LA FLESSIBILITA' NELLA VALUTAZIONE DELLE INTERAZIONI...

UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PARMA

FACOLTA' DI FARMACIA

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA

IN CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE

LA FLESSIBILITA' NELLA VALUTAZIONE DELLE

INTERAZIONI TRA MOLECOLE BIOLOGICHE:

IL RECETTORE DEGLI ESTROGENI

Relatore:

Chiar.mo Prof. ANDREA MOZZARELLI

Correlatori:

Dott. PIETRO COZZINI

Dott. ALESSIO AMADASI

Laureanda:

ELENA ESPOSITO

ANNO ACCADEMICO 2004-2005

Alle mie nonne

Indice

INTRODUZIONE.................................................................................................. 1

1.1 Gli estrogeni.................................................................................................. 1

1.2 Meccanismo d’azione degli estrogeni.................................................. 2

1.2.1 Le isoforme recettoriali α e β...................................................... 3

1.2.2 Il legame dell’estradiolo a ERα.................................................. 4

1.3 Principali effetti benefici e avversi della stimolazione estrogenica............................................................................................................

5

1.4 L’elica 12......................................................................................................... 7

1.5 I SERM............................................................................................................ 7

1.5.1 Il legame del raloxifene a ERα................................................... 9

1.5.2 Meccanismo d’azione dei SERM................................................ 10

1.6 I fitoestrogeni............................................................................................... 11

1.7 Endocrine disruptors.................................................................................. 13

1.8 Virtual screening.......................................................................................... 14

1.9 Flessibilità e docking................................................................................. 17

1.10 La flessibilità delle proteine.................................................................. 18

1.11 Incorporazione della flessibilità proteica nel docking................ 20

HINT......................................................................................................................... 23

2.1 Il software HINT......................................................................................... 23

2.1.1 Relazione tra LogP e ∆G°........................................................... 27

2.1.2 Applicazioni del software HINT................................................ 28

SCOPI........................................................................................................................ 29

MATERIALI E METODI..................................................................................... 31

4.1 Tripos............................................................................................................ 31

4.2 Analisi di composti cristallografici proteina-ligando-acqua: protocollo di lavoro........................................................................................... 32

4.3 Docking di complessi cristallografici: protocollo di lavoro........ 36

4.4 Docking di additivi alimentari: protocollo di lavoro..................... 37

4.5 GRID................................................................................................................ 38

Indice

RISULTATI E DISCUSSIONI............................................................................. 41

5.1 Flessibilità del recettore degli estrogeni............................................ 42

5.2 Analisi preliminari....................................................................................... 46

5.2.1 Scelta della struttura cristallografica del recettore............... 46

5.2.2 Ruolo della molecola d’acqua conservata................................. 47

5.3 Docking di SERM e agonisti................................................................... 49

5.4 Analisi del farmacoforo............................................................................. 56

5.5 Docking di additivi alimentari............................................................... 59

5.5.1 Delfinidina....................................................................................... 62

5.5.2 Capsaicina........................................................................................ 64

5.5.3 Bisdemetossicurcumina................................................................ 67

5.5.4 Propil p-idrossibenzoato.............................................................. 69

5.5.5 Acido nordiidroguaiaretico.......................................................... 71

5.5.6 Eugenolo.......................................................................................... 73

5.5.7 o-Fenilfenolo................................................................................... 74

5.5.8 Chinina............................................................................................. 75

5.5.9 Etilvanillina..................................................................................... 78

5.5.10 Acido colico................................................................................... 79

5.5.11 Valutazione dei risultati ottenuti dall’analisi degli additivi........................................................................................................

80

CONCLUSIONI....................................................................................................... 85

BIBLIOGRAFIA..................................................................................................... 87

Introduzione

Introduzione

1

1.1 GLI ESTROGENI

Gli estrogeni appartengono alla famiglia degli ormoni sessuali e presentano la tipica

struttura steroidea a 18 atomi di carbonio. Il 17 beta-estradiolo è il capostipite degli

ormoni estrogenici e viene sintetizzato principalmente a livello ovarico in risposta a

stimoli ipofisari. L’estradiolo è prodotto anche dalla placenta durante la gravidanza

e in piccola percentuale dai testicoli e dalle ghiandole surrenaliche. L’azione

dell’estradiolo è sostenuta da altri due estrogeni: l’estrone e l’estriolo. Tali ormoni

sono caratterizzati da una bassa affinità recettoriale e sono sintetizzati,

principalmente, a livello epatico in seguito a conversione dell’estradiolo stesso

(Figura 1.1.1).

Le proprietà idrofobiche del nucleo steroideo permettono agli estrogeni di

oltrepassare le membrane e svolgere la loro azione fisiologica a livello intracellulare.

Per le stesse ragioni, questi ormoni si trovano in circolo fortemente coniugati con

una globulina plasmatica chiamata SHBG (sex-hormone binding globulin). Ne deriva

che solo una piccola aliquota è libera e disponibile per la diffusione all’interno delle

cellule.

La funzione primaria degli estrogeni è di promuovere lo sviluppo e il mantenimento

dei caratteri sessuali secondari femminili, ma, in realtà, gli estrogeni sono coinvolti

in un ampio spettro di attività fisiologiche che riguardano la regolazione

omeostatica di molteplici eventi biochimici e cellulari (Vaya et al. 2004).

Figura 1.1.1: Metabolismo dell’estradiolo (B. G. Katzung, Farmacologia generale e clinica, Piccin, Padova 2001).

Introduzione

2

1.2 MECCANISMO D’AZIONE DEGLI ESTROGENI

Gli estrogeni mediano la loro azione fisiologica attraverso la stimolazione di una

classe recettoriale costituita dai recettori degli estrogeni (ERs), i quali

appartengono alla superfamiglia dei recettori nucleari e presentano domini

strutturali comuni a quelli dei recettori per testosterone, progesterone, corticoidi,

ormoni tiroidei vitamine A e D. I recettori ERs sono in grado di attraversare la

membrana nucleare e raggiungere il citoplasma, ma, per lo più, risiedono nel nucleo

complessati con heat shock protein, che mantengono quiescente il recettore fino

all’arrivo di un appropriato agonista. Il legame con l’estradiolo genera una serie di

variazioni conformazionali tali per cui le proteine stabilizzatrici vengono

allontanate e il recettore dimerizza, esponendo la propria superficie all’aggancio dei

coattivatori. Il complesso che si genera presenta un elevata affinità per specifiche

sequenze palindromiche di DNA, chiamate elementi di risposta agli estrogeni

(ERE), localizzate a monte di promotori di diversi geni di cui regolano la

trascrizione (Figura 1.2.1).

Questo meccanismo d’azione è alla base degli effetti promossi dagli estrogeni.

Figura 1.2.1: Meccanismo trasduzionale mediato dal recettore degli estrogeni (Osborne et al. 2000)

Introduzione

3

Alcune delle azioni mediate dall’estradiolo e dai suoi analoghi sembrano essere

legate anche ad effetti indiretti, dovuti alla liberazione, per azione delle proteine

neosintetizzate, di mediatori lipidici, citochine e fattori di crescita.

1.2.1 LE ISOFORME RECETTORIALI α E β

Nel 1986 fu clonato per la prima volta il recettore degli estrogeni, identificato con la

sigla ERα, che per anni rimase l’unico recettore conosciuto. Nel 1996 Gustafsson e

collaboratori riuscirono ad isolare e clonare un secondo sottotipo recettoriale a cui

fu dato il nome ERβ. Tale scoperta sollevò numerose domande riguardo al diverso

impatto dei due recettori nel regolare le molteplici attività mediate dagli estrogeni,

alcune delle quali rimangono ancora irrisolte.

Studi successivi hanno dimostrato che il sottotipo α svolge un ruolo predominante

nello sviluppo dei caratteri sessuali secondari e nella regolazione della densità ossea,

mentre la stimolazione del recettore β sembra essere necessaria nello sviluppo

cerebrale e cognitivo e nei processi di plasticità neuronale, che rendono il recettore

un potenziale target farmacologico nel trattamento del morbo di Alzheimer (Liquin

Zhao et al 2004). Infine, ERβ è espresso in molti altri tessuti, quali il sistema

cardiovascolare, immunitario, gastrointestinale, urogenitale, renale. Non è escluso

che rappresenti la popolazione recettoriale maggiormente presente nell’organismo

(Gustafsson et al 1999).

I recettori degli estrogeni sono formati da sei domini strutturali (A-F),

diversamente coinvolti nel meccanismo di trasduzione del segnale (Figura 1.2.2).

Nella porzione amminoterminale della proteina si trova una sequenza altamente

variabile (dominio A/B), direttamente implicata nella trasduzione del segnale, in

quanto interagisce con i coattivatori. La regione C, localizzata centralmente e

fortemente conservata, rappresenta il dominio di legame al DNA e contiene due

motivi leganti zinco. La regione D contribuisce alla flessibilità e alla dimerizzazione

del recettore. Il dominio (E) di legame degli agonisti endogeni (LBD) è conservato e

coopera nell’aggancio dei coattivatori e dei corepressori trascrizionali. Infine, nella

porzione carbossiterminale si trova il dominio F, che partecipa all’attivazione

trascrizionale. I recettori α e β presentano analogie strutturali a livello dei domini

deputati al legame del DNA (95% di omologia) e del ligando (58% di omologia), che

Introduzione

4

rappresentano le regioni conservate, mentre A/B, D e F non sono necessariamente

simili (Jordan et al 2003). All’interno di LBD (ligand binding domain) i due residui

amminoacidici Leu 384 e Met 421 di ERα corrispondono, rispettivamente, a Met

336 e Ile 373 nel recettore β. Questa sottile diversità potrebbe essere la chiave per la

costruzione di ligandi in grado di discriminare tra le due isoforme recettoriali (Liqin

Zhao et al. 2004), anche se estremamente difficile..

1.2.2 IL LEGAME DELL’ESTRADIOLO A ERα

La struttura cristallografica del complesso ERα-estradiolo fu determinata, per la

prima volta, da Brzozowski e collaboratori nel1997. Il sito di legame dell’estradiolo

è collocato in una cavità profonda del recettore ed è costituito, in larga parte, da

amminoacidi idrofobici. La complementarietà tra il carattere apolare degli agonisti

endogeni e l’idrofobicità del sito contribuisce, unitamente alla formazione di specifici

legami idrogeno, al riconoscimento tra proteine e ligando. L’estradiolo presenta,

nella propria struttura, due gruppi ossidrilici, le cui interazioni sono di

fondamentale importanza nell’attivazione del recettore. In particolare, l’ossidrile

fenolico instaura legami idrogeno con lo ione carbossilato del Glu 353, con il

gruppo guanidinico dell’Arg 394 e con una molecola d’acqua conservata, mentre il

17-β ossidrile forma un unico legame ad idrogeno con l’anello imidazolico dell’His

524. La restante parte della molecola non contrae legami diretti con il recettore, ma

Figura 1.2.2: Domini strutturali del recettore degli estrogeni (COT Report, Phytoestrogens and Health, Food Standards Agency, 2003)

Introduzione

5

prende parte a numerose interazioni idrofobiche (Figura 1.2.3). L’estradiolo lega

Erα con una Ki pari a 0.13 nM (George et al. 1997).

1.3 PRINCIPALI EFFETTI BENEFICI E AVVERSI DELLA

STIMOLAZIONE ESTROGENICA

Tessuto osseo

E’ stato dimostrato che l’aumentata incidenza di osteoporosi e fratture ossee nel

periodo postmenopausale è strettamente correlata alla diminuzione della produzione

di estrogeni (Anthony et al. 2002). Una delle principali terapie nella cura

dell’osteoporosi consiste, infatti, nella somministrazione di ormoni estrogenici

oppure di modulatori selettivi del recettore degli estrogeni che riducono il

riassorbimento del tessuto osseo e ne promuovono la rimineralizzazione.

Sistema cardiovascolare

Gli estrogeni esercitano importanti effetti benefici sul sistema cardiocircolatorio

dovuti, in gran parte, alla riduzione della formazione di placche aterosclerotiche. Le

Figura 1.2.3: Interazione dell’estradiolo con il sito attivo del recettore (Brzozowski et al. 1997).

Introduzione

6

arterie sono parzialmente protette dalla capacità degli estrogeni di limitare il

rilascio di lipoproteine a bassa densità (LDL) e aumentare quello delle lipoproteine

ad alta densità (HDL). Inoltre, tali ormoni, promuovono la vasodilatazione e

riducono i fenomeni di ischemia miocardica (Anthony et al. 2002).

Effetti proliferativi

Probabilmente gli estrogeni non sono i diretti responsabili dei cambiamenti cellulari

che generano una neoplasia, ma favoriscono, comunque, la proliferazione

incontrollata di una popolazione cellulare già mutata (Jordan 1998). L’esposizione

agli estrogeni diventa un fattore di rischio nello sviluppo di tumori e limita la

terapia a base di tali ormoni durante la menopausa. I tessuti maggiormente colpiti

sono l’utero e il seno, che rappresentano le principali sedi dell’azione fisiologica.

Diversamente, gli estrogeni sembrano mostrare effetti favorevoli sul tratto

gastrointestinale, svolgendo un ruolo di protezione dallo sviluppo del cancro al

colon (Enmark et al. 1999).

Sistema immunitario

Molte malattie autoimmuni sono più comuni nella donna che nell’uomo e

frequentemente originano in seguito a cambiamenti drastici dei livelli ormonali,

come durante la pubertà, la gravidanza e la menopausa. Questo fa ipotizzare che gli

estrogeni esercitino azioni rilevanti anche nel sistema immunitario (Gustafsson et

al. 1999).

Centri cerebrali

Gli estrogeni possono esercitare diversi effetti neuroprotettivi sul sistema nervoso

centrale, che comprendono inibizione della formazione delle placche di β-amiloide,

stimolazione colinergica, riduzione dello stress ossidativo e protezione dalle

patologie vascolari. Studi clinici hanno dimostrato che le donne in cura con ormoni

estrogenici presentano una minor incidenza nello sviluppo del morbo di Alzheimer,

stimolando le ricerche in tale direzione (Ohmichi et al. 2005).

Introduzione

7

1.4 L’ELICA 12

Erα presenta due regioni chiamate activation functions (AFs) che presiedono

all’attivazione trascrizionale. AF-1, situata nel dominio A/B, è regolata dallo stato

di fosforilazione di alcune serine e non dal legame del recettore con il ligando. Al

contrario la conformazione di AF-2, collocata nel dominio carbossiterminale,

dipende dalla presenza e dal tipo di ligando. AF-2 è meglio conosciuta come elica

12.

Attualmente esistono diverse strutture del recettore Erα complessato con diversi

ligandi, sia di natura agonista che antagonista. L’elica 12 rappresenta una delle

porzioni maggiormente flessibili del recettore e assume orientazioni spaziali

differenti in base alla conformazione recettoriale selezionata dal ligando (Figura

1.4.1).

Quando il recettore è libero da ogni ligando, assume una struttura tridimensionale

affine ai corepressori che ne spengono l’attività. In presenza di un agonista l’elica 12

si dispone in posizione antiparallela rispetto all’elica 11, chiudendo la tasca di

legame e permettendo l’esposizione di una fessura idrofobica adatta all’aggancio dei

coattivatori (Figura 1.4.1A). Gli antagonisti e gli agonisti parziali sono

generalmente caratterizzati da catene laterali lunghe che non possono essere

contenute interamente nei confini del sito di legame e protendono al di fuori di esso.

Questo modello di antagonismo impone un riposizionamento dell’elica 12, che ruota

di 130° rispetto alla conformazione assunta nel complesso dell’agonista, inserendosi

tra le eliche 3, 4 e 5 (Figura 1.4.1B). Questa variazione conformazionale, che

impedisce il reclutamento dei coattivatori, è alla base dell’attività dei SERM

(modulatori selettivi del recettore per gli estrogeni).

1.5 I SERM

La terapia sostitutiva a base di estrogeni (estrogen replacement therapy HRT) è stata

utilizzata per molti anni, nelle donne in menopausa, per alleviare i sintomi associati

alla diminuzione dei livelli di estrogeni circolanti, quali vampate di calore e

decalcificazione delle ossa.

Introduzione

8

A

B

Sfortunatamente, però, gli effetti collaterali di tale terapia sono legati ad un

aumento dell’incidenza del cancro all’utero e al seno, che ne hanno limitato

fortemente l’utilizzo.

La scoperta dell’esistenza di una relazione tra la stimolazione del recettore degli

estrogeni e lo sviluppo di neoplasie, spostò l’attenzione del mondo scientifico verso

la ricerca di antagonisti per il trattamento del tumore mammario. Gli studi che

seguirono portarono alla nascita di una classe di farmaci, nota come SERM, il cui

Figura 1.4.1: Orientazione dell’elica 12 in presenza di un agonista (A) e in presenza di un agonista parziale (B). Il recettore α è rappresentato a sinistra con una proiezione “a cilindri” (elica 12 in rosso) e a destra mediante superficie di Connolly (elica 12 in fucsia).

Introduzione

9

nome riflette la capacità delle molecole di agire da agonisti in alcuni tessuti e da

antagonisti in altri.

I capostipiti di questa famiglia di molecole non steroidee sono due (Figura 1.5.1): il

primo è tamoxifene, che mostra effetti agonisti sulle ossa e sul sistema

cardiocircolatorio, mentre agisce da antagonista nelle ghiandole mammarie. Nel

1986 il tamoxifene era ampiamente prescritto come coadiuvante nella terapia del

cancro al seno, quando studi di tossicità dimostrarono che la molecola aumentava la

probabilità di tumore all’endometrio. Il secondo farmaco, scoperto successivamente,

è il raloxifene, che pur mantenendo tutti i vantaggi del tamoxifene svolge un’azione

antagonista anche a livello uterino, quindi non favorisce l’insorgenza di neoplasie.

