Cap. 3 La replicazione del DNA pp. 66-89 e la struttura del

genoma umano

Sintesi 03

• La replicazione del DNA è semiconservativa: un’elica serve da stampo e viene mantenuta invariata, l’altra viene sintetizzata ex novo.

• La replicazione richiede l’intervento di enzimi: RNA e DNA polimerasi, ligasi, elicasi e topoisomerasi

• Nei procarioti la replicazione procede da un unico punto iniziale, negli eucarioti ciascun cromosoma ha varie origini di replicazione da cui iniziano sintesi simultanee

• Note sul progetto Genoma Umano

Colture di cellule di porcellino d’IndiaAggiunta di 5-BUdR, analogo della timina, con minore tendenza a legarsi al colorante fluorescenteDue cicli di replicazione:1.TT, TT 2. TU, UT 3.TU, UU

Cromosomi arlecchino

Prova citologica della replicazione semiconservativa

La replicazione del DNA è semiconservativa

Le DNA Polimerasi

• Possono aggiungere un nucleotide all’estremità 3’ libera di una catena di acido nucleico, se dispongono di nucleotidi trifosfati

• Possono rimuovere un nucleotide all’estremità 3’ o 5’ di una catena di acido nucleico

• Non possono iniziare la replicazione se non dispongono di una catena con l’estremità 3’ libera

• Non possono legare fra loro due frammenti di DNA

Le DNA P di Escherichia coli

Nella replicazione di Escherichia coli

DNA stampo (elica singola) + primer + dATP, dCTP, dGTP, dTTP

una DNA polimerasi

DNA a doppia elica Energia di legame

5’---(n-nucl)---3’ + dXTP 5’---(n+1-nucl)---3’ + energia

La DNAP III:10. Allunga la doppia elica in direzione 5’—3’11. Controlla l’appaiamento fra basi, e se è imperfetto rimuove l’ultimo

nucleotide aggiunto (attività proof-reading)La DNAP I:• Degrada l’RNA nella doppia elica in direzione 5’—3’ • Allunga la doppia elica, estendendo il frammento in direzione 5’—3’ e

rimpiazzando l’RNA stampoLa DNA PII ripara il DNA danneggiato

Inizio della replicazione; elica leading e elica lagging

Primosoma: il complesso costituito da elicasi e

RNA polimerasi

La “bolla replicativa”

La replicazione procede nelle due direzioni a partire dalla forcella

Frammenti di Okazaki

Meccanismo d’azione delle

DNA P III batteriche

Alla fine per legare fra loro i frammenti ci vuole la ligasi

La ligasi catalizza la formazione di un legame fosfodiestereo

Schema dei passaggi enzimatici nella replicazione di E. coli (1)

Schema dei passaggi enzimatici nella replicazione di E. coli (2)

Schema di replicazione di un cromosoma procariote

(nella foto, SV40)

Durante la replicazione i

superavvolgimenti sono un problema:

girasi

Durante la replicazione i superavvolgimenti sono un problema:

topoisomerasi

Schema dei passaggi enzimatici nella replicazione di E. coli

• La topoisomerasi fa rilassare il filamento• Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e

svolgono un tratto della doppia elica• Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad

elica singola, senza coprire le basi• La RNA polimerasi (primasi) si lega all’elicasi e sintetizza un

innesco di circa 30 paia di basi• La DNA P III lo estende da 5’ a 3’• Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti

sbagliati (proof-reading)• La DNA P I degrada l’innesco ed estende il frammento

adiacente, procedendo da 5’ a 3’

• La ligasi salda i filamenti adiacenti, senza aggiungere alcun nucleotide

Due eccezioni

ΦX174: DNA a singolo filamento

DNA P

DNA P

Due eccezioni

Mosaico del tabacco: RNADNA P*

* DNA polimerasi RNA dipendente! (trascrittasi inversa)

DNA P

Ciclo cellulare in eucarioti e procarioti (ore)

