocyte-macrophage J774Monocyte-macrophage J774

While acute inflammation is a part of the defense response, chronicinflammation can lead to cancer, diabetes, cardiovascular, pulmonary, and neurological diseases. Several pro-inflammatory gene products have been identified that mediate a critical role in suppression of apoptosis, proliferation, angiogenesis, invasion, and metastasis. Among these gene products are TNF and members of its superfamily, IL-1, IL-1, IL-6, IL-8, IL-18, chemokines, MMP-9, VEGF, COX-2, and 5-LOX. The expression of all these genes are mainly regulated by the transcription factor NF-kB, which is constitutively active in most tumors and is induced by carcinogens (such as cigarette smoke), tumor promoters, carcinogenic viral proteins, and -irradiation.

Infiammazione e cancro

NIK: NF-kB inducing kinaseMEKK1: mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase kinase1IRAK: interleukin-1 receptor associated kinaseTRAF: tumour necrosis factor alpha receptor associated factorsPKC: protein kinase C

Ambiente extracellulare e NF-kB

COX-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

24 h 48 h 72 h 96 h

A.D

.U.

ControlFluoro-edenite 5 µg/mlFluoro-edenite 50 µg/mlFluoro-edenite 100 µg/ml

*

*

* *

*

* **

*

*

*

*

PGE2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

24 h 48 h 72 h 96 h

pg/m

g pr

otei

n

ControlFluoro-edenite 5 µg/mlFluoro-edenite 50 µg/mlFluoro-edenite 100 µg/ml

* *

*

*

**

*

*

*

*

*

*

J774 monocyte-macrophage cell line

Fluoro-edenite induces functional modifications and affect some biochemical

parameters, playing an essential role in the development and progression of

cancer, in lung cells in a concentration- and time-dependent manner.

The sequence of the damage seems to be as follows: at increasing fluoro-

edenite concentrations, and/or treatment times, the increase in ROS production, with upregulation of iNOS or NO., could trigger significant DNA damage in fibroblasts, A549 and J774 cells, concomitantly with a drop in cell metabolism, an increase in LDH release

and COX-2 and PGE2 production.

Inhaled fluoro-edenite Inhaled fluoro-edenite fibers can induce fibers can induce

mesotheliomamesothelioma

This is a typical example of non-This is a typical example of non-occupational exposure of an occupational exposure of an

environmental nature caused by environmental nature caused by natural fluoro-edenite fibrous natural fluoro-edenite fibrous

amphibolesamphiboles

ANTIGORITEANTIGORITE(AOSTA, ITALY)(AOSTA, ITALY)

from serpentine rock outcropping at Blue Lake near St. Jacquesfrom serpentine rock outcropping at Blue Lake near St. Jacques

Chemical formula: Chemical formula: (Mg(Mg11.0511.05FeFe0.530.53AlAl0.210.21))12.0012.00(Si(Si7.987.98AlAl0.020.02))8.008.00OO2020(OH)(OH)1616

Met-5AMet-5A

J774J774

http://www.imig.org/IMIGWebApp/images/MesothelialCells.gif

0

20

40

60

80

100

C 5 50 100

% v

iabi

lity

*

*

*

Antigorite

0

20

40

60

80

100

C 5 50 100

% v

iabi

lity

**

*

Antigorite

MTT assayMTT assayMet-5AMet-5A

J774J774

0

20

40

60

C 5 50 100

% r

elea

se

*

*

*

Antigorite

0

20

40

60

C 5 50 100

% r

elea

se*

**

Antigorite

J774J774

Met-5AMet-5ALDH releaseLDH release

0

1000

2000

3000

4000

C 5 50 100

I.F./m

g pr

otei

n

*

**

Antigorite

0

1000

2000

3000

4000

C 5 50 100

I.F./m

g pr

otei

n *

Antigorite

J774J774

Met-5AMet-5A

Reactive oxygen species Reactive oxygen species productionproduction

0

10

20

30

40

C 5 50 100

nM/1

06 cel

ls

**

Antigorite

*

0

10

20

30

40

C 5 50 100

nM/1

06 cel

ls

Antigorite

*

* *

J774J774

Met-5AMet-5ANitric oxide Nitric oxide productionproduction

0

10

20

30

40

C 5 50 100

pg/m

l

Antigorite

**

*

0

10

20

30

40

C 5 50 100

pg/m

l

Antigorite

**

J774J774

Met-5AMet-5APGEPGE22 production production

These results surely confirm that mesothelial cells and macrophages exposed to antigorite generate ROS and NO and may undergo oxidative stress. Both ROS and NO can induce inflammatory reactions and/or cell transformation in adjacent tissues. This is confirmed by PGE2 results. In our experimental conditions, the results show a more evident pro-inflammatory effect induced by fibrous antigorite on mesothelial cells than on the macrophages cells.