Per tale motivo il raloxifene è diventato il prototipo nella ricerca di nuovi SERM.

1.5.1 IL LEGAME DEL RALOXIFENE A ERα

Nella struttura del complesso tra raloxifene e ERα è possibile distinguere gruppi

funzionali importanti per l’aggancio al recettore: la prima è rappresentata dai due

gruppi ossidrilici che, analogamente all’estradiolo, instaurano legami idrogeno con

Glu 353 e Arg 394 da un lato e His 524 dall’altro. I due ossidrili sono separati da un

corpo centrale rigido, che mima la struttura steroidea degli agonisti endogeni,

contraendo interazioni idrofobiche con il sito. Il raloxifene, infine, a differenza

dell’estradiolo, presenta una catena laterale ingombrante che impedisce, come

Figura 1.5.1: Strutture dei due SERM tamoxifene e raloxifene.

Introduzione

10

sottolineato in precedenza, il normale posizionamento dell’elica 12 e la formazione

della conformazione attiva. La catena laterale termina con un anello piperidinico

che, a pH fisiologico, si presenta, per lo più, nella forma protonata e forma un

legame idrogeno con la funzione carbossilica dell’ Asp 351, contribuendo ad

aumentare l’affinità del raloxifene per il recettore (Figura 1.5.2).

1.5.2 MECCANISMO D’AZIONE DEI SERM

Non è ancora del tutto chiaro come i SERM possano agire da antagonisti degli

estrogeni in alcune cellule e da agonisti in altre, ma sono state proposte ipotesi

diverse. Probabilmente questi farmaci interagiscono con il recettore in modo

identico in tutti i tessuti, ma la risposta cambia in base a qualche differenza

dipendente dalla cellula stimolata.

Una prima ipotesi riguarda la natura dei coregolatori: alcuni tessuti potrebbero non

essere in grado di produrre coattivatori capaci di legarsi al complesso SERM-

recettore, mentre altre cellule potrebbero presentare un set di coattivatori differenti

Figura 1.5.2: A sinistra sovrapposizione del sito di legame del raloxifene (blu) con quello dell’estradiolo (verde). A destra interazione del raloxifene con gli amminoacidi chiave della cavità di legame (Brzozowski et al. 1997).

Introduzione

11

o leggermente modificati in grado di agganciare recettori in conformazione anomala

e dare il via ad un complesso di trascrizione funzionante.

Un’altra teoria si basa sull’ipotesi che i complessi formati dai SERM siano incapaci

di legare gli elementi di risposta agli estrogeni nei geni. Tuttavia, in alcuni tessuti,

alcuni geni potrebbero possedere siti di legame alternativi, che permettono al

processo di trascrizione di continuare come se fosse legato l’estrogeno.

Infine, non si può sottovalutare l’ipotesi che le isoforme α e β del recettore

rispondano in maniera differente al legame dei SERM e, che a seconda della loro

distribuzione tissutale, vari la risposta generata.

1.6 I FITOESTROGENI

Composti naturali presenti nelle piante, definiti fitoestrogeni, hanno mostrato di

possedere attività estrogeno mimetica. Nel 2003 la Food Standards Agency ha

pubblicato un rapporto dal titolo “Phytoestrogens and health” in cui i fitoestrogeni

sono definiti come: “qualsiasi sostanza o metabolita di origine vegetale che induce

risposte biologiche nei vertebrati e che può mimare o modulare l’azione degli

estrogeni endogeni legandosi, di norma, al recettore degli estrogeni stessi”.

I fitoestrogeni sono principalmente suddivisi in quattro classi chimiche differenti,

più o meno potenti a seconda delle somiglianze strutturali con l’estradiolo (Figura

1.6.1). Il gruppo più consistente e più studiato è rappresentato dai flavonoidi

(ulteriormente classificati in flavanoni, flavonoli, isoflavoni), a cui appartengono

composti come la genesteina, la daidzeina, la rutina, la miricetina, l’apigenina.

Elevate concentrazioni di isoflavoni sono stati riscontrati in alimenti come la soia, di

largo consumo nei paesi orientali. Meno popolate e meno indagate sono le altre

classi di fitoestrogeni: lignani (ad es. secoisolariciresinolo), coumestani (come il

coumestrolo) e calconi (tra cui la floretina). La classificazione dei fitoestrogeni può

essere integrata con una quinta classe costituita dai micoestrogeni, il cui capostipite

è lo zearalenone. Tali composti sono meno rilevanti dal punto di vista nutrizionale

poichè, essendo i prodotti di una contaminazione fungina, non sono presenti

costitutivamente negli alimenti.

I fitoestrogeni svolgono le loro azioni attraverso svariati meccanismi biologici.

Principalmente interagiscono con il recettore, modulando l’espressione dei geni

Introduzione

12

responsivi degli estrogeni. A tal proposito, Kuiper e collaboratori hanno messo in

evidenza come agiscano principalmente sul recettore β, pur non mancando una loro

azione sul recettore α.

HO

OH

O OHO

O

OHO

OH

O

O

HO

HO

I fitoestrogeni, inoltre, sono coinvolti nell’inibizione di enzimi per la sintesi e il

metabolismo degli estrogeni, nella modulazione della biosintesi degli ormoni

tiroidei, in reazioni antiossidanti e nell’inibizione di proteine chinasi.

L’osservazione che nel Sud-Est asiatico le donne presentassero una minor incidenza

di tumori ormone-dipendenti, di patologie cardiovascolari e di sintomi

classicamente legati alla menopausa incrementò l’ipotesi che un ruolo di protezione

fosse giocato dal tipo di regime alimentare e che una dieta ricca di fitoestrogeni

potesse rappresentare una possibile opzione nella prevenzione dell’osteoporosi e del

cancro.

La valutazione dell’impatto dei fitoestrogeni è complicata da alcune evidenze:

innanzitutto, molte delle relazioni sui loro effetti benefici si basano su osservazioni

epidemiologiche e non su misure dirette dell’effetto osservato. E’ necessario

sottolineare che molti dei dati raccolti da questi studi riguardano popolazioni

orientali, quindi l’estrapolazione dei risultati è inficiata da differenze genetiche,

O

O

Isoflavoni Estradiolo Coumestani

Calconi Lignani Micoestrogeni

Figura 1.6.1: Strutture chimiche dell’estradiolo e delle principali classi di fitoestrogeni

Introduzione

13

metaboliche, negli stili di vita, nella dieta. Inoltre, spesso gli studi in vivo sono

effettuati utilizzando elevate concentrazioni di fitoestrogeni e questo rende le

condizioni sperimentali non aderenti ai reali livelli di esposizione. Infine, non si può

escludere la possibilità che, in un sistema complesso come un alimento, ci siano altri

componenti attivi che contribuiscano agli effetti osservati (COT report, Foods

Standards Agency, 2003).

1.7 ENDOCRINE DISRUPTORS

Il recettore degli estrogeni è una proteina versatile, che, grazie all’elevata flessibilità

del sito attivo, è in grado di legare molti composti di natura steroidea e non. Il

termine xenoestrogeni è utilizzato per indicare tutte le sostanze chimiche esogene,

sintetiche o naturali, che mostrano, in seguito al legame con ER, attività estrogena

e/o antiestrogenica. Gli xenoestrogeni sono in grado di alterare la normale

funzionalità del sistema endocrino e riproduttivo, imitando o inibendo l’azione degli

ormoni endogeni, modulandone la produzione o alterando la popolazione

recettoriale. Proprio grazie all’abilità di questi composti di interferire con il sistema

endocrino, gli xenoestrogeni sono stati definiti “endocrine disruptors”. Infatti, dato

che ER è direttamente coinvolto nella proliferazione e differenziazione cellulare,

qualsiasi perturbazione del segnale a questo livello può contribuire allo sviluppo di

anomalie, quali infertilità e cancro.

Gli xenoestrogeni comprendono numerose classi chimiche differenti, caratterizzate

da notevoli diversità strutturali: inquinanti ambientali, ad esempio pesticidi

organoclorurati che, grazie alla loro lipofilia, sono altamente persistenti e si

accumulano nei tessuti; composti provenienti dall’industria alimentare, come

additivi e contaminanti, ad esempio plastificanti, quali ftalati e alchilfenoli, che

possono accidentalmente contaminare gli alimenti; difenilalcani, tra cui il bisfenolo

A, utilizzato nella produzione di resine.

Le evidenze sperimentali sugli effetti avversi promossi dagli xenoestrogeni sono in

continuo aumento, tanto che la Commissione Europea li ha identificati come

possibili fattori di rischio prioritari e la crescente attenzione al problema ha portato,

nel 1996, il Congresso USA ad incaricare l’autorità regolatoria EPA (Enviromental

Protection Agency) a sviluppare strategie di screening in grado di stabilire i rischi

Introduzione

14

associati all’esposizione di xenoestrogeni. Nello sviluppo del programma di

screening la commissione istituita da EPA, EDSTAC (Endocrine Disruptor Screening

and Testing Advisory Committee), ha suddiviso il progetto in tre fasi sequenziali, la

prima delle quali dovrebbe definire le priorità sperimentali. Più di 10000 composti

chimici in uso, infatti, richiederebbero studi sulla loro capacità di deregolare le

funzioni endocrine e il numero è destinato ad aumentare (Seong Jae Yu et al. 2002).

Le classiche metodologie di misura dell’attività estrogenica si basano su procedure

lunghe ed elaborate che non sono adatte allo screening di un vasto numero di

composti. E’ necessario, perciò, sviluppare metodi rapidi e a basso costo capaci di

selezionare tra gli innumerevoli composti in uso quelli potenzialmente pericolosi. La

selezione permette di diminuire notevolmente il numero di sostanze su cui effettuare

studi approfonditi di tossicità, focalizzando gli sforzi e le risorse solo ove necessario.

Tra i metodi proposti per definire le priorità operative ci sono sia approcci

sperimentali, come l’high throughput assay, sia metodologie computazionali, come

QSAR e docking, applicabili al virtual screening di potenziali xenoestrogeni (Blair

et al. 2000).

1.8 VIRTUAL SCREENING

I metodi sperimentali che consentono l’analisi di intere librerie di composti in breve

tempo sono estremamente costosi. Un approccio complementare agli studi

sperimentali è il virtual screening, un metodo computazionale in grado di selezionare,

all’interno di un database elettronico, i composti che necessitano di saggi di attività

e/o di tossicità, con lo scopo di creare nuovi farmaci o di identificare sostanze

nocive. Esistono diverse tecniche per condurre analisi computazionali, classificabili,

approssimativamente, in due categorie: ligand-based virtual screening e protein-

based virtual screening. I primi utilizzano le informazioni provenienti dallo studio

di composti che legano il target biologico per identificare altre molecole con simili

proprietà. Quando, invece, è nota la struttura tridimensionale della proteina, è

possibile eseguire il docking di ogni ligando nel sito di legame del target, predire la

conformazione con cui il composto interagisce con la proteina e stimare la bontà del

legame. Questo processo prende il nome di structure based virtual screening ed è

Introduzione

15

caratterizzato da tre fasi: preparazione dei database, docking dei diversi ligandi nel

sito della proteina e analisi postdocking (Figura 1.8.1).

La prima operazione in un virtual screening è avere a disposizione una banca dati in

cui siano raccolti i composti da analizzare.

Nell’ambito di uno studio farmaceutico il database iniziale è parzialmente ridotto

dall’applicazione di diversi filtri fisici e chimici, consentendo di eliminare a priori

composti che, in ogni modo, a causa di proprietà indesiderate, non supererebbero i

test clinici e di ridurre i tempi di calcolo. I più comuni filtri di screening si basano

sulla valutazione del peso molecolare, del bilancio idrofilo/lipofilo e del numero di

gruppi donatori/accettori di legami idrogeno, come per la legge di Lipinski. Altri

Figura 1.8.1: Fasi del processo di virtual screening (Lyne, 2002)

Introduzione

16

importanti filtri, invece, rimuovono i composti caratterizzati da gruppi funzionali

tossici o da scarsa stabilità chimica.

“In silico” screening di tipo tossicologico presentano finalità molto diverse e, di

conseguenza, una scrematura iniziale di diverso tipo, ma si tratta di un campo

ancora piuttosto inesplorato in letteratura.

Il processo di docking consiste nel riprodurre, virtualmente, l’associazione tra una

proteina e un ligando, selezionando, tra tutti quelli possibili, il complesso

energeticamente favorito. Riprodurre lo spazio conformazionale accessibile a una

macromolecola è complicato e quindi necessità di approssimazioni. In commercio

sono disponibili numerosi programmi di docking che differiscono per il tipo di

algoritmo usato, per la valutazione della flessibilità del ligando e della proteina e per

la funzione di scoring impiegata (Lyne, 2002).

Esistono numerose tecniche per valutare l’energia di legame associata a piccole

molecole nella formazione del complesso proteina ligando. In un virtual screening le

funzioni di scoring sono utilizzate, durante il processo di docking, per selezionare la

miglior conformazione della molecola all’interno del sito e, al termine del processo,

per stimare l’affinità di legame dei complessi formati dai vari ligandi del database.

Le funzioni di scoring possono essere classificate in tre categorie (Lyne, 2002):

force field-based scoring functions basate su equazioni ricavate dai principi della

meccanica classica, che cercano di rappresentare nel modo più corretto

possibile le molecole e le loro proprietà chimico-fisiche. Alcuni dei force field

più utilizzati sono Amber, Tripos e Charm;

empirical-based scoring functions in cui lo score di formazione del complesso è

ottenuto sommando i contributi relativi ai diversi tipi di interazioni non

covalenti (legame idrogeno, interazioni di van der Waals, interazioni

idrofobiche ecc…). I coefficienti assegnati ad ogni termine della somma sono

ottimizzati grazie a regressioni multilineari costruite su un set di differenti

complessi proteina-ligando ad affinità nota;

knowledge-based scoring functions costruite mediante metodi statistici. Questa

analisi non fa riferimento a misure sperimentali di affinità di legame, ma si

basa sul concetto che la frequenza di comparsa di uno specifico contatto,

nelle strutture ottenute con diffrazione dei raggi X o spettroscopia NMR,

può essere considerata indicativa del suo contributo al binding.

Spesso le scoring functions utilizzate dal programmi di docking sono inadeguate a

predire realmente l’affinità di legame proteina-ligando. Per superare questo ostacolo

Introduzione

17

una possibile strategia si basa sul concetto di consensus scoring. Tale approccio si basa

sull’utilizzo di molteplici funzioni di scoring per selezionare i ligandi più affini.

Esistono poi diverse analisi post docking per ridurre al minimo il numero di falsi

positivi che si generano tra le centinaia di risultati.

Infine, è spesso necessaria un’ispezione visuale per accertare che i ligandi siano

posizionati nel sito di legame e non in periferia, assumano una conformazione

realistica e interagiscano con i resuidi chiave del sito attivo.

Ad oggi le principali difficoltà negli studi di virtual screening si riscontrano nella

capacità di stimare correttamente l’energia di legame del complesso e, soprattutto,

nello sviluppo di algoritmi di docking che prendano in considerazione la flessibilità

proteica.

1.9 FLESSIBILITA’ E DOCKING

Le procedure di docking possono essere classificate in 3 categorie (Höltje, Sippl,

Rognan, Folkers, Molecular Modeling, 2003):

rigid body docking: sia il ligando che la proteina sono trattati come entità

rigide;

semi-flexible docking: viene presa in considerazione solo la flessibilità del

ligando;

fully flexible docking: la proteina e il ligando sono entrambi considerati

molecole flessibili.

La conformazione con cui una molecola si lega alla proteina target può essere

differente dalla conformazione che essa assume allo stato libero in soluzione. Infatti,

in soluzione, il ligando esiste in un numero di conformazioni molto maggiori

rispetto a quelle capaci di legare la macromolecola. E’ quindi di fondamentale

importanza considerarne la flessibilità conformazionale durante il processo di

docking.

L’approccio più semplice consiste nel creare, per ogni composto presente nel

database, un set di possibili conformazioni e poi nel trattare ogni conformero

generato come entità rigida nel posizionarlo all’interno del sito di legame. I più

comuni software che lavorano utilizzando insiemi conformazionali sono DOCK,

Introduzione

18

Fred e Slide. Alternativamente è possibile considerare una sola conformazione e

trattare il ligando come molecola flessibile durante il processo di docking. Una

strategia di questo tipo è il metodo di costruzione incrementale, che divide il

composto in frammenti e lo ricostruisce, per aggiunte successive, all’interno del sito

attivo. Questo metodo è utilizzato, ad esempio, dal programma FlexX e dalle

versioni più recenti di Slide e DOCK. Un’altra via per esplorare lo spazio

conformazionale all’interno del processo di docking è servirsi di algoritmi genetici,

come fanno i programmi GOLD e AutoDock, dove i conformeri derivano da

operazioni genetiche successive, quali mutazioni o crossing over.

La valutazione della flessibilità del ligando, risulta, tutto sommato, semplice rispetto

alle difficoltà di incorporare nei programmi di docking una funzione che tenga conto

della flessibilità della proteina.

1.10 LA FLESSIBILITA’ DELLE PROTEINE

Al fine di stimare quantitativamente la flessibilità delle proteine Betts and

Sternberg sovrapposero le strutture tridimensionali di uguali proteine, non

complessate, risolte da gruppi di ricerca differenti e ne calcolarono i valori di RMS

(root mean square). Mentre gli atomi di carbonio (Cα) del backbone mostravano

spostamenti compresi tra 0.1 e 0.5 Å, le catene laterali, soprattutto i resuidi di

superficie, erano caratterizzate da valori di RMS molto maggiori (Carlson, 2002).