Organismo M G1 S G2 Totale

E. coli 1Lievito 20’ 25’ 40’ 35’ 2Piante 1 8 12 8 29Uomo 1 8 10 5 24

Velocità di replicazione:E. coli: 50000 basi al minutoDrosophila: 2600 basi al minutoTopo: 2200 basi al minuto

I cromosomi eucarioti sono

lineari, non circolari

Nei cromosomi degli eucarioti ci sono varie unità di replicazione

Progressione delle bolle di replicazione lungo il cromosoma eucariote

ARS: Autonomous-Replication Sequences

Negli eucarioti superiori

DNA P α: sintesi dell’elica lagging e del primerDNA P β: riparazione del DNA nucleareDNA P γ: replicazione, solo nei mitocondri DNA P δ: sintesi dell’elica leadingDNA P ε: riparazione del DNA nucleare

SPECIE Dim. Genoma N repliconi velocità replicaz.

E. coli: 4,2 Mb 1 50000

Drosophila: 140 Mb 3500 2600

Topo: 3200 Mb 25000 2200

In sintesi, negli eucarioti superiori

E alla fine?

Telomerasi

Le regioni terminali dei cromosomi (telomeri) contengono sequenze ripetute:Ciliati (Tetrahymena): n(TTGGGG)Flagellati (Trypanosoma), uomo: n(TTAGGG)

L’enzima telomerasi contiene un tratto di RNA complementare alla sequenza ripetuta e lo usa come primer per replicare l’estremità telomerica 5’

Azione della telomerasi in Tetrahymena

L’efficienza della telomerasi è incompleta. La perdita di regioni terminali provoca forme di morte cellulare associate all’invecchiamento

Negli eucarioti, sintesi e

degradazione di cicline,

prodotte da geni-orologio

regolano il ciclo cellulare

Organizzazione generale (fonte: HUGO)

Total genome 3200 Mb

Genes and related sequences 1200 Mb Intergenic DNA 2000 Mb

Exons 48 Mb PseudogenesIntrons, UTRs

Interspersed repeats 1400 Mb

Other intergenic regions 600 Mb

LINEs 640 Mb

SINEs 480 Mb

DNA transposons 90 Mb STRs 90 Mb

Organizzazione generale (fonte: Guelph University)

Allineamento uomo-topo

Allineamento uomo-scimpanzè

Chimp chromosomes 2 and 2a

Total size 3 200 000 000 (haploid)As + Ts 54%Cs + Gs 38%Bases not yet determined 8%N of genes 20 000 to 25 000Highest gene-dense chromosome 19 (23 per 1 000 000 bp)Lowest gene-dense chromosome 13 and Y (5 per 1 000 000 bp)DNA spanned by genes 25% to 38% exons 1.1% to 1.4% introns 24% to 37%Avg. size of a gene 27 000Longest gene Dystrophin, 2 400 000Nucleotide differences with chimp 1.23%Chimp orthologue genes 13 454Human genes missing in chimp 36 totally, 17 largelyClasses of genes with max. differences immune response,

reproduction, olfaction

Alcune statistiche

Fonte: CSAC (2005)

Human genes are less than 30,000, but they have a complex architecture that we are only beginning to understand.

-We know where 85% of genes are in the sequence.

-We don’t know where the other 15% are because we haven’t seen them on (they may only be expressed during fetal development).

-Because more than 80 000 proteins are known, most genes code for several proteins.

-So far we only know what 30% of our genes do.

It is relatively easy to locate genes in the genome, but it is hard to figure out what they do

The genetic code of life cracked by scientists?

Well, not really

Riassunto 03

• La replicazione del DNA è semiconservativa: un’elica serve da stampo e viene mantenuta invariata, l’altra viene sintetizzata ex novo.

• La replicazione richiede l’intervento di enzimi: RNA e DNA polimerasi, ligasi, elicasi e topoisomerasi

• Nei procarioti la replicazione procede da un unico punto iniziale, negli eucarioti ciascun cromosoma ha varie origini di replicazione da cui iniziano sintesi simultanee

• Stiamo cominciando a capire come sono fatti i genomi