The results of this study revealed significant biochemical changes in mesothelial Met-5A and monocyte-

macrophage J774 cells after antigorite treatment and suggested that these changes may directly or indirectly be responsible for eliciting of antigorite-

mediated host pathological or neoplastic responses.

CONCLUSIONSCONCLUSIONS mineralogical characterization of rocks mined from specific deposits helps determine the presence, form, abundance and morphology of potential toxicants, and can be used to develop predictive models of mineral deposit types where such components may be present. in vitro toxicity tests of well-characterized ore can help the understanding of toxicity effects of potential toxicants upon exposure present in rocks, soils, dusts and water as a result of natural erosion and weathering of mineral deposits and host rocks. the in vitro investigation is important in order to determine the degree of cell damage induced by the environmental exposure to single breathable inorganic fibres.

Our results have been helpful in revealing the properties of

some asbestiform fibers important in toxicity,

inflammation and disease, and provided information on the reactivity in fibrous mineral-

induced biological and pathological responses.

Opere previste per la messa in sicurezza dell’area di cava del Monte Calvario

Legge 241/90

Presenza contemporanea di Fe2+ e Fe3+

Fluoro-edenite 19 (Na0.307K0.157)∑0.464(Ca1.05Na0.555Mg0.131)∑1.997(VIAl0.200 Fe3+

0.180Fe2+0.180

Mg4.322Ti0.060Mn0.59)∑4.931(Si7.679IVAl0.317)∑7.996O22(F1.970Cl0.020)∑1.990.

Fluoro-edenite 27 (Na0.307K0.157)∑0.464(Ca1.505Na0.495)∑2.000(VIAl0.104 Fe3+

0.333Fe2+0.162

Mg4.255Ti0.062Mn0.063)∑4.980(Si7.520IVAl0.480)∑8.000O22(F1.970Cl0.020)∑1.990.

La fluoro-edenite 19 ha un contenuto totale di ferro più basso

rispetto alla 27

Fe3+0.180Fe2+

0

.180

Fe3+0.333Fe2+

0.

162

TREMOLITEProveniente dalla Val di Susa

Formula chimica Ca2(Mg,Fe2+)5[Si8O22](OH)2

Utilizzata come fibra di riferimento

Proteine da stress

• Fattori ambientali Shock termico Metalli pesanti di transizione Inibitori del metabolismo energetico Analoghi degli amminoacidi Agenti chemioterapici

• Stati patologici Infezioni virali Febbre Infiammazioni Ischemia Lesioni da ossidanti Neoplasie

• Fattori cellulari normali Ciclo di divisione cellulare Fattori di crescita Sviluppo e differenziamento

Indotte 73 kDa(solo in cellule sottoposte a stress)

hsp Costitutive 72 kDa

(in condizione di crescita normale)

Sono state ritrovate anche nell’ambiente

extracellulare assumendo un

importante ruolo nell’induzione delle

risposte immunitarie

•Descritte inizialmente come proteine da shock termico;•Cellule di Drosophila sottoposte a temperature crescenti determinano un incremento della concentrazione di una proteina di P.M. 70000 (da 35 a 37°C);

•Tale proteina è stata contraddistinta con la sigla HSP70 (heat shock protein).

Proteine da stress

HEAT SHOCK PROTEINHSP

Sono state classificate in sei famiglie, essenzialmente sulla base del peso molecolare: hsp100 (100-110 kDa), hsp90 (83-90 kDa),

hsp70 (66-78 kDa), hsp60, hsp40 e le small hsp (15-30 kDa). Esse si trovano in diversi compartimenti cellulari dove sono deputate

a svolgere specifiche funzioni.

Il loro ruolo è legato al mantenimento della struttura delle proteine secondo quattro aspetti principali: a)assicurano il raggiungimento e il mantenimento del corretto stato conformazionale delle catene polipeptidiche appena sintetizzate; b)dirigono l’assemblaggio di complessi multienzimatici; c)aiutano al mantenimento o alla creazione di uno stato di parziale denaturazione delle proteine, favorendone così il trasporto attraverso le membrane dei mitocondri o dei plastidi; d)stabilizzano le proteine danneggiate formatesi a seguito di stress chimici o fisici facilitandone la rinaturazione e/o la degradazione.