Il sito di legame può essere caratterizzato da regioni ad alta flessibilità e da regioni

ad alta stabilità. I residui catalitici sono normalmente collocati in aree relativamente

stabili della struttura, così da mantenere la specificità del sistema. Le regioni rigide

di una macromolecola biologica sono frequentemente posizionate nelle porzioni

centrali della proteina, dove il compatto impacchettamento ne riduce la libertà di

movimento.

L’interazione tra una proteina e il suo substrato è un fenomeno ampiamente studiato

che ha prodotto numerose teorie sulle modalità di tale riconoscimento. Fischer

spiegò le relazioni strutturali tra ligando e proteina con il modello “chiave-

serratura”, in cui una molecola è adatta al legame se la sua struttura è

complementare al sito attivo biologico. Tale teoria fu superata nel 1958 da

Koshland, il quale propose un modello di “adattamento indotto” in cui il sito attivo

Introduzione

19

si mostra complementare al ligando in seguito al legame con esso. Attualmente la

tesi più accreditata descrive le proteine come molecole estremamente flessibili che

esistono, in soluzione, in diversi stati conformazionali separati l’uno dall’altro da

barriere energetiche basse (Figura 1.10.1). Entro certi limiti, una proteina è in

grado di riarrangiare la propria struttura a seconda del tipo di ligando presente.

Tale riorganizzazione può essere minima, come piccoli movimenti torsionali delle

catene laterali, o consistente, se coinvolge spostamenti di interi domini della

proteina.

Figura 1.10.1: Una proteina può esistere in differenti conformazioni, ad ognuna delle quali è associato uno stato energetico (Carlson, 2002)

Introduzione

20

1.11 INCORPORAZIONE DELLA FLESSIBILITA’ PROTEICA

NEL DOCKING

La maggior parte dei software che eseguono analisi di docking è concepita

considerando la proteina fissa nella sua conformazione cristallografica. Questa, pur

essendo una notevole approssimazione, è generalmente necessaria per non

aumentare eccessivamente la complessità e i tempi di calcolo. Per tentare di

restringere il numero di stati conformazionali da prendere in considerazione una

strategia è limitare le regioni che possono cambiare conformazione. Esistono,

infatti, alcuni programmi che modificano esclusivamente la posizione delle catene

laterali della proteina in risposta al tipo di ligando presente nel sito attivo. Per far

questo, un primo approccio può essere quello di utilizzare una libreria di rotameri

creata a partire da un insieme di stati conformazionali discreti delle catene laterali

degli amminoacidi, che derivano direttamente da studi di cristallografia ai raggi X e

di spettroscopia NMR. Sfruttando le informazioni contenute nella libreria,

l’algoritmo cerca di trovare la combinazione a minor energia tra gli amminoacidi e il

ligando, mantenendo rigidi gli atomi del backbone (Leach, 1994). Alternativamente,

programmi come SLIDE, consentono piccoli spostamenti delle catene laterali, per

minimizzare le eventuali collisioni che si generano nel posizionare un ligando in un

sito rigido. A differenza dell’approccio precedente, nel modificare l’orientamento

delle catene laterali sono prese in considerazione anche conformazioni che non

appartengono a librerie rotameriche.

Una seconda strada per incorporare la flessibilità nelle analisi di docking è di

utilizzare un programma, come FlexE, che permetta l’introduzione nell’analisi di

più strutture della stessa proteina in conformazioni diverse. L’insieme discreto delle

strutture proteiche viene sovrapposto dal software e la conformazione migliore per

l’interazione con il ligando selezionata. Le strutture tridimensionali del target

provengono da studi cristallografici e spettroscopici, ma, nel caso in cui non siano

direttamente disponibili le informazioni sperimentali, il set conformazionale può

essere generato da studi di dinamica molecolare.

Infine, un ultimo approccio parziale al complesso problema flessibilità, è il “soft

docking”. Tutti i programmi di docking contengono, all’interno del loro algoritmo,

una funzione che tiene conto degli effetti repulsivi e sterici per evitare che il ligando

si disponga in modo non realistico. Assumendo, però, che la proteina, grazie a

Introduzione

21

piccoli spostamenti, si adatta all’ingresso del ligando, nel soft docking sono tollerati

alcuni piccoli urti sterici grazie all’incremento della permissività del potenziale di

Lennard-Jones. Il principale svantaggio di questa tecnica è di essere applicabile solo

per piccoli cambiamenti conformazionali.

HINT

23

Per valutare la bontà dell’interazione di una proteina con un ligando sono

disponibili numerosi programmi di meccanica molecolare, che si basano su approcci

e strategie diverse. La maggior parte di questi è in grado di quantificare

efficacemente il contributo entalpico dovuto alle forze di interazione atomo-atomo

(legami idrogeno, forze di van der Waals, forze elettrostatiche, ecc.), ma valuta solo

parzialmente il contributo entropico dato, ad esempio, dal processo di

desolvatazione.

Nel 1991 Abraham e Kellogg hanno sviluppato il programma HINT (Hydropathic

INTeractions), con lo scopo di creare uno strumento che tenesse conto del

contributo entropico associato alla formazione di un complesso per descrivere in

modo realistico le interazioni biologiche.

2.1 IL SOFTWARE HINT

HINT è un force field cosiddetto “naturale” ed “intuitivo”, basato su misure

sperimentali di LogPo/w. Il coefficiente di ripartizione di un soluto tra le fasi 1-

ottanolo e acqua (Po/w) è una grandezza termodinamica direttamente correlata

all’energia libera di trasferimento di una molecola da un solvente all’altro e come

tale racchiude in sé informazioni sia di tipo entalpico che di tipo entropico. Le forze

che intervengono in un processo di ripartizione sono le stesse che regolano le

interazioni tra molecole biologiche. Queste ultime sono normalmente costituite da

regioni idrofobiche e da regioni idrofiliche, rispettivamente comparabili ad una fase

apolare ed una acquosa, per cui la formazione di un complesso tra una proteina ed

un ligando può essere realisticamente comparata alla ripartizione del ligando stesso

tra le fasi ottanolo ed acqua.

HINT valuta esclusivamente le interazioni non covalenti, quali legami ad idrogeno,

interazioni acido-base, attrazioni di Coulomb e interazioni idrofobiche, che sono

collettivamente definite “idropatiche” (Kellogg et al. 2000).

Ogni interazione atomo-atomo è quantificata dal force field di HINT attraverso

l’equazione:

bij = ai Si aj Sj Tij Rij + rij

HINT

24

dove:

bij è lo score attribuito all’interazione tra l’atomo i e l’atomo j. Quando b

assume valori positivi l’interazione tra i due atomi è favorevole, al

contrario valori negativi di b indicano che i e j interagiscono

sfavorevolmente;

a è la costante idrofobica atomica;

S rappresenta la superficie accessibile al solvente (SASA);

Tij è una funzione logica, che determina il segno dei valori parziali di

score;

Rij e rij sono funzioni della distanza tra l’atomo i e j.

Il punteggio finale assegnato da HINT al sistema è dato dalla somma delle

interazioni di tutte le coppie di atomi:

∑i ∑j bij = ∑i ∑j (ai Si aj Sj Tij Rij + rij)

L’ HINT score totale può essere scomposto nei singoli contributi relativi ai diversi

tipi di interazione:

HSTOT = HSHH + HSAB + HSHB + HSAA + HSBB + HSHP

Gli HINT score relativi all’effetto idrofobico (HSHH), all’interazione acido-base

(HSAB) e ai legami idrogeno (HSHB), concorrono ad aumentare il punteggio finale del

sistema, mentre i contributi dei contatti acido-acido, base-base e idrofobico-polare,

rispettivamente HSAA, HSBB, HSHP, diminuiscono lo score totale, in quanto

caratterizzati da valori negativi (Tabella 2.1.1).

La costante idrofobica atomica

Leo (Hansch et al. 1979) e Rekker (Rekker et al. 1977) furono i primi a sviluppare

un set di costanti frammentarie, sulla base di misure sperimentali effettuate negli

anni precedenti. Ogni atomo e gruppo chimico è caratterizzato da una determinata

costante e il LogP dell’intera molecola è ottenuto sommando questi contributi

parziali. Questo approccio, quindi, sfrutta il concetto di additività del LogP.

Negli anni successivi Abraham e Leo integrarono il dataset calcolando le costanti

idrofobiche frammentarie relative a molecole di natura peptidica.

HINT

25

IDROFOBICO POLARE (acido di Lewis)

POLARE (base di Lewis)

IDROFOBICO interazione idrofobica

idrofobico-polare (desolvatazione)


POLARE (acido di Lewis)


repulsione coulombiana

interazione acido-base (legame

idrogeno)

POLARE (base di Lewis)


interazione acido-base (legame

idrogeno)

repulsione coulombiana

Tabella 2.1.1: Matrice delle interazioni atomo-atomo quantificate da HINT (Kellogg et al. 2000). In turchese sono indicate le interazioni positive, in nero quelle negative.

Le costanti idrofobiche atomiche sono parametri adimensionali, ricavate da HINT

grazie a progressive riduzioni delle costanti frammentarie di Leo e adattate per

introduzione di una serie di fattori di correzione che tengono conto dell’intorno

degli atomi e delle loro connessioni.

Un atomo i è idrofobico, quindi solubile nella fase organica (1-ottanolo), quando ai

assume valore positivo, mentre è idrofilico, perciò solubile nella fase polare (acqua),

se la sua costante atomica è minore di zero. Questa regola generale è sempre valida,

tranne che per gli atomi di idrogeno polari, che, per convenzione, assumono valori

di ai sempre positivi.

La funzione logica Tij

HINT stima favorevolmente l’interazione fra due atomi i e j quando questi sono

solubili nella stessa fase, cioè quando le costanti ai e aj presentano lo stesso segno

(ai>0 e aj>0 oppure ai<0 e aj<0). Se le costanti idrofobiche atomiche dei due atomi

hanno segno opposto ( ai>0 e aj<0 oppure ai<0 e aj>0) l’associazione risulterà

sfavorita.

Esistono, tuttavia, delle eccezioni che hanno portato Abraham e Kellogg ad

introdurre un fattore di correzione, che modificasse, all’occorrenza, il segno dello

score. Si tratta della funzione logica T che assume valore +1 o -1 a seconda del tipo

di interazione.

Atomi polari della stessa natura, acidi o basi di Lewis, danno origine ad interazioni

repulsive quando si generano dei contatti acido-acido o base-base, ma il prodotto

HINT

26

delle costanti atomiche dà valore positivo. T, in questo caso, assume valore

negativo, ripristinando il reale contributo di bij. Anche per il legame ad idrogeno la

funzione logica assume valore -1, poiché si instaura un’interazione estremamente

favorevole tra un atomo polare (a<0) e un atomo di idrogeno legato ad un atomo

elettronegativo (a>0), che contribuisce positivamente allo score. In tutti gli altri

casi la funzione logica non modifica bij, assumendo sempre valore +1, come

riportato in Tabella 2.1.2.

H (apolare) [a>0]

H (polare) [a>0]

C (apolare) [a>0]

Polare (N, O,...)

[a<0]

H (apolare) [a>0] +1 -1 +1 +1

H (polare) [a>0] -1 -1 -1 -1

C (apolare) [a>0] +1 -1 +1 +1

Polare (N, O,..)

[a<0] +1 -1 +1 -1

Tabella 2.1.2: Matrice delle interazioni corrette da Tij; nero: idrofobico-idrofobico; bianco: idrofobico-polare; rosa: acido-base/legame idrogeno; blu: polare-polare. (Kellogg et al. 2001).

La superficie accessibile al solvente

La superficie accessibile al solvente (SASA) è calcolata, per molecole di piccole

dimensioni, utilizzando un probe sferico avente il raggio di van der Waals della

molecola d’acqua (1.4 Å). Per le macromolecole biologiche, invece, HINT utilizza

valori di SASA riportati in letteratura.

Le funzioni di distanza Rij e rij

Lo score attribuito all’interazione tra due atomi viene incrementato o ridotto a

seconda della distanza di legame dei due atomi interagenti. E’ possibile, infatti,

definire una distanza ottimale, alla quale si stabilisce il miglior binding possibile e

HINT

27

oltre la quale diminuisce l’affinità fra gli atomi coinvolti, a causa di un aumento delle

forze repulsive o di una riduzione dell’effetto attrattivo.

Nell’ equazione di HINT sono presenti due parametri che tengono conto delle

distanze di legame: Rij e rij.

Il primo termine descrive una funzione esponenziale tale per cui le energie di

interazione si affievoliscono all’aumentare della distanza r tra due atomi:

Rij = e-r

rij, invece, è un’implementazione del potenziale di Lennard-Jones ed apporta un

contributo negativo allo score perché identifica le interazioni repulsive che si

generano quando la distanza r è troppo piccola. L’equazione che descrive rij è la

seguente:

rij = A εij [ ( rvdw / r)12 – 2 (rvdw / r) 6]

dove A è un fattore di correzione che correla il potenziale di Lennard-Jones alla

funzione esponenziale e-r , εij rappresenta l’energia associata all’effetto di dispersione

tra i due atomi i e j e rvdw è la somma dei loro raggi di van der Waals (Abraham et

al. 1993).

2.1.1 RELAZIONE TRA LogP e ∆G°

Il coefficiente di ripartizione del soluto Po/w è la costante di equilibrio del processo

di trasferimento di un soluto dalla fase 1-ottanolo alla fase acquosa ed è correlato al

∆G° secondo l’equazione:

LogPo/w = -∆G° / 2.303 RT

dove R è la costante dei gas e T è la temperatura assoluta. Entrambe assumono

valori costanti, in condizioni normali (1 atm, 25 °C), per cui si può riscrivere:

LogPo/w = k ∆G°

HINT

28

alla temperatura di 298 K la costante k è pari a -0.733 Kcal/mol.

Come detto in precedenza il LogP è calcolato da HINT sommando le costanti

atomiche idrofobiche assegnate ai vari atomi e direttamente correlato all’energia

libera di legame tramite l’equazione:

∑ ai = k ∆G°

Da questa relazione è possibile affermare, quindi, che l’HINT score è funzione

dell’energia libera di legame e per questo contiene informazioni sia di natura

entalpica che entropica.

2.1.2 APPLICAZIONI DEL PROGRAMMA HINT

HINT è un software versatile, che può essere applicato nell’ambito dello structure

base drug design per scopi diversi:

calcolo delle costanti idrofobiche atomiche degli atomi appartenenti a ligandi

e proteine;

costruzione di mappe idrofobiche di molecole e macromolecole biologiche;

determinazione della natura chimica del sito farmacoforico di un recettore a

partire dalla struttura del ligando e viceversa;

predizione dell’affinità di legame e calcolo dello score relativo ad un

complesso biologico;

costruzione grafica della mappa d’interazioni idrofobiche e polari di un

complesso;

determinazione della struttura secondaria e terziaria di una proteina;

localizzazione dei residui suscettibili di mutazione allo scopo di individuare

interazioni idrofobiche e polari, positive e negative;

valutazione del ruolo delle molecole d’acqua presenti nelle strutture

proteiche.

Scopi della ricerca

29

Negli ultimi decenni l’attenzione del mondo scientifico nei confronti del recettore

degli estrogeni è aumentata esponenzialmente grazie alle evidenze, sempre più

stringenti, di una relazione tra gli ormoni estrogenici e l’insorgenza di neoplasie.

Attualmente gli studi sono condotti principalmente e parallelamente lungo due

filoni: da un lato si cerca di utilizzare il recettore degli estrogeni come target

farmacologico per lo sviluppo di farmaci antitumorali e post-menopausali, dall’altro

l’elevata versatilità recettoriale impone l’identificazione di sostanze che, pur

legandosi debolmente, possono mediare modificazioni endocrine a lungo termine

(xenoestrogeni).

Questo lavoro di tesi si inserisce all’interno di un progetto di ricerca più ampio,

volto alla caratterizzazione sempre più approfondita del sistema recettoriale

estrogenico e allo sviluppo di una procedura di “in silico” screening per

l’identificazione di sostanze che mimano l’azione degli estrogeni o agiscono da

antagonisti. In particolare, il lavoro qui presentato ha avuto come obiettivo l’analisi

della flessibilità di ERα tramite lo studio delle interazioni del sito di legame con

due principale tipologie di composti: agenti ad attività nota (agonisti, SERM) e

sostanze che potenzialmente possono venire a contatto con il recettore degli

estrogeni (additivi di origine alimentare). Nell’affrontare il problema della

versatilità del recettore, particolare attenzione è stata posta nell’individuazione di

un metodo che permettesse l’inserimento della flessibilità negli studi di docking su

grande scala. Il lavoro è stato così articolato in tre parti:

1. verifica della capacità dei softwares utilizzati negli studi computazionali di

riprodurre i dati sperimentali, tramite la costruzione di una retta di taratura

che correla il valore di HINT score con il ∆G° sperimentale. La retta di

regressione lineare costituisce uno strumento fondamentale nella predizione

della forza di legame di composti potenzialmente interagenti con il recettore;

2. messa a punto di un protocollo di lavoro con cui condurre le analisi di virtual

screening. In questa fase si è posta particolare attenzione alla risoluzione dei

problemi e alla definizione delle variabili che caratterizzano gli studi di un

grande numero di composti, prima fra tutte la valutazione della flessibilità

negli studi di docking. Per ottenere rapidamente risultati omogenei e

riproducibili è necessario, infatti, trovare un compromesso tra semplicità e

capacità predittiva del metodo;

3. studi predittivi di affinità per un set di additivi alimentari naturali e di sintesi

utilizzati normalmente nella produzione di alimenti.

Materiali e Metodi

Materiali e metodi

31

Le analisi computazionali eseguite in questo lavoro di tesi sono state effetuate col

supporto del software di modellistica molecolare SYBYL della Tripos Associates

(Tripos, Inc., StLouis, MO; www.tripos.com). Sybyl versione 7.0 è stato installato

sulla workstation Silicon Graphics Irix modello OCTANE, il cui sistema operativo

è IRIX 64 versione 6.5. HINT, nella versione 3.09 β-test, è stato utilizzato come

modulo aggiuntivo di Sybyl. Questo software è gentilmente fornito dal Prof. Glen

E. Kellogg dell’Institute for Structural Biology and Drug Discovery della Virginia

Commonwealth University, Richmond, VA, USA e sviluppato congiuntamente

nell’ambito del progetto di collaborazione con l’Università di Parma.

