Interattori molecolari nel controllo Interattori molecolari nel controllo delladella

tolleranza immunetolleranza immune

Dott. Fortunato Ferrara Tutore e Relatore:Dott. Alberto Tommasini

L’omeostasi del sistema immunitarioL’omeostasi del sistema immunitario

Protezione dai Protezione dai microrganismimicrorganismi

Tolleranza verso Tolleranza verso il SELFil SELF

CD4+ CD25+CD4+ CD25+

Cellule T regolatorieCellule T regolatorie

Tolleranza perifericaTolleranza periferica- Svolta principalmente dalle cellule T regolatorie.- Controllano e sopprimono la reattività contro il selfdi linfociti T “sfuggiti” alla selezione timica.

Tolleranza centrale:Tolleranza centrale:Selezione positiva- Corteccia timica. - Timociti immaturi.- Riconoscimento della molecola MHC esposta dalle cellule dell’epitelio timico.- Il non riconoscimento porta alla delezione.Selezione negativa- Zona interna (midollare) del timo.- È controllata da cellule presentanti l’antigene (APC). - Timociti con alta affinità per gli antigeni self presentati dalle APC vengono eliminati.

Ruolo delle CD4Ruolo delle CD4++ Treg nelle situazioni di “normalità” Treg nelle situazioni di “normalità”o patologicheo patologiche

CD4+CD25+

Treg

Self Foreign Patogeni Tumori

Trapianti

Protezione dallosviluppo di patologie

autoimmuni Controllo dei processi immunitari

Teff

-

Cellule Teff autoreattive “sfuggite” alla selezione timica

Cellule Teff contro i non-self

Dalla clinica alla ricerca di baseDalla clinica alla ricerca di base

Il caso di Lorenzo…

-Risposta solo parziale a nutrizione parenterale totale (non allergia!)-Nei mesi successivi si verificano diversi episodi di polmonite interstiziale, di eziologia incerta, accompagnati da peggioramenti dell'eczema e della diarrea, -Biopsia intestinale: enteropatia autoimmune. -Nel 2° anno anemia emolitica, alopecia e DMT1

Presente nei primi Presente nei primi anni di vita:anni di vita:

- IDDMIDDM- Severa enteropatiaSevera enteropatia- Disordine epidermiciDisordine epidermici- Fenomeni autoimmuniFenomeni autoimmuni varivari

Autoanticorpi contro:Autoanticorpi contro:

TiroideTiroideReneReneIsole pancreaticheIsole pancreaticheIntestino tenueIntestino tenue

Piastrine ed altroPiastrine ed altro

Disregolazione immunologicaDisregolazione immunologicaPoliendocrinopatiaPoliendocrinopatiaEnteropatiaEnteropatiaTrasmissione X-linked recessivaTrasmissione X-linked recessiva

IIPPEEXX

Mancato funzionamento cellule Treg

FoxP3 nelle cellule TregFoxP3 nelle cellule Treg• Foxp3Foxp3 è un è un fattore trascrizionalefattore trascrizionale – – FKHFKH family – specifico per le cellule T family – specifico per le cellule Tregreg

• E’ il E’ il master regulatormaster regulator per lo sviluppo e la funzione delle cellule€ Tper lo sviluppo e la funzione delle cellule€ Tregreg

• Le Le mutazionimutazioni del gene Foxp3 portano alla comparsa dell’IPEX del gene Foxp3 portano alla comparsa dell’IPEX

Come fattore trascrizionale:Come fattore trascrizionale:Regolatore/soppressore della produzione di Regolatore/soppressore della produzione di citochinecitochine

NFAT NFAT ee NF-kappaB NF-kappaB

Blocca/regola la capacità di esprimere proteine chiave per la produzioneBlocca/regola la capacità di esprimere proteine chiave per la produzionedi citochine ed altri fattori essenziali all’attivazionedi citochine ed altri fattori essenziali all’attivazione

Ο = missense point mutations = deletion/frameshift mutations = splicing mutations

Induzione alla trascrizione di alcuni geni

Soppressione della trascrizione di altri geni

Il ruolo “Il ruolo “a vallea valle” di FOXP3” di FOXP3

NFAT

…“…“a montea monte” ” di FOXP3di FOXP3

Foxp3

?

Identificazione delle proteine che interagiscono con FOXP3, permettendo la localizzazionee funzione

Patologie – IPEX like

Interessante analizzare la cascata di eventi molecolari che portano alla attivazioneInteressante analizzare la cascata di eventi molecolari che portano alla attivazionedi FOXP3di FOXP3

Analisi degli interattoriAnalisi degli interattori

Obbiettivi:Obbiettivi:

1- Produzione di Foxp3 come proteina ricombinante

2- Valutazione di diverse metodiche biomolecolari per isolamento di potenziali nuovi interattori

PBL cellsPBL cells

mRNAmRNAcDNAcDNA

PCR PCR amplificationamplification

N-termN-term

Zn-fingZn-fing

FKHFKH

FOXP3 + MalFOXP3 + MalCirca 90KDaCirca 90KDa

1 - Produzione di Foxp3 in forma ricombinante1 - Produzione di Foxp3 in forma ricombinante