HSP70

Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione è quella di favorire

l’assemblaggio di complessi multimerici proteici e, come chaperones molecolari, di facilitare il

folding intracellulare delle proteine. Sono costituite da due domini funzionali; un dominio carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente il sito di legame per ADP/ATP e che ha attività

ATPasica. Funzionano come monomeri o come dimeri, riconoscendo porzioni di 7-8 residui

amminoacidici.

HSP70 e apoptosi

HSP70 POTREBBERO SVOLGERE UN RUOLO CHIAVE NEL MEDIARE

RISPOSTE IMMUNITARIE CELLULARI

OBIETTIVI Determinare “in vitro” gli effetti di

diverse fibre asbestiformi:Fluoro-edenite 19Fluoro-edenite 27 Tremolite (fibra di riferimento)

Cellule mesoteliali Met-5A Cellule monocito-macrofagiche J774

Valutare lo stress ossidativo indotto dalle fibre asbestiformi a diverso contenuto di ferro

Verificare la possibilità di utilizzare l’espressione delle HSP70 come biomarker per le esposizioni alle fibre

Arricchimento preventivo delle fibre anfiboliche rispetto al materiale

originale

Sedimentazione gravimetrica

Analisi Western blot

Determinazione delle Specie Reattive dell’Ossigeno

2’-7’-diclorodiidrofluoresceina-diacetato (DCFH-DA)

Determinazione del rilascio di NO3

Analisi colorimetrica (reattivo di Griess)

Determinazione del rilascio di LDH

spettrofotometricamente analizzando la riduzione del NADH durante la trasformazione del lattato in piruvato

Determinazione della vitalità cellulare

MTT

Cos’e’ un Western blot?Una tecnica in cui le proteine sono

separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un

supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica

proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un

anticorpo.

Qual’e’ la proteina che mi interessa?

– SDS-PAGE (non certo)• Si basa sul confronto di peso molecolare

– Western blot (certo)• Si basa su una reazione specifica antigene-

anticorpo

A cosa serve il Western blot?

+

–

?

Quanta proteina di interesse c’e’?

A cosa serve il Western blot?

Proteina di interesse

Bande non specifiche

[proteina], pg

020406080

100

1 100 10000

Pg di ProteinaD

ensi

ta' m

edia

(in

tens

ita')

Fasi di un Western blot• Prima fase: elettroforesi su gel.

(Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni)

• Seconda fase: trasferimento su membrana.(Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico)

• Terza fase: saturazione o “blocking”. (La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l’anticorpo e la membrana)

Fasi di un Western blot• Quarta fase: legame dell’anticorpo primario.

(L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana)

• Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario.(L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP, fosfatasi alcalina; o HRP, perossidasi di rafano), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’ legato alla proteina sulla membrana)

• Sesta fase: rivelazione o “detection”. (L’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

HRP

Western blotHRP

substrato

luce

Anticorpo primario Anticorpo secondario RivelazioneIl substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce

pg proteina

Anticorpi policlonaliProduzione• Immunizzazione ripetuta dell’animale

con l’antigene (peptide, proteina purificata o ricombinante)

• Il sangue e’ prelevato nel momento di picco di produzione dell’anticorpo ed e’ purificato il siero

• Il “pool” degli anticorpi riconosce molti epitopi dell’antigene usato per l’immunizzazione

Anticorpi monoclonali

riconoscono solo un epitopo

Incubazione con anticorpo secondario

• Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase)– Conversione di un substrato colorimetrico in

un precipitato colorato • Substrati Chemioluminescenti

– Emettono luce se convertiti dall’enzima– Possono essere visualizzati su lastre

radiografiche• Marcatura radioattiva• Anticorpi secondari biotinilati

0

1

2

3

4

5

6

7

C 5 50 100

Concentrazione (µg/ml)

A. D

. U. * ° ^

* ° ^

* ° ^ControlloFluoro-edenite 19Fluoro-edenite 27Tremolite

Controllo

Tremoli

te5

μg/ml

Tremoli

te50 μg/ml

Tremoli

te 100μm/nl

Fluoro-

adenite.1

95

μg/ml

Fluoro-

adenite.1

950 μg/ml

Fluoro-

adenite.1

9100 μg/ml

Fluoro-

adenite 275

μg/ml

Fluoro-

adenite 2750 μg/ml

Fluoro

adenite 27100 μg/ml

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Hsp70 70 kDaα-tubulina 50 kDa