4.1 TRIPOS

Il software Sybyl contiene diversi force field di meccanica molecolare. Tra i tanti è

stato scelto Tripos, particolarmente adatto all’analisi di composti differenti sia dal

punto di vista chimico che da quello strutturale (Clark et al., 1989). In una

procedura computazionale eseguita con un programma di meccanica molecolare, ad

ogni atomo viene assegnato un atom type descritto nel force field. Nella versione 6.5

di Tripos sono presenti 53 atom types differenti, caratterizzati dal punto di vista della

valenza, della geometria, del raggio di van der Waals e della carica formale degli

atomi. Esistono, inoltre, otto tipi diversi di bond types, cinque dei quali rappresentano

i legami classici come il legame singolo, doppio, triplo, amidico e aromatico, mentre

gli altri tre (dummy, unknown e not connected) sono legami atipici o non riconosciuti.

L’avere a disposizione un numero di atom type limitato costituisce

un’approssimazione rispetto alla realtà, che è molto più variegata, per cui non è

sempre possibile caratterizzare tutti gli atomi nel modo più adeguato.

Materiali e metodi

32

4.2 ANALISI DI COMPLESSI CRISTALLOGRAFICI

PROTEINA-LIGANDO-ACQUA: PROTOCOLLO DI LAVORO

1. Ricerca della struttura cristallografica

Le strutture tridimensionali dei complessi proteina-ligando analizzate in questo

lavoro di tesi derivano da studi di diffrazione ai raggi X. I file provengono dalla

Brookhaven Protein Databank (PDB), che raccoglie strutture tridimensionali di

macromolecole biologiche; ad oggi sono depositate presso questa banca dati quasi

35000 strutture ottenute non solo tramite raggi X, ma anche attraverso tecniche di

NMR e di diffrazione a neutroni. Ogni struttura è contraddistinta da un codice. Una

volta identificato il codice corrispondente al complesso desiderato i file PDB sono

importati in Sybyl per essere studiati e analizzati.

2. Controllo degli atom name e atom type dei residui terminali della proteina

Il valore di HINT score relativo all’interazione proteina-ligando è influenzato da

tutti i residui amminoacidici compresi nell’intorno di 10 Å dal sito catalitico.

Nell’ipotesi in cui anche i residui terminali amminico e carbossilico siano inclusi in

questo intorno occorre controllare che lo stato di ionizzazione sia tale da avere

un’estremità amminica carica positivamente (ione ammonio) e un’estremità

carbossilica carica negativamente (ione carbossilato). Questa operazione permette di

utilizzare un modello più aderente alla realtà fisiologica.

3. Correzione degli atom type e dei bond type del ligando

I file PDB non contengono informazioni relative alla natura e all’ordine dei legami

fra i diversi atomi, per cui è probabile che il force field assegni atom type e bond type

errati e che la molecola risultante non corrisponda esattamente alla struttura

riportata in letteratura.

4. Addizione degli atomi di idrogeno

Le strutture cristallografiche risolte ai raggi X contengono informazioni sulla

posizione degli atomi “pesanti” (come ossigeno, carbonio, zolfo, azoto, alogeni, ecc..),

ma non danno indicazioni sulla localizzazione degli atomi di idrogeno, la cui densità

elettronica è troppo bassa per essere rilevata con precisione. Gli atomi di idrogeno

vengono quindi aggiunti mediante un opzione del programma.

Materiali e metodi

33

5. Minimizzazione degli idrogeni

Sybyl addiziona gli idrogeni sugli atomi “pesanti” senza tenere conto delle

interazioni repulsive e attrattive o degli eventuali ingombri sterici tra gli atomi. Il

processo di minimizzazione permette di abbassare l’energia associata al complesso

proteina-ligando, in modo da generare un modello dove le interazioni degli idrogeni

con gli altri atomi sia minima. La posizione degli idrogeni è ottimizzata scegliendo

il comando Minimize dal menù Compute di Sybyl.

Il processo di minimizzazione dipende da molteplici parametri. Le condizioni

standard utilizzate in questo lavoro di tesi sono:

Method → Powell, Simplex

Simplex opera l’ottimizzazione iniziale, mentre Powell calcola le derivate

prima e seconda, così da stabilire l’effettiva posizione dei minimi.

Gradient → 0.5

E’ un parametro limite e indica il valore che deve assumere la derivata prima.

Charge → Gasteiger-Huckel

E’ il metodo con cui vengono assegnate le cariche atomiche.

Iteration → 1500

Indica il numero massimo di cicli di minimizzazione che possono essere

effettuati.

Il processo di minimizzazione coinvolge solo gli atomi di idrogeno, tutti i rimanenti

atomi devono rimanere fissi nelle loro posizioni determinate cristallograficamente.

Tramite l’opzione Aggregate, tutti gli atomi “pesanti” vengono inclusi in un insieme

che resta escluso dal processo.

6. Rotazione degli idrogeni ossidrilici del ligando

Durante il processo di minimizzazione gli atomi di idrogeno possono rimanere

intrappolati in un minimo energetico relativo e l’orientazione assunta dagli idrogeni

del ligando può non essere ottimale per l’interazione con il sito catalitico della

proteina. La mancanza, ad esempio, di un legame idrogeno tra una molecola e una

proteina, dovuta ad un’errata orientazione degli atomi, può portare ad riduzione del

valore di HINT score proteina-ligando e quindi ad una sottostima dell’affinità di

legame. E’ necessario, a volte, ruotare manualmente i legami tra gli atomi così da

ottenere posizioni più realistiche. Nei complessi presi in esame in questo lavoro di

Materiali e metodi

34

tesi è stato a volte necessario ruotare i gruppi ossidrilici del ligando per favorire le

interazioni con i residui chiave della proteina.

7. Divisione in aree

Un file PDB è composto da più oggetti: la macromolecola biologica, il ligando, le

molecole d’acqua ed eventuali metalli e cofattori. Sybyl ragiona secondo il concetto

di aree differenti in cui è possibile isolare ognuna di queste componenti. Le diverse

strutture possono essere visualizzate una alla volta oppure contemporaneamente,

pur rimanendo confinate ognuna nella propria area di appartenenza.

La divisione in aree è necessaria per il calcolo del Log P. HINT, infatti, partiziona il

contenuto di ogni area ed è quindi indispensabile che ognuna di esse sia occupata da

un solo tipo di struttura. Come procedura operativa, collochiamo la proteina

nell’area M1, il ligando nell’area M2 e le molecole d’acqua nell’area M3. Ad ogni

area è attribuito un nome specifico in modo che HINT la possa riconoscere

selettivamente.

8. Calcolo del Log P della proteina

Prima di procedere alla stima dell’HINT score occorre calcolare il coefficiente di

ripartizione ottanolo/acqua di proteina, ligando e molecole d’acqua. Dai valori di

Log P HINT determina le costanti idrofobiche atomiche necessarie per il calcolo

dello score.

Per le macromolecole, come le proteine si utilizza l’opzione Dictionary. Tale opzione,

pur essendo un’approssimazione permette di calcolare velocemente e con buona

precisione il Log P di molecole complesse, utilizzando un dizionario che associa ad

ogni atomo un valore di Log P prestabilito.

La misura del Log P è influenzata anche dalle condizioni del solvente. Esistono

quattro differenti possibilità di trattamento del solvente: acid, basic, neutral e inferred.

E’ stata utilizzata l’opzione neutral, che dovrebbe riprodurre al meglio le condizioni

fisiologiche. Ne deriva che i residui aspartato e glutammato saranno carichi

negativamente, mentre lisina e arginina positivamente. Il Log P può essere

calcolato in funzione di tutti gli idrogeni presenti (opzione All), solo di quelli legati

ad atomi pesanti polari (opzione Essential) o facenti parte degli atomi pesanti stessi

(opzione United). Gli idrogeni dei complessi analizzati sono stati trattati utilizzando

l’opzione Essential.

Materiali e metodi

35

L’opzione +20-NH-SASA è un fattore di correzione che viene selezionato per

evitare che HINT sottostimi la capacità del gruppo amidico, impegnato nel legame

peptidico, di formare legami ad idrogeno.

9. Calcolo del Log P del ligando

La partizione del ligando è analoga a quella della proteina. Non viene utilizzata

l’opzione Dictionary, ma l’opzione Calculate essendo la molecola di dimensioni molto

minori. HINT analizza accuratamente gli atom type e i bond type del ligando e

calcola il LogP sulla base delle connessioni fra i vari atomi della molecola, dando un

risultato meno approssimayo rispetto a quello ottenuto nella partizione della

proteina.

10. Ottimizzazione delle molecole d’acqua

All’interno di una struttura cristallografica alcune molecole d’acqua possono

rivestire un’importanza maggiore di altre. Queste molecole sono generalmente

localizzate all’interfaccia del complesso e possono, talvolta, svolgere un ruolo

essenziale per l’interazione proteina-ligando. Si utilizza HINT per individuare ed

ottimizzare automaticamente le molecole d’acqua posizionate all’interno di un certo

range di distanza dalla proteina e dal ligando. E’ possibile anche in questo caso

impostare alcuni restrizioni:

Contact distance → 4 Å

Permette di ottimizzare solo le acque che si trovano ad una distanza

massima di 4 Å sia dal ligando che dalla proteina.

Traslation Limit → 0.1 Å

Impone che lo spostamento dell’atomo di ossigeno dell’acqua non sia

superiore a 0.1 Å, così da non alterare significativamente i dati

cristallografici.

11. Calcolo dell’HINT score

Viene calcolato l’HINT score relativo all’interazione proteina-ligando o ligando-

acqua. Nel calcolo dell’HINT score è possibile scegliere quali forze considerare e

quali escludere; si possono valutare, ad esempio, i contributi idrofobici e trascurare

quelli idrofilici o viceversa. Nell’analisi dei complessi cristallografici, analizzati in

questo lavoro di tesi, tutte le forze coinvolte (legami a idrogeno, interazioni

Materiali e metodi

36

acido/base, interazioni idrofobiche, interazioni acido/acido, interazioni base/base,

interazioni idrofobico/polare) rientrano nello score finale assegnato da HINT.

Il valore complessivo dell’HINT score ed i contributi relativi ad ogni tipo di

interazione sono riportati, in modo analitico, nel tab file corrispondente, nel quale

sono individuabili anche le costanti atomiche, le superfici accessibili al solvente, le

interazioni instaurate da ogni atomo, la distanza tra gli atomi e il loro raggio di van

der Waals.

L’HINT score finale è dato dalla somma dell’HINT score relativo all’interazione

proteina-ligando e di quello associato all’interazione ligando-acqua. Il valore

complessivo è messo in relazione con l’energia di legame determinata

sperimentalmente.

4.3 DOCKING DI COMPLESSI CRISTALLOGRAFICI:

PROTOCOLLO DI LAVORO

Simulazioni di docking sono state effettuate su complessi cristallografici proteina-

ligando al fine di verificare l’effettiva validità dei software sul sistema oggetto di

studio. I ligandi sono stati estratti dalla proteina e successivamente rinseriti tramite

procedure di docking. La sovrapposizione tra il complesso generato dal programma

e quello cristallografico fornisce una stima diretta della precisione con cui il

software posiziona la molecola all’interno del sito di legame.

1. Docking

Per effettuare le simulazioni di docking è stato utilizzato il programma GOLD

versione 2.2 (CCDC, Cambridge, UK). Tale software è stato installato su un dual

pentium processor, il cui sistema operativo è Linux Red Hat Enterprise 3.0.

I parametri che controllano l’algoritmo genetico di GOLD, sono stati mantenuti

come stabiliti di default dal programma stesso. Il numero totale delle operazioni

effettuate dall’algoritmo è 100.000, mentre il numero delle “isole” e degli “individui”

è fissato rispettivamente a 5 e 100. La “niche size” è fissata a due, mentre il

crossover, la mutazione e la migrazione rispettivamente a 95, 95 e 10. Il box del

docking viene costruito a partire dalle coordinate di un punto localizzato al centro

Materiali e metodi

37

del sito di legame, impostando come raggio una distanza di 20 Å. GOLD genera di

default 10 conformeri per ogni ligando utilizzato. Questo parametro è stato

incrementato da 10 a 50, così da consentire una migliore esplorazione dello spazio

conformazionale.

2. Analisi idropatica

I 50 conformeri generati da GOLD sono stati analizzati con HINT, portando ad

individuare il conformero con il miglior punteggio.

4.4 DOCKING DI ADDITIVI ALIMENTARI: PROTOCOLLO DI

LAVORO

1. Ricerca degli additivi alimentari

Gli additivi alimentari presi in esame sono classificati nel database sviluppato da

JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives), consultabile on

line al sito http://apps3.fao.org/jecfa/additive_specs/foodad-q.jsp. Tale

commissione è nata da una collaborazione tra FAO (Food and Agriculture

Organization of the United Nations) e WHO (World Health Organization)

nell’ambito del programma internazionale sulla salute alimentare. Ad oggi JECFA

ha analizzato e classificato più di 1500 additivi. Il database è suddiviso in categorie

funzionali, cioè in base all’utilizzo degli additivi stessi. Ogni sostanza è

accompagnata da una scheda descrittiva che contiene informazioni generali

sull’additivo e sulle sue proprietà chimico-fisiche, inoltre è riportata la struttura

bidimensionale del composto.

E’ possibile consultare on-line anche la banca dati creata da FDA (Food and Drug

Administration), che contiene più di 3000 sostanze direttamente addizionate ai cibi.

Il database EAFUS (“Everything” Added to Food in the United States) non è stato

utilizzato a fini di questo lavoro, in quanto non sono riportate le strutture chimiche

bidimensionali dei composti classificati.

Materiali e metodi

38

2. Preparazione del ligando

Le strutture tridimensionali dei ligandi sono state costruite con Sybyl. Gli idrogeni

vengono aggiunti e minimizzati, come descritto in precedenza per le proteine, con la

sola differenza che tutti gli atomi, non solo quelli di idrogeno, sono sottoposti ad un

processo di minimizzazione.

3. Procedura di docking

Il docking dei ligandi è stato effettuato analogamente a quanto descritto

precedentemente per i complessi cristallografici.

4. Analisi dei conformeri generati

La scoring function di GOLD seleziona tra gli innumerevoli conformeri generati i

50 caratterizzati da più alto valore energetico. Successivamente, l’interazione tra la

proteina target ed i 50 conformeri generati è stata valutata utilizzando il force field

di HINT. Alla fine sarà possibile valutare e confrontare con particolare attenzione i

due conformeri scelti dalla funzione di scoring di GOLD e da HINT.

GRID

Grid, versione 22a è stato installato sulla workstation Sgi modello FUEL.

Grid è un software di modellistica molecolare progettato da Goodford nei primi

anni ottanta (Goodford et al. 1985). Questo software si basa sull’utilizzo di una

sonda (probe), che ispeziona virtualmente il sito attivo di una proteina individuando

le posizioni energeticamente e stericamente compatibili con il probe stesso. I probe

utilizzabili sono molteplici e possono essere costituiti da atomi, piccole molecole o

da porzioni di esse. In particolare, in questo lavoro di tesi, sono stati impiegati un

probe idrofobico (Dry), un probe donatore (N1) e un probe accettore di legami

idrogeno (O), al fine di delineare con maggior precisione le caratteristiche chimiche

del sito di legame della proteina.

Grid opera attraverso la generazione di una griglia energetica che delimita lo spazio

all’interno del quale il probe si può muovere. In ogni punto della griglia viene

calcolata l’energia potenziale Ex,y,z, la cui entità dipende da tre diversi contributi

secondo l’equazione:

Materiali e metodi

39

Ex,y,z = ∑ Elj + ∑ Eel + ∑ Ehb

Elj rappresenta il potenziale di Lennard-Jones, Eel aggiunge il contributo delle

ineterazioni elettrostatiche e Ehb quello dei legami idrogeno. I punti in cui l’energia

è positiva o negativa vengono visualizzati graficamente da Contour Create in Sybyl,

attraverso l’opzione Map Contours del sottomenù Hint.

Risultati e Discussioni

Risultati e discussioni

41

Per verificare la validità dell’associazione tra il programma di docking GOLD e la

funzione di scoring HINT, utilizzati in questo lavoro di tesi per studiare il sistema

degli estrogeni, ligandi cristallografici, appartenenti a classi strutturali differenti,

sono stati estratti e poi reinseriti all’interno della proteina. La sovrapposizione tra il

complesso prescelto da HINT e quello cristallografico fornisce una stima della

precisione con cui il ligando è posizionato all’interno del sito di legame dalla

procedura di docking. Il parametro che permette di quantificare l’abilità della

tecnica utilizzata nel riprodurre il dato cristallografico è l’r.m.s. (root mean square).

Nella Tabella 5.1 sono riportate le misure di r.m.s. e i codici PDB dei complessi

cristallografici analizzati. Valori di r.m.s. inferiori a 2.0 Å sono considerati indicativi

di una buona capacità predittiva (Kontoyianni et al. 2004 e Brooijmans et al. 2003).