ProduzioneProduzione

RiconoscimentoRiconoscimentoproteina con proteina con Ab-specificoAb-specifico

PurificazionePurificazione

Foxp3Foxp3

2.1 - Co-precipitazione2.1 - Co-precipitazione

Foxp3MBP

AmilosioAmilosio

AmilosioAmilosio

MBP

MW

90 Kda

85 Kda

75 KDa

45 KDa

Foxp3MBP

MBP

MW

45 Kda

25 Kda

15 KDa

2.2 Immuno-precipitazione2.2 Immuno-precipitazione

Foxp3

MBP

Y

Y Y

Proteina GProteina GF

oxp3

MB

P

YY

Y

Phage display antibody librariesPhage display antibody libraries

mRNA

cDNA

PCR

assembly

PCR

Helper phageLymphocytesV

H

CH

1C

H2

CH

3

VL

CL

linker

scFv cloning

Amp

Gene IIIscFv

Phagemidvector Ori

Transformation

E. coli

gene III

scFv

VVLL

VVHH

VVLL

VVHH

VVLL

VVHH

ELISAELISA

WBWB

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

kE7 kE12 kF5 λG3 λG6Foxp3

CH3CH3

CH2CH2

SV5SV5

Minibody

ImmunoprecipitazioneImmunoprecipitazione

Foxp3

MBP

Y

Y Y

Foxp3

MBP Y

Y Y

Verifica della metodica Per interattori noti (NFAT/NfkB)

Amp

Gene IIIscFv

Vettore pPAOfagmidico Ori

cDNA frammentazioneCellule o tessuti

displaydisplay di peptidi casualidi peptidi casuali

2.3 Costruzione di libreria di cDNA di cellule Treg2.3 Costruzione di libreria di cDNA di cellule Treg

FP3

Isolamento cloni più reattivi

sequenziamento

Analisi sequenze:- 25 cloni selezionati- 24 riconfermano uno stesso peptide- 1 peptide diverso

Zn FKHPRR FOXP3

PRRZn

FKH

Analisi dell’interazione con i domini

0

200

400

600

800

1000

1200

sequenza 1 sequenza 2

FP3 intero

N-term

Zinc

FKH

-Il clone di “tipo 1” è specifico per l’interazione con il dominio Zinc-finger-Il clone di “tipo 2” riconosce la proteina intera ma non uno dei singoli domini: eventuale effetto di mancata conformazione dei domini ricombinanti

BLAST:Sequences producing significant alignments: Score E valuesolute carrier family 25, member 23 [Homo sapiens] 176 4e-43putative calcium binding transporter [Homo sapiens] 175 7e-43

La maggioranza dei cloni (24/25) codificano per una peptide di 100a.a.

Q96NQ4_HUMAN_Q96NQ4EfhandNo descriptionEF_HAND_2EF_HAND_1

No description

CalmodulinCalcineurin

INTER PRO SCAN

signaling proteins

These proteins typically undergo a calcium - dependent conformational change which opens a target binding site.

BLAST:Sequences producing significant alignments: Score E value

matrix metalloproteinase-3 224 2e-57

INTER PRO SCAN

MATRIXINPeptidase_M10

No description

No descriptionMATRIXMETALLOPROTEINASESTROMELYSIN

Il restante clone:

They are zinc- dependent, calcium-activated proteases

interattore

FP3

YY

AP

Clone selezionato (dominio EFH) prodotto in forma ricombinante

Analisi di omologia clone isolato con dominio EFH della calcineurina BAnalisi di omologia clone isolato con dominio EFH della calcineurina B

a – calcineurina Ba – calcineurina Bb – NFATb – NFATc – Foxp3c – Foxp3

interattore

FP3

YY

AP

Calc B

FP3

YY

AP

EFH calcB

FP3

YY

AP

C’è la possibilità che i peptidi selezionati non identificano reali proteine coinvolte nel C’è la possibilità che i peptidi selezionati non identificano reali proteine coinvolte nel network di attivazione di FOXP3, ma solo “motivi strutturali” coinvolti.network di attivazione di FOXP3, ma solo “motivi strutturali” coinvolti.

RisultatiRisultati-Validato il sistema delle librerie anticorpali fagiche per la selezione e produzione di Validato il sistema delle librerie anticorpali fagiche per la selezione e produzione di efficaci anticorpi ricombinanti contro Foxp3.efficaci anticorpi ricombinanti contro Foxp3.

-Messa a punto di un protocollo di immunoprecipitazione per successive conferme di Messa a punto di un protocollo di immunoprecipitazione per successive conferme di ulteriori interattori molecolari di Foxp3.ulteriori interattori molecolari di Foxp3.

-Capacità di isolare mediante librerie peptidiche fagiche potenziali nuovi domini Capacità di isolare mediante librerie peptidiche fagiche potenziali nuovi domini proteici interagenti con Foxp3.proteici interagenti con Foxp3.

-Verificata l’interazione tra Foxp3 ed una struttura calcio legante (EFH).Verificata l’interazione tra Foxp3 ed una struttura calcio legante (EFH).

……sviluppi futuri e futuribilisviluppi futuri e futuribili

-Confermare la potenziale interazione caratterizzata in una proteina “fisiologicamente Confermare la potenziale interazione caratterizzata in una proteina “fisiologicamente significativa”.significativa”.

-Utilizzare gli anticorpi ricombinanti prodotti e caratterizzati in altri saggi sperimentali, -Utilizzare gli anticorpi ricombinanti prodotti e caratterizzati in altri saggi sperimentali, anche con possibile sviluppo clinico-prognostico (immunoistochimica su tessuti anche con possibile sviluppo clinico-prognostico (immunoistochimica su tessuti tumorali o sedi di infiammazioni croniche).tumorali o sedi di infiammazioni croniche).

-Messa a punto di una librerie peptidica fagica maggiormente specifica per descrivere -Messa a punto di una librerie peptidica fagica maggiormente specifica per descrivere il complesso proteico caratteristico delle cellule Treg.il complesso proteico caratteristico delle cellule Treg.