Espressione di HSP70 in cellule J774

Controllo

Tremolite

5 μg/ml

Tremolite

50 μg/ml

Tremolite 100

μg/ml

Fluoro-

adenite.19

5 μg/ml

Fluoro-

adenite.1950

μg/ml

Fluoro-

adenite.19100

μg/ml

Fluoro-

adenite 27

5 μg/ml

Fluoro-

adenite 2750

μg/ml

Fluoro-

adenite 27100

μg/ml

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Hsp70 70 kDa

α-tubulina 50 kDa

0

1

2

3

4

5

6

7

C 5 50 100


A. D

. U.

* ° ^ * ° ^* °

ControlloFluoro-edenite 19Fluoro-edenite 27Tremolite

Espressione di HSP70 in cellule Met-5A

Livelli di produzione di NO3-

0

5

10

15

20

25

30

C 5 50 100


µM/L

* ° ^

* ° ^ * ° ^ControlloFluoro-edenite 19Fluoro-edenite 27Tremolite

0

5

10

15

20

25

30

C 5 50 100

Concentrazione (µg/ml)µM

/L

° * ° * ° ^


J774 Met-5A

Produzione ROS

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

C 5 50 100

Concentrazione (µg/ml)I.

F. /m

g.di

pro

tein

e

* ° ^

* ° ^


0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

C 5 50 100


I. F.

/mg

di p

rote

ine

°* ° ^


J774 Met-5A

Rilascio di LDH indicatore di rottura di membrana cellulare e di necrosi cellulare

0

20

40

60

80

100

120

140

160

C 5 50 100


% r

ilasc

io

* ° ^* ° ^

°


0

20

40

60

80

100

120

140

160

C 5 50 100

Concentrazione (µg/ml)%

rila

scio

°*

°* ^ °* ^ControlloFluoro-edenite 19Fluoro-edenite 27Tremolite

J774 Met-5A

Vitalità cellulare

0

20

40

60

80

100

120

140

160

C 5 50 100


% v

italit

à

° * ° ^ * ° ^*


0

20

40

60

80

100

120

140

160

C 5 50 100


% v

italit

à

° * ° ^ * ° ^


J774 Met-5A

CONCLUSIONI i minerali fibrosi inducono produzione di

proteine da stress HSP70;

le fibre di fluoro-edenite producono un maggiore incremento dei livelli di espressione di HSP70 rispetto alle fibre di tremolite;

le fibre di fluoro-edenite che hanno un contenuto maggiore di ferro danno luogo ad una maggiore produzione di specie reattive dell’ossigeno;

le fibre di fluoro-edenite con un minor contenuto di ferro inducono una maggiore produzione di specie reattive dell’azoto;

la tremolite che ha un contenuto di ferro minore rispetto alle due fibre di fluoro-edenite induce una minore produzione di specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto e di HSP70;

le due fibre di fluoro-edenite influenzano maggiormente la vitalità cellulare rispetto alla tremolite.

OncosoppressoriI geni oncosoppressori - o più precisamente le proteine da essi

codificate - assolvono ad una grande varietà di funzioni, generalmente in contrasto con le funzionalità espresse dagli oncogeni. Se gli oncogeni infatti, nella maggioranza dei casi,

presiedono a tutti i meccanismi di accrescimento e proliferazione cellulare, gli oncosoppressori si pongono come limite a tali funzioni.Le funzioni degli oncosoppressori possono essere:1. Repressione di geni essenziali per la prosecuzione del ciclo cellulare. Se tali geni non sono espressi, la cellula non sarà in grado di progredire verso la mitosi.2. Interruzione del ciclo cellulare in caso di DNA danneggiato. Finché in una cellula è presente DNA danneggiato non riparato, essa non è in grado di dividersi. Solo se il DNA viene riparato, la cellula può proseguire con il ciclo.3. Avvio dell'apoptosi. Se il danno non può essere riparato, nella cellula viene avviata l'apoptosi, un processo di morte cellulare programmata che rimuove il rischio che tale cellula possa nuocere all'organismo.4. Soppressione di metastasi. Diverse proteine coinvolte nell'adesione cellulare sono in grado di impedire alle cellule tumorali di disseminarsi nell'organismo e di ripristinare l'inibizione da contatto.