Ligando Codice PDB r.m.s. (Å)

Estradiolo 1ERE 0.20

Genisteina 1X7E 0.20

Dietilstilbestrolo 3ERD 0.26

4-OH tamoxifene 3ERT 1.43

Raloxifene 1ERR 1.46

1SJ0 0.66

1XP1 0.28

1XP6 0.68

1XP9 0.32

Ligandi benzotiopiranici

1XPC 1.47

1YIN 0.54 Ligandi benzopiranici

1YIM 0.95

Tabella 5.1: Valori di r.m.s dei complessi cristallografici analizzati


42

5.1 FLESSIBILITA’ DEL RECETTORE DEGLI ESTROGENI

L’elevata flessibilità del recettore degli estrogeni è l’elemento chiave che ha

permesso di discriminare l’azione agonista da quella antagonista, portando allo

sviluppo di una classe di farmaci di grande interesse terapeutico come i SERM. Per

lo stesso motivo, però, il recettore si presta al legame di molteplici composti di

natura chimica anche molto varia, i quali possono mediare una perturbazione degli

equilibri endocrini.

Gli studi di docking, come esposto precedentemente, sono in parte limitati

dall’assenza di tecniche che trattino in modo esaustivo la flessibilità delle proteine.

In un precedente lavoro di tesi si è cercato di tenere conto della versatilità del

recettore tramite un approccio differente da quelli trattati nel capitolo introduttivo.

Per superare il problema della flessibilità, i processi di docking sono stati compiuti

utilizzando quattro conformazioni caratteristiche del recettore: 1ERE, 3ERD,

1ERR e 3ERT. Le prime due sono in complesso con agonisti, rispettivamente

estradiolo e dietilstilbestrolo, mentre le altre sono legate a SERM, rispettivamente

raloxifene e tamoxifene. A queste due classi principali, agonisti e SERM, sono

associate le due conformazioni limite del recettore, caratterizzate da un evidente

differenza nell’orientazione dell’elica 12 (Figura 1.4.1). All’interno di ognuna delle

due categorie esistono molteplici popolazioni conformazionali, selezionate dai

ligandi stessi, che differiscono tra loro per modesti spostamenti degli amminoacidi e

non per variazioni di interi domini. Ad esempio, la conformazione selezionata dal

raloxifene si diversifica da quella imposta dal tamoxifene nell’orientazione dell’His

524, uno dei residui chiave del sito di legame (Figura 5.1.1). All’interno di questo

lavoro di tesi sono stati effettuati studi di docking incrociato per indagare l’effettiva

necessità di utilizzare quattro conformazioni differenti del recettore. Tramite il

programma GOLD il raloxifene è stato introdotto nella struttura 3ERT e il

tamoxifene nel recettore 1ERR; analogamente è avvenuto lo scambio tra estradiolo

e dietilstilbestrolo. Gli score ottenuti per i nuovi complessi si discostano in modo

poco significativo da quelli relativi ai complessi cristallografici. Questo ha fatto

ipotizzare che l’utilizzo di quattro conformazioni recettoriali sia superfluo nella

prospettiva del virtual screening. In questo studio, quindi, la flessibilità è stata

inserita nelle analisi di docking prendendo in considerazione solo le due

conformazioni limite. In particolare, gli agonisti sono stati inseriti nella

conformazione recettoriale corrispondente, viceversa, composti simil raloxifene


43

sono stati introdotti nella struttura di riferimento per i SERM. Per le sostanze il cui

profilo di attività è ancora sconosciuto sono stati compiuti, parallelamente su

entrambe le conformazioni, studi predittivi di affinità.

Utilizzando solo le due conformazioni limite, ovviamente, le informazioni relative ai

piccoli spostamenti vengono perse. Questa approssimazione si rende necessaria

nella prospettiva di messa a punto di un protocollo di screening virtuale, per

limitare la complessità del sistema. E’ accettabile considerando che lo scopo

dell’indagine è la predizione di legame su larga scala di molecole sconosciute dalle

svariate caratteristiche chimiche, per le quali è desiderabile, ma non necessario,

apprezzare variazione di energia al di sotto di una Kcal/mole. Studi di dinamica

(Sivanesan et al. 2005) e analisi computazionali di docking (Anstead et al. 1997)

hanno dimostrato, inoltre, che il legame idrogeno tra un ossidrile e l’His apporta

all’energia libera di legame un contributo di 0.6 Kcal/mol, molto inferiore rispetto

Figura 5.1.1: Sovrapposizione dei quattro amminoacidi essenziali che costituiscono il sito di legame di ERα per i complessi 1ERR (verde), 3ERT (rosso) e 1XPC (giallo). Gli amminoacidi si orientano in maniera simile in tutti e tre i siti e le variazioni più marcate si osservano a carico dell’istidina.


44

all’apporto fornito dal legame idrogeno tra l’anello fenolico e il Glu353 (1.9

Kcal/mol).

Quando le differenze tra le conformazioni sono esigue la risoluzione della struttura

cristallografica assume maggiore peso nella capacità di discriminare la disposizione

degli amminoacidi e non sempre è possibile disporre di cristalli ad elevata

risoluzione. Utilizzare un numero limitato di strutture ad alta risoluzione, quindi,

permette anche di ridurre al minimo gli errori che dipendono esclusivamente dalla

qualità della tecnica cristallografica, che varia da laboratorio a laboratorio.

Per descrivere l’attendibilità di una struttura cristallografica, oltre alla risoluzione,

si possono considerare i valori di B factor associati ad ogni atomo della proteina. Il

fattore B misura quantitativamente la dispersione della nuvola elettronica intorno

alla posizione media definita cristallograficamente. Tanto maggiore è tale valore

tanto più la reale collocazione dell’atomo oscillerà intorno al punto medio. Valori

elevati di B factor, inoltre, possono dipendere dalla flessibilità della proteina. Infatti,

se la mobilità delle catene laterali è considerevole, sarà più difficile localizzarne con

esattezza la posizione.

Sono stati analizzati i valori di B factor degli amminoacidi chiave del sito di legame

(Asp 351, Glu 353, Arg 394, His 524) del recettore ERα in complesso con diversi

SERM. E’ interessante notare come in tutti i casi considerati la posizione dell’His

524 è quella maggiormente indeterminata, in quanto presenta sempre valori

superiori al B factor medio della proteina. Queste osservazioni suggeriscono che la

catena laterale dell’istidina è particolarmente flessibile e per questo è ostacolata la

sua precisa collocazione. Questa ipotesi è supportata anche da studi di dinamica

molecolare presenti in letteratura. (Sivanesan et al. 2005). A titolo di esempio sono

riportati i dati di B factor relativi al recettore complessato con il raloxifene, che, tra

tutte le strutture cristallografiche analizzate, mostra per gli atomi dell’His 524 i

valori più elevati (Tabella 5.1.1).


45

ATOM 321 N ASP A 351 72.157 39.696 77.119 1.00 35.11 N ATOM 322 CA ASP A 351 72.290 40.545 78.304 1.00 36.10 C ATOM 323 C ASP A 351 72.844 41.893 77.939 1.00 35.62 C ATOM 324 O ASP A 351 72.436 42.969 78.394 1.00 38.03 O ATOM 325 CB ASP A 351 73.103 39.895 79.385 1.00 40.28 C ATOM 326 CG ASP A 351 72.367 38.694 79.969 1.00 46.03 C ATOM 327 OD1 ASP A 351 71.138 38.538 79.792 1.00 45.88 O ATOM 328 OD2 ASP A 351 73.077 37.876 80.611 1.00 50.85 O ATOM 340 N GLU A 353 72.544 43.238 74.999 1.00 33.29 N ATOM 341 CA GLU A 353 71.499 43.911 74.219 1.00 31.62 C ATOM 342 C GLU A 353 70.418 44.405 75.151 1.00 32.31 C ATOM 343 O GLU A 353 69.862 45.515 74.941 1.00 32.80 O ATOM 344 CB GLU A 353 70.860 43.063 73.155 1.00 30.74 C ATOM 345 CG GLU A 353 71.816 42.499 72.106 1.00 30.48 C ATOM 346 CD GLU A 353 70.998 41.652 71.156 1.00 31.15 C ATOM 347 OE1 GLU A 353 70.769 40.458 71.381 1.00 34.21 O ATOM 348 OE2 GLU A 353 70.594 42.166 70.133 1.00 31.47 O ATOM 691 N ARG A 394 67.241 41.531 61.306 1.00 41.14 N ATOM 692 CA ARG A 394 68.609 41.594 60.787 1.00 38.26 C ATOM 693 C ARG A 394 69.005 40.350 60.060 1.00 40.13 C ATOM 694 O ARG A 394 70.050 40.371 59.402 1.00 44.10 O ATOM 695 CB ARG A 394 69.669 42.039 61.742 1.00 36.59 C ATOM 696 CG ARG A 394 70.204 41.076 62.746 1.00 34.20 C ATOM 697 CD ARG A 394 70.465 41.819 64.103 1.00 28.97 C ATOM 698 NE ARG A 394 70.926 40.678 65.024 1.00 28.34 N ATOM 699 CZ ARG A 394 70.320 40.727 66.245 1.00 27.62 C ATOM 700 NH1 ARG A 394 69.464 41.713 66.453 1.00 19.82 N ATOM 701 NH2 ARG A 394 70.587 39.885 67.213 1.00 25.67 N ATOM 1636 N HIS A 524 61.659 27.262 76.658 1.00 64.23 N ATOM 1637 CA HIS A 524 62.914 26.551 76.369 1.00 68.36 C ATOM 1638 C HIS A 524 64.007 27.149 77.237 1.00 68.67 C ATOM 1639 O HIS A 524 64.733 26.419 77.903 1.00 66.17 O ATOM 1640 CB HIS A 524 63.178 26.544 74.894 1.00 71.77 C ATOM 1641 CG HIS A 524 64.579 26.275 74.474 1.00 76.25 C ATOM 1642 ND1 HIS A 524 65.129 26.831 73.329 1.00 77.80 N ATOM 1643 CD2 HIS A 524 65.544 25.505 75.037 1.00 78.01 C ATOM 1644 CE1 HIS A 524 66.375 26.406 73.210 1.00 79.59 C ATOM 1645 NE2 HIS A 524 66.650 25.604 74.228 1.00 80.79 N

Tabella 5.1.1: Valori di B factor per il recettore 1ERR. La risoluzione della struttura cristallografica è 2.6 Å. In arancione sono riportati i valori per ogni singolo atomo costituente gli amminoacidi coinvolti nel binding con il ligando. Gli atomi dell’His 524 presentano un B factor medio pari a 73.18, notevolmente superiore al B factor medio degli atomi della proteina pari a 53.8. Questo significa che l’istidina potrebbe trovarsi nel raggio di circa 1 Å dalla posizione indicata cristallograficamente.


46

5.2 ANALISI PRELIMINARI

Prima di procedere con le analisi computazionali è stato necessario definire le

condizioni operative con cui condurre le indagini per rendere i risultati attendibili,

omogenei e riproducibili. In particolare, la caratterizzazione di due variabili è stato

oggetto di un attento studio:

scelta delle strutture cristallografiche con cui condurre le procedure di

docking;

determinazione del contributo apportato dalla molecola d’acqua conservata

nel binding con il ligando.

5.2.1 SCELTA DELLA STRUTTURA CRISTALLOGRAFICA DEL

RECETTORE

Esistono numerose strutture cristallografiche del recettore degli estrogeni in

complesso con svariati ligandi. Per condurre simulazioni di docking verosimili e

confrontabili occorre selezionarne due (una per gli agonisti e una per i SERM) a cui

riferirsi per ogni analisi. In entrambi i casi la scelta è ricaduta sul complesso

cristallografico a più alta risoluzione. I SERM sono stati introdotti nella struttura

1XPC (Blizzard et al 2005), caratterizzata da un’ottima risoluzione (R = 1.6 Å) e dai

migliori valori di B factor. Il sito di legame è stato sovrapposto con il sito dei

complessi ERα-raloxifene (1ERR) e ERα-tamoxifene (3ERT), al fine di

determinarne le differenze (Figura 5.1.1). L’unica variazione interessante riguarda la

posizione dell’His 524, sostenendo ulteriormente l’ipotesi che, trovandosi in una

zona flessibile, i suoi piccoli spostamenti siano condizionati dal tipo di ligando, ma

trascurabili in una prospettiva di screening su larga scala. Per quanto riguarda gli

agonisti, è stata preferita la conformazione recettoriale selezionata dal

dietilstilbestrolo (3ERD, Shiau et al. 1998), risolta a 2.0 Å, piuttosto che il

complesso dell’estradiolo (1ERE), caratterizzato da bassa risoluzione (R = 3.1 Å). In

questo caso la sovrapposizione dei siti di legame mostra variazioni ancora più

piccole. Essendo le due conformazioni confrontabili è giustificata la scelta della

struttura a miglior risoluzione.


47

5.2.2 RUOLO DELLA MOLECOLA D’ACQUA CONSERVATA

I composti che accedono al sito di legame interagiscono, oltre che con i quattro

amminoacidi chiave, con una molecola d’acqua situata tra il Glu 353 e l’Arg 394

(Brzozowski et al. 1997), che non è spiazzata dall’ingresso del ligando e come tale è

conservata in tutti i complessi cristallografici.

Studi precedenti, condotti in questo laboratorio, hanno dimostrato che nel sistema

recettoriale degli estrogeni il contributo all’energia di legame apportato da questa

specifica molecola d’acqua è poco rilevante, come si osserva nei due grafici sotto

riportati. Le rette con e senza il contributo della molecola d’acqua, ottenute

analizzando 6 ligandi cristallografici e 27 ligandi ad affinità nota, sono

caratterizzate dai seguenti valori: R = 0.53, R2 = 0.28 ed errore standard = 1.9

Kcal/mol, per il Grafico 5.2.1; R = 0.56, R2 = 0.31 ed errore standard=1.85

Kcal/mol per il Grafico 5.2.2.

Generando la superficie di Connolly, è stato, inoltre, osservato che la molecola

d’acqua conservata è sepolta in una cavità del recettore, dalla quale contrae

interazioni con la proteina e, più difficilmente, con il ligando, poichè non riesce ad

esporsi completamente all’interno del sito di legame (Figura 5.2.1).

Figura 5.2.1: Superficie di Connolly della cavità di legame del complesso 1XPC. La molecola d’acqua conservata è esclusa dal sito di legame.


48

HSpl

1000 2000 3000 4000

∆G°

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

Grafico 5.2.1: Correlazione tra ∆G° e HINT score proteina-ligando per un set di 33 composti.

Grafico 5.2.2: Correlazione tra ∆G° e HINT score proteina-ligando-acqua per un set di 33 composti.

HSpl+lw

1000 2000 3000 4000

∆ G°

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6


49

A partire da queste considerazioni tutte le molecole d’acqua, comprese quelle

conservate, sono state escluse dal recettore nelle analisi di docking. Tale

approssimazione permette di ridurre i tempi delle simulazioni computazionali e di

eliminare un’ulteriore variabile che, se non significativa, può essere fonte di errori.

5.3 DOCKING DI SERM E AGONISTI

Il Grafico 5.2.1 mostra la correlazione tra HINT score proteina-ligando e ∆G°

sperimentale ottenuta per un set di composti a cui appartengono sia agonisti che

SERM. Gli studi sono stati compiuti utilizzando più conformazioni del recettore e

per ogni composto è stata scelta, per confronto con i ligandi cristallografici, la

struttura più idonea. Questo approccio oltre che rallentare i tempi delle analisi,

rende, come spiegato in precedenza, i risultati poco confrontabili, in quanto si affida

a qualità risolutive anche molto diverse.

Per rendere omogenee le analisi, il docking dei 33 composti è stato ripetuto

utilizzando la struttura 3ERD per gli agonisti e 1XPC per gli agonisti parziali. La

nuova correlazione è mostrata nel Grafico 5.3.1. La retta non si discosta di molto da

quella del Grafico 5.2.1, presentando valori di correlazione leggermente migliori: R

= 0.58, R2 = 0.34, errore standard = 1.85 Kcal/mol.

Per affrontare uno studio di virtual screening occorre avere a disposizione una retta

di taratura solida che validi il metodo di analisi nei confronti del sistema oggetto di

studio. Per queste ragioni una parte di questo lavoro di tesi è stata dedicata allo

studio della correlazione tra HINT score e ∆G° sperimentale. Ai 33 composti già

analizzati ne sono stati aggiunti altri 19 appartenenti a classi chimiche e funzionali

differenti, di cui 8 cristallografici e 11 ad affinità nota. E’ stata prestata particolare

attenzione nella selezione dei ligandi, in modo da costituire un set di composti

eterogeneo e rappresentativo delle varibilità chimiche attualmente più indagate.

Nell’analisi sono stati inseriti: ligandi cristallografici (SERM), agonisti steroidei,

agonisti non steroidei, fitoestrogeni e inquinanti. Le strutture chimiche delle

sostanze utilizzate sono riportate nella Tabella 5.3.1.


50

Composto(a) Struttura Riferimento Categoria

1SJO O

S

ON

OH

HO

Kim et al. (2004) SERM

1XP1 O

S

O

OH

HO

N

Blizzard et al. (2005) SERM

1XP6 O

S

O

OH

HO

N


1XP9 O

S

O

OH

HO

N


1XPC O

S

O

OH

HO

N


1YIM O

O

OH

HO

N

Tan et al. (2005) SERM

1YIN O

O

OH

HO

N

F

Tan et al. (2005) SERM


51

1X7E O

CN

OH

HO

Manas et al. (2004) Agonista

Rutina O

OOH

HO

OH

OH

OH

Blair et al. (1999) Fitoestrogeno

Tamoxifene

O

N

Blair et al. (1999) SERM

Estriolo H H

OH

OHCH3

H

HO

Blair et al. (1999) Agonista

Moxestrolo

HO

OH

H3COCH3


Bisfenolo A HO OH

CH3

CH3 Blair et al. (1999) Inquinanate

Metilestriolo H H

OH

OHCH3

H

H3CO



52

Estrone H H

CH3

H

HO

O


Miricetina O

OOH

HO

OH

OH

OH

OH

Blair et al. (1999) Fitoestrogeno

Zearalanone OHO

HO

O

H3C

O

Blair et al. (1999) Micoestrogeno

Betazearalenolo OHO

HO

O

H3C

OH

Blair et al. (1999) Micoestrogeno

Andronstandiolo H H

OHCH3

HCH3

HHO


Tabella 5.3.1: Strutture chimiche relativi ai 19 composti analizzati tramite procedure di docking. (a) Per alcuni ligandi è riportato il codice PDB nel complesso con il recettore.


53

HSpl

1000 2000 3000 4000

∆G°

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

Gli algoritmi genetici, come GOLD, sono molto efficienti nell’identificare il minimo

energetico globale associato alla conformazione del ligando più stabile all’interno

del sito di legame, ma non sono altrettanto abili nel ricercare i minimi energetici

locali associati a piccoli spostamenti dei singoli gruppi funzionali (Morris et al.

1998). E’ stata quindi necessaria un’analisi post-docking volta all’ottimizzazione,

tramite la scoring function di HINT, degli idrogeni ossidrilici coinvolti nella

formazione di legami a idrogeno. Il legame carbonio-ossigeno è stato ruotato

manualmente, così da avvicinare (in alcuni casi allontanare perchè troppo vicini)

l’atomo di idrogeno al gruppo elettrondonatore, fino ad una distanza limite di 1.7 Å.

Il Grafico 5.3.2 mostra la nuova correlazione tra ∆G° sperimentale e HINT score

per i 52 composti analizzati. La retta presenta valori nettamente migliori rispetto

alla correlazione precedente: R = 0.75, R2 = 0.56 e errore standard = 1.75 kcal/mol.

Tali valori rappresentano un buon livello di taratura della metodologia utilizzata,

nella prospettiva di uno screening.

Grafico 5.3.1: Correlazione tra HINT score proteina-ligando e ∆G° sperimentale per un set di 33 composti analizzati utilizzando due conformazioni recettoriali 1XPC e 3ERD.


54

HS pl

-2000 0 2000 4000

∆G

°

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

1sjo

1xp11xp61xp91xpc 1yim

1yin

1x7e

rutina

tamestrio moxes

bisfenAmetilestr

estrone

mirice

zea

betazea

androst

La Tabella 5.3.2 mostra i valori di HINT score e di ∆G° sperimentale attribuiti

all’interazione di ogni ligando con il recettore.

E’ interessante notare come aumentando l’omogeneità chimica dei composti la

correlazione tra ∆G° e HINT score migliori ulteriormente, come nel Grafico 5.3.3

ottenuto riportando solo il contributo dei SERM (R = 0.78, R2 = 0.60, errore

standard = 1.30 kcal/mol). Questo permette di studiare il comportamento di una

singola classe di sostanze con una maggiore attendibilità predittiva.

Grafico 5.3.2: Correlazione tra ∆G° sperimentale e HINT score proteina ligando per i 52 composti analizzati.


55

Composto ∆G° (kcal/mol)

HINT score

1SJO -11.42 2776

1XP1 -13.05 3374

1XP6 -13.18 3416

1XP9 -12.49 3164

1XPC -12.33 2594

1YIM -12.40 3089

1YIN -12.77 2823

1X7E -8.53 1125

Rutina -4.38 -632

Tamoxifene -11.49 2732

Estriolo -11.28 931

Moxestrolo -11.54 1842

Bisfenolo A -7.10 1109

Metilestriolo -7.75 -765

Estrone -11.18 1731

Miricetina -6.26 -1900

Zearalanone -10.42 -510

Betazearalenolo -9.05 12

Andronstandiolo -6.36 467

Tabella 5.3.2: Valori di HINT score e ∆G° sperimentale relativi ai colmplessi formati dai ligandi analizzati.


56

HS pl

1000 2000 3000 4000

∆G

°

-16

-14

-12

-10

-8

-6

1sjo

1xp11xp6

1xp91xpc 1yim1yin

tam

5.4 ANALISI DEL FARMACOFORO

Per identificare potenziali xenoestrogeni e sintetizzare nuovi farmaci è importante

conoscere i requisiti strutturali necessari affinché un composto mostri affinità per il

recettore degli estrogeni. In particolare, individuando i gruppi funzionali più

adeguati all’interazione e studiando le proprietà chimiche del sito di legame è

possibile poi condurre ricerche di similarità all’interno di un database al fine di

distinguere potenziali ligandi.

Sulla base di analisi di relazioni struttura-attività sono state individuate le

caratteristiche più importanti che determinano il legame al recettore (Fang et al.

2001):

Grafico 5.3.3: Correlazione tra ∆G° sperimentale e HINT score proteina ligando relativa ai SERM analizzati


57

1. presenza di un gruppo ossidrilico in grado di mimare la funzione 3-idrossi

dell’estradiolo mediante la formazione di un legame idrogeno con il Glu353

e l’Arg 394. Qualsiasi fattore capace di modificare il contributo di tale

legame, come ingombri sterici, effetti induttivi di risonanza, o sostituzione

del gruppo OH con un donatore di idrogeno debole quale NH, riduce la forza

del binding;

2. formazione di un legame ad idrogeno tra l’His 524 e un secondo gruppo

ossidrilico posto ad una distanza ottimale di 11 Å dal primo, come

nell’estradiolo. Per i ligandi con una differente distanza tra i due atomi di

ossigeno, il gruppo imidazolico, grazie alla flessibilità della catena, può

compensare tale distanza;

3. strutture caratterizzate da un certo grado di idrofobicità si prestano meglio

all’interazione con il sito essenzialmente apolare;

4. presenza di un anello, di norma aromatico, che contribuisce alla rigidità della

molecola. Ad oggi non sono conosciuti ligandi attivi sul recettore degli

estrogeni che non presentino almeno una struttura ad anello;

5. per quanto riguarda agonisti parziali e antagonisti, presenza di una funzione

amminica protonata in grado di mettere a disposizione l’idrogeno per

formare in legame idrogeno con Asp 351.

Lo studio del sito di legame, effettuato in questo lavoro di tesi con il software

GRID, mostra risultati perfettamente in accordo con le valutazioni precedenti. Per

l’analisi farmacoforica sono stati utilizzati quattro probe al fine di identificare

all’interno del sito i gruppi accettori/donatori di legami idrogeno e disponibili ai

contatti idrofobici. Il programma, inoltre, non si limita ad individuare strutture

funzionali complementari al probe, ma da una stima quantitativa dell’energia

associata all’interazione della sonda con il sito.

Probe donatore di legami idrogeno

La mappa della cavità recettoriale mostra che le zone favorevoli ad accettare un

legame idrogeno sono localizzate in corrispondenza del Glu 353, dell’His 524 e

dell’Asp 351 e, infatti, la maggior parte dei SERM è caratterizzata dalla presenza di

due gruppi fenolici che interagiscono con il glutammato e l’istidina e da una

funzione amminica eterociclica protonata che lega l’aspartato. In corrispondenza del

Glu 353, GRID evidenzia la porzione energeticamente più favorita, in accordo con

gli studi di SAR decritti.


58

Probe accettore di legami idrogeno

L’anello imidazolico dell’His 524 e, soprattutto, la funzione imidazolica dell’Arg 394

costituiscono i due gruppi donatori di legami idrogeno principali. Infatti, l’His 524

ha un carattere duplice, grazie alla tautomeria dell’anello imidazolico che può

comportarsi da H-donatore o H-accettore a seconda del ligando presente nel sito. Il

contributo energetico che GRID associa all’istidina è meno rilevante dei contributi

apportati da Arg 394 e Glu353, in accordo con altri studi computazionali effettuati

(Sivanesan et al.2005). Il software, inoltre, mostra una zona energeticamente

favorita, alla formazione di legami idrogeno, delimitata dagli amminoacidi Met 343 ,

Cys 530 e Thr 347, che non era stata ancora evidenziata da studi di SAR.

Probe idrofobico

Il sito del recettore degli estrogeni si presenta come una cavità essenzialmente

apolare, che predilige ligandi caratterizzati da un alto grado di idrofobicità. La

conformazione recettoriale selezionata dai SERM è caratterizzata dalla presenza di

un canale nel quale essi alloggiano la catena laterale. All’interno di tale canale si

sono osservate due piccole cavità energeticamente favorevoli a contatti idrofobici: la

prima è delinetata dagli amminoacidi Trp 383, Leu 354, Leu 356 ed interagisce,

molto probabilmente, con l’anello eterociclico delle catene laterali dei SERM; la

seconda, invece, è caratterizzata da un profilo energetico minore ed è localizzata in

corrispondenza dei residui Tyr 526 e Cys 530.

Ossidrile fenolico

Un’ulteriore analisi è stata effettuata utilizzando come probe un gruppo ossidrilico

di natura fenolica, cha mostra carattere ambivalente di accettore e donatore di

legame idrogeno. La valutazione energetica realizzata da GRID stabilisce che il

probe fenolico instaura interazioni migliori rispetto a tutte le altre sonde utilizzate,

rimarcando l’importanza che tale gruppo riveste nell’instaurare il legame (Figura

5.4.1).

E’ necessario notare l’esistenza di composti che, pur non possedendo un ossidrile

fenolico nella struttura, mostrano una buona affinità recettoriale. L’ospemifene, ad

esempio, pur non possedendo l’idrossile fenolico è attualmente in fase clinica per il

trattamento dell’osteoporosi e dell’atrofia urogenitale (Henke et al. 2005).


59

5.5 DOCKING DI ADDITIVI ALIMENTARI

Gli addittivi alimentari sono definiti come “sostanze, normalmente non consumate

come alimento in quanto tale e non utilizzate come ingredienti tipici degli alimenti,

aggiunte intenzionalmente ai prodotti alimentari per un fine tecnologico nella fasi di

produzione, trasformazione, preparazione, trattamento, imballaggio, trasporto o

immagazzinaggio.” (DM 209 27.02.1996: additivi alimentari). Sebbene gli additivi

siano sottoposti ad ampi studi di tossicità generale e siano considerati composti

sicuri dal punto di vista alimentare, nelle quantità indicate dalla legge, poche sono le

conoscenze sulle potenziali tossicità specifiche di tali composti. In questo lavoro di

tesi, è stato preso in considerazione, come potenziale bersaglio d’azione, per un

ristretto numero di addittivi, il recettore degli estrogeni.

Figura 5.4.1: Mappa della cavità recettoriale calcolate da GRID utilizzando come probe un ossidrile fenolico. In viola sono rappresentate le regioni del sito dove l’interazione con il probe è energeticamente favorita. Maggiore è l’intensità della macchia maggiore è l’affinità. Una porzione della superficie di Connolly non è mostrata per permettere la visione integrale del sito di legame.


60

Il database sviluppato da FAO/WHO è organizzato in due cataloghi: da una parte

sono classificati gli aromatizzanti e nell’altra rientrano tutte le restanti classi

funzionali, compresi anche alcuni aromatizzanti stessi. In questa tesi sono stati

valutati additivi provenienti dal secondo gruppo, rimandando l’analisi del catalogo

completo degli aromatizzanti a studi successivi. Il database considerato contiene

842 entries, dalle quali sono state selezionate, sulla base delle dimensioni e del

modello farmacoforico sviluppato, circa 60 sostanze potenzialmente affini al

recettore. Tuttavia il filtro applicato è stato permissivo per evitare di escludere

potenziali ligandi dall’analisi. In particolare nessun composto inorganico è stato

preso in considerazione e tra le molecole organiche sono stati scartati a priori gli

zuccheri, gli acidi grassi e i polimeri. Tra i composti che hanno superato la fase di

filtro ne sono stati analizzati 10, le cui strutture sono riportate nella Tabella 5.5.1 I

restanti additivi saranno valutati in studi seguenti.

Ogni potenziale ligando è stato inserito in entrambe le conformazioni scelte del

recettore, 3ERD e 1XPC, tranne nei casi in cui, data la caratteristiche chimiche e

geometriche del composto, non è realistico pensare che esso sia in grado di

selezionare la struttura recettoriale aperta tipica del complesso tra ERα e SERM.

Infatti, ad oggi, non sono conosciuti modulatori selettivi del recettore degli

estrogeni che non posseggano una catena laterale ingombrante capace di legare

l’Asp 351. E’, quindi, ipotizzabile che, a meno di evidenti ragioni steriche, che

impongano al recettore di assumere la conformazione aperta, i potenziali ligandi

selezionino la struttura chiusa tipica degli agonisti. In questa conformazione, infatti,

un buon ligando è in grado, entrando nel sito, di escludere completamente dalla

cavità idrofobica le molecole di solvente, contribuendo ad un notevole guadagno

entropico.

Dopo aver effettuato il docking, a partire dall’espressione analitica della retta di

taratura:

∆G° (kcal/mol) = -0.0016 HS – 8.38

è stato possibile calcolare, conoscendo il valore di HINT score (HS), la variazione di

energia libera, predetta dal programma, associata alla formazione dei diversi

complessi recettore-addittivo.


61

Additivo Struttura Classe funzionale

Delfinidina

OH

HO O

OH

O

OH

OH

Colorante

Capsaicina

OH

OCH3

NH

O

Colorante

Bisdemetossicurcumina HO OH

O O Colorante

Acido nordiidroguaiaretico

HO

HO

OH

OH

Antiossidante

Eugenolo H3CO

HO Aromatizzante

Etilvanillina

OH

O H

O

Aromatizzante

Chinina N

OCH3

NH

OH

Aromatizzante

Propil p-idrossibenzoato HO

O

O

Conservante

o-Fenilfenolo OH

Conservante

Acido colico

OHHO

OH

OH

O

Emulsionante

Tabella 5.5.1: Struttura chimica e funzione dei 10 additivi studiati.


62

5.5.1 DELFINIDINA

La delfinidina appartiene alla famiglia delle antocianidine, molto diffuse nel mondo

vegetale e particolarmente concentrate nella buccia dell’uva da cui sono estratte. Le

antocianidine sono utilizzate come coloranti naturali nell’industria alimentare,

anche se la loro applicazione è piuttosto limitata dalla scarsa stabilità chimica.

Questa classe di composti fa capo al vasto insieme dei flavonoidi, come la genisteina

e vista proprio la somiglianza con quest’ultima la delfinidina è stata inserita solo

nella conformazione recettoriale dell’agonista.

In soluzione acquosa, le antocianidine sono in equilibrio tra diverse forme, più o

meno predominanti a seconda del pH del mezzo (Figura 5.5.1 ). Ammesso che la

delfinidina arrivi integra al recettore, dovrebbe presentarsi nella struttura

predominante a pH 6-7, per cui ai fini del docking, è stata utilizzata quest’ultima.

OOH

OH

OR

OHOH

OOH

OH

OR

OH

OHOH

OOH

OH

OR

OH

OHOH

OOH

OH

OR

OHO

OO

OH

OR

OHO

+

pH < 1, rosso pH = 4-5, incolore

pH = 6-7, viola

pH = 7-8, blu scuro pH = 7-8, giallo

-

Figura 5.5.1: Equilibri in soluzione acquosa per le antocianidine.


63

L’Hint score associato alla formazione del complesso è pari a – 341, quindi

applicando l’equazione riportata precedentemente il ∆G° predetto è pari a -7.83

Kcal/mol.

La delfinidina si orienta nel sito di 3ERD, come mostrato in Figura 5.5.2. L’additivo

è caratterizzato dalla presenza di cinque gruppi ossidrilici e un ossigeno carbonilico,

che aumentano significativamente la polarità della molecola. I diversi gruppi

idrossilici formano legami idrogeno con gli amminoacidi importanti del sito Glu

353, Arg 394, His 524 e con due residui non fondamentali per l’attivazione, Met 421

e Leu 387. Tali interazioni sono state ottimizzate manualmente ruotando i legami

carbonio-ossigeno laddove necessario. Nonostante i numerosi contributi positivi

apportati dai legami idrogeno lo score è significativamente basso. Questo è

imputabile all’elevata polarità della molecola che va ad interagire con un sito

essenzialmente idrofobico generando numerose incompatibilità chimiche. Tale

risultato è in accordo con molti studi effettuati sui fitoestrogeni, in cui è stato

provato che l’esistenza di più di quattro gruppi ossidrilici in una molecola riduce le

proprietà di binding della sostanza stessa (Vaya et al. 2004; Fang et al. 2001).

Questa teoria permette anche di spiegare la diversa affinità di legame della

genisteina (∆G° sperimentale= -11.67), rispetto alla delfinidina. Infatti, la genisteina

presenta solo tre funzioni ossidriliche e un ossigeno carbonilico.

Arg 394

Glu 353

Figura 5.5.2: Orientazione assunta dalla delfinidina nel sito della proteina 3ERD. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Leu 387

Glu 353

Arg 394 Met 421

His 524


64

La delfinidina, come tutte le antocianidine, è scarsamente assorbita nel tratto

gastrointestinale, soprattutto in assenza della porzione glicosidica a cui di norma si

trovano legate in natura. Conoscere i preocessi di biotrasformazione potrebbe

risultare molto importante ai fini dell’analisi sia per individuare la struttura che più

probabilmente arriva al recettore, sia per valutare eventuali metaboliti tossici. Per

quanto riguarda le antocianidine le informazioni sul metabolismo sono piuttosto

limitate in letteratura e riguardano soprattutto processi di metilazione a carico dei

gruppi ossidrilici (Wu et al. 2002).

5.5.2 CAPSAICINA

La capsaicina è una sostanza ad azione pungente contenuta, primariamente, nel

peperoncino e appartiene alla famiglia dei capsaicinoidi, di cui è il principale

esponente. La capsaicina è un comune costituente della dieta ed attualmente è

utilizzato come antimicrobico, nell’analgesia topica, come prodotto omeopatico e

come colorante nell’industria alimentare.