La proteina del retinoblastoma Rb e pRB è una proteina soppressore tumorale che è stata trovata non funzionante in numerosi tipi di cancro. Rb fu così chiamata perché fu scoperto che il retinoblastoma (un cancro della retina) si sviluppava quando entrambi gli alleli del gene RB1 (il gene che codifica la proteina Rb) era inattivato da una mutazione. La "p" nella sigla pRB sta invece ad indicare che solitamente è presente nella cellula come fosfoproteina. La normale funzione di Rb è di bloccare la cellula in uno stadio del ciclo cellulare prevenendone errate o dannose divisioni. Così, quando Rb è difettosa, alcune cellule mutate possono continuare a dividersi indisturbate dando origine ad un tumore.

Rb inibisce la progressione del ciclo cellulare quando è defosforilata, mentre lo promuove quando è fosforilata. Rb è attivata quando la cellula sta finendo la mitosi (fase M) attraverso una fosfatasi che lo defosforila, permettendogli di legare E2F.

Quando invece è giunto il momento per la cellula di entrare in fase S, un complesso di chinasi ciclina-dipendente (CDK) e ciclina fosforilano Rb, facendolo staccare da E2F. La prima fosforilazione è fatta dal complesso Ciclina D/CDK4,6 ed è seguita da quella del complesso Ciclina E/CDK2. Rb rimane fosforilata durante le fasi S, G2 ed M.

La fosforilazione di Rb permette la dissociazione di E2F-DP da Rb, rendendo il fattore di trascrizione attivo. Quando E2F è libero attiva la trascrizione di geni che codificano per cicline (come le Cicline E e A), che faranno procedere il ciclo cellulare attivando le CDK specifiche, ed anche per proteine chiamate Antigene nucleare delle cellule in proliferazione, o PCNA, che aumenta la velocità di duplicazione del DNA e la sua riparazione, aiutando la DNA polimerasi a legare il DNA.

a)

b)

Le cicline implicate in questo evento sono soprattutto le classi D1, D2, D3, della

ciclina-D, la quale viene prodotta durante la fase G1, ma nella fase S non è più

possibile ritrovarla. La ciclina-D, si lega alla CDK4, il complesso risultante, determina la iperfosforilazione

del RB ed il rilascio del fattore di trascrizione E2F. Il fattore di trascrizione E2F viene rilasciato e favorisce l'entrata

della cellula nel ciclo cellulare.

Segnali di trasduzione indotti da materiali fibrosi

in colture di cellule epiteliali umane alveolari

La trasduzione del segnale

Schema generale dei meccanismi di trasduzione del segnale Cascata di trasduzione del segnale

La trasduzione del segnaleTipi di recettori

Classificazione dei recettori impegnati nei meccanismi di trasduzione del segnale

La trasduzione del La trasduzione del segnalesegnaleRecettori accoppiati a proteine G

Meccanismi di azione di recettori associati a proteine G (GPCRC)

Il sistema della fosfolipasi C• I recettori accoppiati a proteine Gq (es. 1 adrenergico, muscarinico M3) attivano la fosfolipasi C (PLC).• La PLC catalizza la formazione di inositolo trifosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG).• IP3 fa mobilizzare calcio dai depositi intracellulari responsabile di diversi effetti quali, ad esempio, contrazione, secrezione, attivazione di enzimi.• Il DAG promuove l’attivazione della protein chinasi C (PKC) la quale fosforila diverse proteine controllando molte funzioni cellulari.

Le Fosfolipasi CMeccanismi di azione

Idrolisi del PIP2 da parte della fosfolipasi C-β

Le Fosfolipasi CMeccanismi di azione

Organizzazione strutturale delle isoforme della PLC

Le Fosfolipasi C

Dendogramma dell’organizzazione strutturale delle isoforme della PLC

Domini delle isoforme della PLCLe Fosfolipasi C

Domini strutturali della PLC δ1

Mammalian PLC δ1

Bacterical PLC (Bacillus cereus)

Regolazione dell’attività cataliticaLe fosfolipasi Cβ1

Meccanismi di regolazione della PLC β1 nucleareMeccanismi di attivazione della PLC β1 a livello citoplasmatico

Gsα Giα Gqα G12α

Fluoro-edenite 19, Fluoro-edenite 19, 27, crocidolite e 27, crocidolite e

tremolitetremolite Fluoro-edenite 19 50% di Fe2+ < %Fe tot

(Na0.307K0.157)Σ0.464(Ca1.505Na0.495)Σ2.000(VIAl0.104Fe3+0.333Fe2+

0.162Mg4.255Ti0.062Mn0.063)Σ4.980(Si7.520IVAl0.480)Σ8.000O22(F1.970Cl0.020)Σ1.990

Fluoro-edenite 27 30% di Fe2+ >%Fe tot

(Na0.256K0.164)Σ0.420(Ca1.311Na0.555Mg0.131)Σ1.997(VIAl0.200Fe3+0.180Fe2+

0.180Mg4.322Ti0.060Mn0.059)Σ4.931(Si7.679IVAl0.317)Σ7.996O22(F1.970Cl0.02

0)Σ1.990

Crocidolite 46% di Fe 2+

54% di Fe3+

Tremolite 83% di Fe 2+

17% di Fe3+

Finalità della ricerca Analizzare su cellule epiteliali

alveolari A549 l’espressione della PLC β1 e γ1 dopo trattamento con fluoro-edenite 19 e 27 Stabilire se il basso o alto contenuto di ferro totale, presente rispettivamente nelle fibre di fluoro-edenite 19 e 27, può influenzare la produzione di citochine pro-infiammatorie Determinare se l’esposizione delle cellule epiteliali polmonari alla fluoro-edenite può indurre un aumento di citochine connesso con l’attivazione della PLC

Comparare le risposte biologiche della fluoro-edenite con quelle della tremolite e crocidolite

L’espressione della PLC β1 e γ1 è stata valutata mediante analisi Western blot e immunofluorescenza

Le concentrazioni delle citochine pro- infiammatorie

IL-1β, IL-6 e TNF-α sono state misurate mediante saggio E.L.I.S.A.

Le cellule A549 sono state trattate con le fibre sperimentali alla concentrazione di 50 μg/ml per 48 ore

A549 al microscopio ottico A549 al microscopio ottico a fluorescenza

Materiali e metodiMateriali e metodi

Espressione della PLC β1 e PLC γ1 in cellule A549

RisultatiRisultati

Immunofluorescenza in cellule A549

(PLC β1)

(PLC γ1)

Controllo

Tremolite Fluoro-edenite 19

Fluoro-edenite 27 Crocidolite

Controllo

Tremolite Fluoro-edenite 19

Fluoro-edenite 27 Crocidolite

RisultatiRisultati

i pozzetti sono

rivestiti di

anticorpo primario

caricamento campione

aggiunta dianticorpo secondario

aggiunta di substrato

Saggio E.L.I.S.A.(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

incubazionea temperatura

ambiente

i pozzetti sono

rivestiti di

anticorpo primario

caricamento campione

aggiunta dianticorpo secondario

aggiunta di substrato

incubazionea temperatura

ambiente

lettura allo spettrofotome

tro

Concentrazione delle citochine pro-infiammatorie

RisultatiRisultati

un’ espressione aumentata sia di PLC β1 che γ1 in cellule A549 trattate con le 4 fibre amianto

l’espressione della PLC β1 e γ1 non è collegata con la quantità totale di ferro presente in ciascuna fibra l’espressione della PLC β1 è aumentata in quelle fibre dove è presente una quantità elevata di ferro ferroso

%Fe2+- +

I nostri dati dimostrano:I nostri dati dimostrano:

i livelli di IL-1β, IL-6 e TNF-α sono più alti in cellule A549 trattate rispetto a quelle non trattate

la fluoro-edenite 27 rispetto alla 19 stimola una elevata secrezione di IL-1β, IL-6 e TNF-α

l’aumento di citochine è correlato positivamente con la quantità totale di ferro presente in ogni fibra, ma non con la quantità di ferro ferroso o ferrico

il rilascio di citochine e l'espressione di PLC non sono rigorosamente collegati

tutte le fibre promuovono la formazione di cellule giganti multinucleate

confronta gli effetti della fluoro-edenite 19 e 27 con quelli di tremolite e crocidolite

valuta l’espressione di PLC β1 e γ1 in cellule A549 in rapporto alla quantità di ferro totale e di ione ferroso/ferrico presente nelle fibre

Questo è il primo studio Questo è il primo studio cheche

e

Le fosfolipasi C β1 e γ1 e le citochine IL-1β, IL-6 e

TNF-α svolgono un ruolo

fondamentale nella risposta biologica alla fluoro-edenite e alle

altre fibre d’amianto

L’esposizione a queste fibre

può rappresentare un alto rischio

per lo sviluppo del cancro

Lezione 3

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