Nella conformazione distesa la distanza tra l’ossidrile fenolico e il metile

isopropilico della capsaicina è di circa 18 Å, mentre nell’estradiolo, che occupa

pienamente il sito, i due OH fenolici distano 11 Å (Vaya et al. 2004). La capsaicina,

quindi, è stata inserita in entrambe le conformazioni limite del recettore, 1XPC e

3ERD, anche se la presenza di numerosi legami ruotabili consente, comunque,

l’accesso al sito dell’agonista. In entrambi i recettori la funzione ossidrilica

dell’additivo forma interazioni favorevoli del tipo legame a idrogeno con il Glu 353

e l’Arg 394, come ci si aspettava dall’analisi farmacoforica effettuata. Nel sito di

1XPC la catena alchilica della capsaicina si distende e protende nella cavità occupata

tipicamente dai SERM, instaurando, tramite l’idrogeno del gruppo ammidico, un

legame idrogeno con la Leu 346 e lasciando il resto del sito di legame non occupato

(Figura 5.5.3). All’interno di 3ERD, invece, il ligando non può distendersi per ovvi

motivi sterici, quindi assume una posa più compatta, che a partire da un’ispezione

visuale sembrerebbe realistica, ma non è detto che dal punto di vista energetico tale

conformazione sia verosimile. Tuttavia la cavità recettoriale risulta pienamente

occupata dalla capasaicina e anche in questo caso si instaura un’interazione positiva

tra la funzione ammidica e il gruppo carbossilico della Leu 346 (Figura 5.5.4).


65

Figura 5.5.3: Orientazione assunta dalla capsaicina nel sito della proteina 1XPC. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Arg 394

Glu 353

His 524

Leu 346

Figura 5.5.4: Orientazione assunta dalla capsaicina nel sito della proteina 3ERD. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Arg 394

Leu 346

Glu 353

His 524


66

Gli score assegnati da HINT all’interazione proteina-additivo sono 1436 per 3ERD

e 1539 per 1XPC. I contributi più significativi all’innalzamento dello score sono

apportati dalle numerose interazioni idrofobiche instaurate dalla catena alchilica

della capsaicina con il sito. Il valore di ∆G° predetto per la formazione del

complesso tra l’additivo e il recettore degli estrogeni è pari a -10.68 Kcal/mol per

3ERD e -10.84 Kcal/mol per 1XPC.

Il metabolismo microsomiale della capsaicina porta alla formazione di numerosi

composti caratterizzati da un aumento della polarità (Figura 5.5.5). Le principali

reazioni a cui la capsaicina è soggetta sono idrossilazioni, deidrogenazioni e

demetilazioni (Reilly et al. 2003). Studi successivi si occuperanno di indagare la

potenziale affinità dei metaboliti al recettore degli estrogeni.

Figura 5.5.5: Vie metaboliche a cui va incontro la capsaicina in seguito all’assorbimento (Reilly et al. 2003).


67

5.5.3 BISDEMETOSSICURCUMINA

La curcumina è il principale pigmento estratto dalla curcuma, comunemente

utilizzata come spezia soprattutto nei paesi asiatici. In studi preclinici condotti su

modelli animali la curcumina ha mostrato un’azione preventiva nei confronti dello

sviluppo di neoplasie intestinali. Comunque, l’attività clinica della curcumina deve

essere ancora confermata (Ireson et al. 2002). Oltre alla curcumina i principali

coloranti estratti dalla curcuma, addizionati agli alimenti sono la

demetossicurcumina e la desmetossicurcumina. Quest’ultima è stata prescelta per

l’analisi di docking, in quanto presenta minore idrofilia e minori ingombri sterici.

Data la dimensione del ligando la simulazione è stata effettuata utilizzando sia il

recettore 3ERD che 1XPC, per essere sicuri di valutare completamente la

potenziale affinità dell’additivo. In entrambe le conformazioni recettoriali,

nonostante la presenza di due ossidrili fenolici, la desmetossicurcumina instaura un

solo legame idrogeno con il Glu353. Il secondo OH non riesce a legarsi all’His 524

perchè la distanza tra le due funzioni fenoliche è maggiore rispetto a quella ideale

Figura 5.5.6: Orientazione assunta dalla bisdemetossicurcumina nel sito della proteina 3ERD. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Glu 353

Arg 394

His 524


68

assunta dall’estradiolo di 11 Å (Vaya et al. 2004). La posa assunta dal ligando nel

complesso 3ERD-desmetossicurcumina selezionato da HINT è rappresentata nella

Figura 5.5.6. Lo score assegnato a tale interazione è di 450 punti e il valore di ∆G°

predetto è -9.10 Kcal/mol. A partire dall’analisi visuale è stato concluso che la

distorsione dei legami è eccessiva e che la struttura della desmetossicurcumina,

generata dal processo di docking, non sembra verosimile.

Nel sito recettoriale di 1XPC l’additivo è meno distorto rispetto alla conformazione

assunta nel recettore 3ERD, perchè la catena alchilica si distende verso l’esterno

promuovendo un’interazione favorevole tra l’Asp 351 e uno dei due ossidrili fenolici

(Figura 5.5.7). Poichè HINT valuta la formazione del complesso con un punteggio

di 2063, la variazione dell’energia libera predetta è di -11.68 Kcal/mol.

La biodisponibilità della curcumina, in seguito ad assunzione per via orale, è

piuttosto limitata, in quanto è scarsamente assorbita nel tratto intestinale ed è

ampiamente metabolizzata dal fegato. I metaboliti principali sono la

tetraidrocurcumina, la esaidrocurcumina e l’esidrocurcuminolo (Figura 5.5.8) e

Figura 5.5.7: Orientazione assunta dalla bisdemetossicurcumina nel sito della proteina 1XPC. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Arg 394

Glu 353

His 524

Asp 351


69

sembrano essere fortemente coinvolti nell’azione antineoplastica ipotizzata per la

curcumina. La diidrogenazione dei doppi legami aumenta il numero delle possibili

conformazioni assunte dal ligando perchè genera un aumento della flessibilità della

molecola. Alcuni metaboliti, quindi, saranno analizzati in studi di docking futuri. Il

metabolismo di seconda fase, invece, riguarda soprattutto reazione di

glucuronidazione e solfatazione (Ireson et al. 2002).

5.5.4 PROPIL p-IDROSSIBENZOATO

Il propil p-idrossibenzoato è un composto di origine sintetica, appartenente alla

classe dei parabeni, cioè degli esteri dell’acido 4-idrossibenzoico. Queste sostanze

sono largamente impiegate come conservanti nella fabbricazione di prodotti

alimentari, cosmetici e farmaceutici. In letteratura sono presenti studi sperimentali

che riconoscono nei parabeni ligandi in grado di attivare il recettore degli estrogeni

(Byford et al. 2002; Blair et al. 2000).

Data l’assenza di funzioni ingombranti e le modeste dimensioni del propil p-idrossi

benzoato, l’additivo è stato inserito solo nella conformazione recettoriale 3ERD.

L’orientazione assunta dal ligando nel sito è rappresentata in Figura 5.5.9. La

funzione fenolica, anche in questo caso, come ci si aspetta, forma un legame

idrogeno con Il Glu 353 e l’Arg 394, mentre la catena propilica instaura favorevoli

Figura 5.5.8: Principali metaboliti della curcumina (Ireson et al. 2002).


70

contatti idrofobici con i residui apolari del sito. L’HINT score assegnato al

complesso Erα-additivo è 1586 e il ∆G° predetto -10.92 Kcal/mol. Il propil p-

idrossibenzoato non occupa interamente la cavità di legame, infatti alcuni studi

valutano l’ipotesi che ai fini dell’attivazione recettoriale siano necessarie due

molecole del ligando in grado di orientare le proprie funzioni ossidriliche

rispettivamente verso il Glu353 e l’His 524. Tali studi dimostrano anche che la

tasca di legame sia in grado di accettare due molecole dell’estere propilico senza

costrizioni steriche (Byford et al. 2002). Siccome una sola molecola di additivo,

probabilmente, non estrude completamente le molecole d’acqua dal sito, è possibile

che HINT, non valutando a pieno tale perdita entropica, sopravvaluti l’interazione

tra recettore e propil benzoato. Tramite il programma GRASP, è stato misurato il

volume dell’additivo, che è pari a 156.45 Å3, mentre il minimo volume conosciuto

per agonisti e SERM è circa 200 Å3. Inoltre, la presenza di analisi sperimentali che

classificano i parabeni come “weak binders” (Blair et al. 2000), rafforza l’ipotesi che

il programma sovrastimi l’affinità della molecola.

Figura 5.5.9: Orientazione assunta del propil benzoato nel sito della proteina 3ERD. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Arg 394

Glu 353

His 524


71

Come era possibile immaginare il principale metabolita dei parabeni si forma per

idrolisi del gruppo estereo ed è l’acido p-idrossi benzoico, il quale, data la sua

idrofilia, avrà una affinità minore per il recettore rispetto all’estere. Comunque

eventuali studi futuri si occuperanno di stabilire le conseguenze legate alla

biotrasformazione dei parabeni.

5.5.5 ACIDO NORDIIDROGUAIARETICO

L’acido nordiidroguaiaretico (NDGA) è un composto di origine vegetale utilizzato

come conservante nell’industria alimentare per grassi e burro. A tale sostanza sono

state attribuite diverse azioni, come antiossidante, inibitore delle lipoossigenasi,

induttore di nefropatie e, più recentemente, come inibitore dello crescita di cellule

cancerose in vitro (Fujimoto et al. 2004).

Per analizzare il comportamento dell’additivo nei confronti del recettore degli

estrogeni, sono state utilizzate entrambe conformazioni del recettore ERα, 3ERD e

Figura 5.5.10: Orientazione assunta dell’acido nordiidroguaiaretico nel sito della proteina 3ERD. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Arg 394

Glu 353

His 524

Met 343

Thr 347


72

1XPC. L’acido nordiidroguaiaretico è costituito da una struttura simmetrica in cui

sono presenti quattro ossidrili fenolici. La lunghezza della molecola nella forma

distesa è pari a 14 Å, permettendo al ligando, anche grazie alla presenza di diversi

legami ruotabili, di occupare interamente il sito di legame 3ERD, assumendo una

conformazione meno distorta rispetto, ad esempio, al derivato della curcumina, più

ingombrante e meno flessibile. Due dei gruppi fenolici formano legami ad idrogeno

con gli amminoacidi Glu 353 e Arg 394, mentre gli altri due ossidrili instaurano

legami idrogeno con i residui Thr 347 e Met 343 (Figura 5.5.10). I gruppi metilici

contribuiscono positivamente all’interazione con il recettore poichè generano

contatti idrofobici con gli amminoacidi apolari del sito. Dato lo score assegnato da

HINT pari a 949, la variazione di energia libera predetta per l’interazione tra ERα e

acido nordiidroguaiaretico è -9.90 Kcal/mol. L’orientazione dell’additivo all’interno

del sito di 1XPC è mostrata nella Figura 5.5.11. Analogamente al complesso

precedente, due ossidrili fenolici si legano al glutammato e all’arginina, mentre una

delle restanti funzioni OH riesce a formare un legame ad idrogeno con l’Asp 351. Lo

score assegnato da HINT alla formazione del complesso è più elevato rispetto al

precedente ed è pari a 1795. Il ∆G° predetto è -11.25 Kcal/mol. Alcuni studi recenti,

in effetti, indicano che l’acido diidroguaiaretico possiede attività SERM-like

(Fujimoto et al. 2004).

Figura 5.5.11: Orientazione assunta dell’acido nordiidroguaiaretico nel sito della proteina 1XPC. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Arg 394

Glu 353

His 524

Asp 351


73

In letteratura i dati relativi al metabolismo dell’acido nordiidroguaiaretico sono

molto limitati. Studi successivi si occuperanno di indagare approfonditamente tale

aspetto.

5.5.6 EUGENOLO

L’eugenolo è uno dei principali componenti dell’olio di garofano e come tale è molto

utilizzato per esaltare aromi e sapori nell’industria alimentare. Studi farmacologici

hanno dimostrato che questo componente naturale mostra attività

anticonvulsivante e proprietà analgesica locale sfruttata nella pratica dentistica

(Ardjmanda et al. 2006).

Date le caratteristiche strutturali dell’eugenolo le simulazioni di docking sono state

eseguite esclusivamente adottando la conformazione recettoriale dell’agonista

Figura 5.5.12: Orientazione assunta dell’eugenolo nel sito della proteina 3ERD. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Arg 394

Glu 353

His 524


74

(3ERD). L’eugenolo occupa solo parte della cavità di legame come si osserva nella

Figura 5.5.12. L’ossidrile fenolico, come ci si aspetta, forma legami ad idrogeno con

gli amminoacidi Glu 353 e l’Arg 394. L’His 524 è esclusa dall’interazione con il

ligando, a causa dell’assenza di gruppi funzionali adatti e, soprattutto, a causa delle

piccole dimensioni. Lo score associato alla formazione del complesso tra eugenolo e

recettore degli estrogeni è pari a 1381 e il ∆G° predetto, calcolato a partire dalla

retta di taratura, assume valore -10.59 Kcal/mol. Studi di binding sull’eugenolo

hanno escluso che esso leghi il recettore degli estrogeni (Blair et al. 2000), per cui è

probabile che HINT sopravvaluti tale interazione.

L’eugenolo è rapidamente assorbito e metabolizzato in seguito ad assunzione per via

orale. Nelle urine sono stati individuati nove metaboliti dell’eugenolo, che è escreto

immodificato per meno dello 0.1%. Il metabolismo comprende soprattutto reazioni

di diidrogenzazione, ossidrilazione e ossidazione (Fischer et al. 1990), che saranno

indagate in studi futuri.

5.5.7 o-FENILFENOLO

L’orto-fenilfenolo è utilizzato come fungicida e agente antibatterico nell’industria

agricola e alimentare. Alte esposizioni a tale disinfettante hanno evidenziato lo

sviluppo di carcinomi urinari nei ratti (Murata et al. 1999).

Il fenilfenolo presenta una struttura molto semplice, costituita da due anelli

aromatici e un gruppo ossidrilico. Il miglior conformero selezionato da HINT,

nell’insieme generato da GOLD all’interno del recettore 3ERD, è caratterizzato da

un punteggio di 1707 e il ∆G° predetto è pari a -11.11 Kcal/mol. Dalla Figura

5.5.13 si osserva come, anche in questo caso, l’ossidrile fenolico formi un legame

idrogeno con il Glu 353. Il sostituente fenilico invece è coinvolto in numerose

interazioni idrofobiche-idrofobiche con Leu 384, Thr 347, Ala 350, Leu 540 e

contatti π-π con Trp 383. L’His 524 è troppo lontana per interagire con il

fenilfenolo. La capacità dei composti difenilici di attivare il recettore degli estrogeni

è ben documentata in letteratura e comprende l’analisi di inquinanti, come il

bisfenolo A. In particolare l’o-fenilfenolo è stato classificato come legante debole del

recettore (Blair et al. 2000), supportando l’ipotesi che HINT tenda a sovrastimimare

il legame di piccole molecole costituite da gruppi aromatici.


75

L’o-fenilfenolo è assorbito in quantità consistente e rapidamente eliminato in

seguito a somministrazione orale nei ratti e dermica nell’uomo. Nelle urine si

ritrovano principalmente coniugati solfati (69%) e glucuronati dell’additivo non

modificato (Timchalk et al. 1998). Inoltre sono stati riportati due metabiliti, il

fenilbenzochinone e il fenilidrochinone, a cui sono attribuite azioni ossidative

carcinogenetiche per formazione di H2O2 (Murata et al. 1999).

5.5.8 CHININA

La chinina è un alcaloide naturale, ricavato dalla corteccia dell’albero di cincona,

utilizzato come farmaco di prima scelta nel trattamento della malaria, specialmente

nei casi gravi. Tale alcaloide costituisce, insieme alla caffeina, un additivo molto

usato nel preparazione di bevande gasate.

La chinina è caratterizzata dalla presenza nella struttura di una anello eterociclico

non aromatico, chiamato chinuclidina, la cui funzione amminica ha pKa pari a circa

Figura 5.5.13: Orientazione assunta dall’orto-fenilfenolo nel sito della proteina 3ERD. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Arg 394

Glu 353

His 524


76

10. L’azoto è quindi da considerarsi protonato a pH fisiologico. Date le

caratteristiche strutturali della chinina, si sono considerate entrambe le strutture

cristallografiche 3ERD e 1XPC nell’affrontare gli studi di docking. L’orientazione

assunta dalla chinina nel sito di legame della proteina 3ERD è mostrata in Figura

5.5.14. L’ossidrile alcolico non riesce ad instaurare un legame idrogeno con Glu 353

e con His 524, in quanto, i due gruppi ingombranti adiacenti lo limitano

stericamente. Tra recettore e ligando non si sono riscontrati legami significativi,

ma, nonostante questo, lo score attribuito da Hint alla formazione del complesso tra

chinina e Erα è pari a 1130, che equivale a un valore di ∆G° predetto di -10.19

Kcal/mol. Probabilmente ad innalzare lo score sono le numerose interazioni

idrofobiche che stabiliscono sia l’anello chinuclidinico che quello chinolinico.

All’interno della conformazione recettoriale 1XPC il ligando assume una posizione

ribaltata rispetto a quella precedente (Figura 5.5.15), orientando il biciclo in

direzione dell’Asp 351, con il quale, l’ammina protonata non forma un legame a

idrogeno a causa dell’eccessiva distanza. Anche in questo caso, numerosi sono i

Figura 5.5.14: Orientazione assunta dalla chinina nel sito della proteina 3ERD.

Arg 394

Glu 353

His 524


77

contatti idrofobici tra proteina e chinina. Lo score, pari a 1398, è leggermente, ma

non significativamente, più alto rispetto al precedente e la variazione di energia

libera predetta corrisponde a -10.62 Kcal/mol.

La chinina è un composto ampiamente studiato data la sua applicazione in campo

farmaceutico. Numerosi sono gli effetti tossici legati all’uso dell’alcaloide nella

pratica medica e sono raggruppati sotto il nome di cinconismo, una sindrome

caratterizzata da tinnito, cefalea, nausea, vomito e disturbi visivi. Gli studi della

potenziale attività sul recettore degli estrogeni della chinina e dei suoi metaboliti

sarà continuata in studi successivi. I principali prodotti del metabolismo sono: 3-

idrossichinina, 2’-chinone e 10,11-diidrossidiidrochinone, anche se, per lo più, la

chinina è escreta nella sua forma immodificata (Mirgani et al. 2003).

Figura 5.5.15: Orientazione assunta dalla chinina nel sito della proteina 1XPC.

Arg 394

Glu 353

His 524

Asp 351


78

5.5.9 ETILVANILLINA

L’Etilvanillina è un prodotto artificiale che presenta caratteristiche aromatiche tre o

quattro volte più intense rispetto alla semplice vanillina e per questo è molto

utilizzata in campo alimentare.

L’additivo è stato inserito solo nella conformazione 3ERD, analogamente a tutti i

ligandi caratterizzati da piccole dimensioni. Nonostante la presenza di un ossidrile

fenolico nella struttura dell’etilvanillina, l’orientazione della molecola non è idonea

alla formazione del legame idrogeno con Glu 353. Questa condizione si verifica in

tutti i complessi generati da GOLD, facendo supporre che la presenza del gruppo

etossilico, in orto alla funzione alcolica, impedisca stericamente l’aggancio. E’

possibile notare, invece, dalla Figura 5.5.16 la formazione di un legame idrogeno tra

l’ossigeno aldeidico dell’etilvanillina e un idrogeno del gruppo guanidinico dell’Arg

394. L’His 524 è esclusa dall’interazione con il ligando, mentre Leu 346 interagisce

tramite contatto idrofobico con il sosituente etilico. L’ HINT score è 977 e il

corrispondente ∆G° di legame è -9.94 Kcal/mol.

Figura 5.5.16: Orientazione assunta dall’etilvanillina nel sito della proteina 3ERD. I legami idrogeno sono mostrati con linee tratteggiate.

Arg 394

Glu 353

His 524


79

All’interno del nostro organismo, molto probabilmente, una delle principali

modoficazioni a cui va incontro l’etilvanillina è la deetilazione del gruppo

ossidrilico, ricostituendo la vanillina. Studi di farmacocinetica hanno dimostrato che

in 48 ore il 94% di una dose di vanillina viene escreto con le urine sottoforma di:

vanillina non modificata (7%), alcol vanillico (19%), acido vanillico (47%),

vanniloilglicina (10%), catecolo (8%), 4-metilcatecolo (2), guaiacolo (0-5%) e 4-metil

guaiacolo (0-6%) (Strand et al. 1975), che eventuali indagini future si occuperanno

di studiare.

5.5.10 ACIDO COLICO

L’acido colico è un normale componente della bile di tutti i vertebrati e può essere

utilizzato come emulsionante nella fabbricazione di prodotti destinati

all’alimentazione. Gli acidi colico e chenodesossicolico si formano nel fegato in un

rapporto di circa 2:1 e costituiscono l’80% degli acidi biliari. Dopo una completa

coniugazione nell’epatocita, sia con la glicina che con la taurina, gli acidi biliari sono

escreti nell’intestino, dove vanno incontro ad una circolazione enteroepatica da 10 a

12 volte al giorno. Durante ciascun passaggio, una piccola quantità di acidi biliari

raggiunge il colon, dove l’acido colico viene convertito in acido desossicolico,

ampiamente riassorbito.

La struttura molecolare del composto è stata costruita in maniera che il gruppo

carbossilico risulti in forma deprotonata, la condizione più verosimile a pH

fisiologico. L’acido colico presenta una struttura steroidea molto simile

all’estradiolo, ma la molecola è dotata anche di una catena alchilica ingombrante che

non ritroviamo nell’ormone. Per queste ragioni è stato scelto di condurre le analisi

di docking su entrambe le conformazioni recettoriali. Nella confirmazione 3ERD

l’acido colico non ha spazio per collocare la catena laterale, formando numerosissime

interazioni repulsive che fanno crollare lo score assegnato da HINT a valori

inferiori a -4000 punti. Anche nel recettore 1XPC l’acido colico non riesce a trovare

una collocazione idonea ai fini di una buona interazione (Figura 5.5.17). All’interno

del sito di legame il ligando è costretto a posizionare alcuni atomi a distanze

comprese tra 0.9-1.6 Å, inverosimili nella realtà e anche per il programma che

assegna a tale interazione uno score negativo di -1878. Inoltre i sostituenti


80

ossidrilici non trovano i target giusti per formare dei buoni legami ad idrogeno. Il

∆G° predetto per la formazione del complesso 1XPC-acido colico è -5.38 Kcal/mol.

5.5.11 VALUTAZIONE DEI RISULTATI OTTENUTI

DALL’ANALISI DEGLI ADDITIVI

In Tabella 5.5.2 sono riportati gli score assegnati da HINT e il valore di ∆G°

predetto per ogni interazione additivo-recettore esaminata nel testo. Inoltre, il

Grafico 5.5.1 mostra come, a seconda del valore di HINT score, si dispongono gli

additivi sulla retta di taratura. Per semplicità, laddove i composti siano stati inseriti

in entrambe le conformazioni recettoriali (3ERD e 1XPC), è stato riportato in

grafico solo il complesso con il punteggio più alto, che dovrebbe rappresentare la

condizione energeticamente favorita.

Figura 5.5.17: Orientazione assunta dall’acido colico nel sito della proteina 1XPC.

Arg 394

Glu 353

His 524

Asp 351


81

Additivo HINT score

∆G° predetto

(Kcal/mol)

Delfinidina -341 -7.83

1436 (3ERD) -10.68 (3ERD) Capsaicina

1539 (1XPC) -10.84 (1XPC)

450 (3ERD) -9.10 (3ERD) Bisdemetossicurcumina

2063 (1XPC) -11.68 (1XPC)

949 (3ERD) -9.90 (1XPC) Acido

nordiidroguaiaretico 1795 (1XPC) -11.25 (1XPC)

Eugenolo 1381 -10.59

Etilvanillina 977 -9.94

1130 (3ERD) -10.19 (3ERT) Chinina

1398 (1XPC) -10.62 (1XPC)

Propil p-idrossibenzoato 1586 -10.92

o-Fenilfenolo 1707 -11.11

Acido colico -1878 -5.38

Tabella 5.5.2: Valori di HINTscore e ∆G° predetto per ogni complesso additivo-recettore analizzato


82

HS pl

-2000 0 2000 4000

∆G°

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

1sjo

1xp11xp61xp91xpc 1yim

1yin

1x7e

rutina

tamestrio moxes

bisfenAmetilestr

estrone

miricet

zea

betazea

androsta

delf

caps

curcuguaia

eugebenz

chininvanil

fenol

colic

Uno dei principali problemi delle procedure di docking è la capacità di discriminare i

falsi positivi che il programma può generare. Un possibile approccio per rendere più

selettiva la selezione dei complessi è utilizzare funzioni di scoring combinate (Lyne

et al. 2002).

E’ importante, comunque, eseguire un’attenta ispezione visuale al fine di filtrare

conformazioni o orientazioni poco realistiche del ligando all’interno del sito. Ad

esempio la chinina non mostra punti di aggancio specifici al recettore e mostra

diverse zone idrofobiche in prossimità di regioni polari. Questa posizione dovrebbe

generare interazioni repulsive che il programma probabilmente sottostima. Per cui,

nonostante lo score moderatamente elevato, la chinina non sembra realmente in

grado di legarsi al recettore.

Grafico 5.5.1: Disposizione degli additivi alimentari analizzati sulla retta di correlazione tra HS e ∆G° sperimentale. I valori relativi alla capsaicina, bisdemetossicurcumina, chinina e acido nordiidroguaiaretico riguardano il complesso formato con 3ERD.


83

Le analisi eseguite sugli additivi hanno evidenziato come potenziali ligandi

l’eugenolo, l’etilvanillina., il fenilfenolo e il propil p-idrossibenzoato. Effettivamente

studi di binding hanno dimostrato che il fenilfenolo e il benzoato sono relativamente

affini al recettore (Blair et al. 2000), ma, in generale, si nota una tendenza di HINT

a sovrastimare l’interazione di piccole molecole che presentano centri aromatici

come un benzene. Come riportato in precedenza, il volume minimo presentato da

agenti agonisti e SERM conosciuti è pari a circa 200 Å3, mentre i quattro additivi

menzionati, occupando uno spazio minore, non riempiono completamente la cavità

di legame. Questo non significa che i composti non si legano, ma, quantomeno, che

difficilmente lo score sarà paragonabile a quello di SERM o agonisti.

Infine anche l’analisi farmacoforica può essere utile per spiegare la possibilità di un

ligando a formare complessi stabili. Ad esempio la delfinidina è costituita da cinque

gruppi ossidrilici, la cui eccessiva polarità rende ragione dello score basso, mentre la

bisdemetossicurcumina, la capsaicina e l’acido nordiidroguaiaretico, caratterizzati da

strutture paragonabili a ligandi noti, presentano valori di score significativamente

migliori. Questi ultimi tre additivi rappresentano, in effetti, i composti più favoriti

alla formazione di un’interazione stabile con il recettore degli estrogeni e saranno

proposti per indagini sperimentali.

Conclusioni

Conclusioni

85

L’inserimento della flessibilità proteica nelle analisi computazionali è uno dei

problemi predominanti che caratterizzano lo studio “in silico” delle macromolecole

biologiche. In particolare, il virtual screening necessità di strumenti rapidi e poco

complessi in grado, tuttavia, di non trascurare la flessibilità recettoriale. In questo

lavoro di tesi sono state analizzate le modificazioni strutturali a cui va incontro il

recettore degli estrogeni in seguito al legame con composti strutturalmente

differenti. Attraverso l’analisi di numerose strutture cristallografiche e sulla base

delle loro caratteristiche geometriche si sono distinte due conformazioni recettoriali

fondamentali da utilizzare negli studi di docking per poter considerare la flessibilità:

la conformazione selezionata dagli agonisti e la conformazione selezionata dai

SERM. Inoltre, tramite analisi di cross-docking e l’osservazione dei dati di B-factor

sono state individuate le due strutture cristallografiche che sembrano meglio

rappresentare ognuna delle due categorie conformazionali: 1XPC, come esponente

della conformazione selezionata dai SERM e 3ERD come esponente

conformazionale della struttura selezionta dagli agonisti.

L’approccio utilizzato ha consentito di ottenere una buona correlazione tra le

misure di ∆G° sperimentali e i valori di score assegnati da HINT ai complessi

proteina-ligando generati tramite docking.

In questo lavoro di tesi, inoltre, il metodo sviluppato è stato applicato allo screening

di un piccolo gruppo di additivi alimentari. L’utilizzo di due conformazioni

recettoriali molto diverse ha permesso di individuare potenziali ligandi come la

bisdemetossicurcumina, che mostra valori di score significativamente differenti

all’interno delle due conformazioni del recettore. Uno dei problemi più importanti

riscontrati nel tentativo di messa a punto di una procedura di virtual screening è

discriminare i potenziali ligandi dai falsi positivi che il programma potrebbe

generare. L’ispezione visuale è uno degli strumenti indispensabili per determinare

se l’orientazione e le interazioni del ligando sono realistiche. Inoltre, per valutare

più accuratamente l’interazione di piccole molecole con il sito di legame, sono stati

confrontati i volumi degli additivi con quelli di ligandi noti. Saranno, comunque,

necessari studi futuri per identificare le strategie più adeguate ad affrontare le

analisi post-docking. Un possibile approccio è l’utilizzo di funzioni di scoring

combinate.

Infine, in questo studio, è stata rilevata la necessità di conoscere, per ogni ligando

considerato, gli equilibri acido/base, quelli tautomerici e le reazioni metaboliche a

cui esso è soggetto all’interno dell’organismo. Le informazioni di farmacocinetica,

Conclusioni

86

infatti, permettono di valutare, non solo la struttura più probabile con cui un

composto si presenta a livello recettoriale, ma anche di analizzare analisi di

eventuali tossicità legate alla formazione di metaboliti.

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Ringraziamenti

Ringraziamenti

Uno degl’incubi più ricorrenti, durante la scrittura della tesi, è stato di non avere il

tempo necessario per salutare e ringraziare tutte le persone a cui voglio bene. Per

fortuna non è andata così.

Non posso non immaginare quanto meno meravigliosa sarebbe stata la mia esistenza

se non avessi avuto accanto la mia famiglia, a cui dedico oggi e sempre tutto quello

che di buono riuscirò a “combinare” nella vita. Ringrazio la mia mamma Maria, i

cui occhi dolci rappresentano per me il significato della parola CASA e ringrazio il

mio papà Alfonso, per essere l’uomo intelligente e premuroso che è. Inoltre

ringrazio anche mia sorella Assunta che, anche se mi fa disperare, non cambierei

mai con nessun’altra.

Un ringraziamento del tutto speciale spetta alle mie nonne, Maria e Assunta, che

stimo molto per la combattività e la tenacia con cui hanno affrontato tutta la loro

vita. Spero, un giorno, che qualcuno dica di me, che ho saputo affrontare la vita

coraggiosamente come hanno saputo fare loro.

Un sentito grazie al Prof. Mozzarelli, per la dote, rara, di saper comunicare la

bellezza di ciò che si conosce da una cattedra universitaria. Grazie anche per avermi

permesso di conoscere il grande mondo della modellistica molecolare, da cui sono

rimasta profondamente affascinata. Mi ritengo privilegiata per aver avuto la

possibilità di muovere una proteina nelle tre dimensioni.

Ringrazio il Dipartimento di Chimica che mi ha ospitato in questi mesi, in

particolare il Prof. Cozzini, non solo per avermi fornito gli strumenti con cui

lavorare, ma per non avermi mai fatto mancare un consiglio e un aiuto mentre mi

avventuravo nel mondo computazionale.

Un grazie infinito alle tre persone che più da vicino hanno seguito il mio lavoro:

Francesca, la “regina della slide”, bella e intelligente; Claudia, o meglio “Santa

Claudia”, a cui è impossibile non volere bene; e, soprattutto, ringrazio quel

“giovanotto” di Alessio, una persona dalla cultura vasta e l’intelligenza fine, che mi

ha “tolto le castagne dal fuoco” più di una volta, che ha sopportato tutte le mie

paranoie e che mi ha fatto morire dal ridere. Grazie davvero per la gentilezza e la

premura con cui mi hai sempre trattata. Una menzione particolare la merita Alice, la

Silicon dei laureandi, a cui sono molto affezionata e guai a chi dice che urla...

Ringraziamenti

Questi anni di università sono stati caratterizzati soprattutto dalla presenza di

quattro amici insostituibili. La Lis, che adoro e che mi ha insegnato soprattutto due

cose: quanto possano essere incredibilmente ricci i capelli e a “vendere cara la pelle

dell’orso”; la Vale, che sa sempre tutto e che tutte le mattine per cinque anni mi ha

accolto con il sorriso sulle labbra; Luca, che ha sempre un sacco di aneddoti

“interessanti” e che ha reso le lezioni un piacere invece che un dovere; Francè, il

cui giro losco e mafioso di appunti “pirata” ha decisamente contribuito a non

allungare ulteriormente i tempi della mia laurea.

E adesso è il momento di ringraziare gli amici di sempre, che, quando si ritrovano

una tesi in mano, si divertono a commentare la copertina, guardare le immagini,

leggere i ringraziamenti e, aprendo una pagina a caso, trovarti un errore di

grammatica. E allora questi ringraziamenti sono tutti per voi!

Grazie a Matteo, il compagno di ogni avventura, la cui presenza, per me, fa la

differenza in ogni cosa. Grazie alla Madi, per l’amicizia duratura e indissolubile che

ci lega e per le tante premure che ha per me.

E poi voglio ringraziare tutti gli amici del sabato sera, ma non solo: Bafo, Alessia,

Stepo, Vascio, Peddy, Alle, Dalla, Vensan (il bello e maledettissimo), Mezza, Gavaz,

Paolo, Prince, Ferra, Erika, Kiappo, Marino, Deno, Silvia e Sara. Una menzione

particolare spetta al Melviu, che devo ringraziare sia perchè sta per rendere la Madi

la donna più felice del mondo, sia per tutto il supporto tecnico e informatico che, con

infinita gentilezza, mi ha sempre dato.

Grazie alla FUCI, Don Marco e Clara per aver arricchito la mia esperienza

universitaria offrendomi uno sguardo sul mondo più ampio di quello tecnico-

scientifico.

Voglio ringraziare i miei nuovi amici di chimica, con cui ho pranzato negl’ultimi sei

mesi: Martina, Botta, Tonni, Losia (che è senza dubbio matta, ma simpaticissima),

Andrea. Grazie per la compagnia e per avermi iniziato allo yogurt Muller.

Grazie a mia cugina Barbara, per essere stata la “pranoterapeuta” dei miei libri.

Vorrei anche ringraziare sentitamente Anna e Rudy Melegari, per avermi ospitato a

pranzo e cena ogni volta (spesso) in cui si presentava l’occasione.

Infine, il ringraziamento a cui tengo in assoluto di più spetta ad Andrea, Mello per

tutti e anche per me. Con lui, che non mi ha MAI fatto sentire seconda a nessuno,

voglio condividere la gioia, la soddisfazione e il merito di questo traguardo. Pur non

Ringraziamenti

essendone cosciente, tu conosci il significato di dedizione e cura più di chiunque

altro io conosca. Grazie per avermi cercata tanto tempo fa e avermi amata da

allora. Sei la mia gioia e il mio tesoro.

LA FLESSIBILITA' NELLA VALUTAZIONE DELLE INTERAZIONI...

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