Cap. 4 Controllo genetico delle proteine pp. 94-111

Sintesi 04•Ogni sequenza di amminoacidi in un peptide è codificata da una sequenza di nucleotidi in un gene•Le prime relazioni ipotizzate fra DNA e proteine sono state: un gene – un enzima e un gene – un polipeptide•Colinearità: una sequenza di nucleotidi – una sequenza polipeptidica•I geni controllano le reazioni metaboliche controllando la produzione di enzimi; alterazioni della sequenza genica si riflettono in alterazioni della sequenza proteica•Nei vertebrati, meno del 10% del genoma codifica per proteine; il dibattito su ruolo e funzione del restante 90% è aperto

Fare le proteine non

è uno scherzo

Le proteine hanno:1. Una struttura primaria, data dalla successione degli

amminoacidi nel peptide2. Una struttura secondaria, cioè un andamento

regolare in alcuni tratti, dovuto al ripetersi periodico di amminoacidi con caratteristiche costanti. Es.: -elica, foglietto

3. Una struttura terziaria, tridimensionale, dovuta alle interazioni fra amminoacidi, e fra amminoacidi e ambiente

4. (non sempre) una struttura quaternaria, quando diversi peptidi si uniscono a formare una proteina complessa, multimerica

Che rapporti fra proteine e geni?

Analisi biochimica delle malattie metaboliche: alcaptonuria

Fenotipo: urina scura

Neurospora

Genetica biochimicaBeadle e Tatum: un gene – un enzima

Colture di Neurospora

Terreno minimo: Sali inorganici, una fonte di C (glucosio o saccarosio), una fonte di N, biotina

Terreno completo: terreno minimo + tutti gli amminoacidi, tutti i nucleotidi e vitamine

Indvidui prototrofi e auxotrofi (o mutanti nutrizionali)

Isolamento di mutanti

nutrizionali

Esperimenti di Beadle e Tatum

Mutanti di Neurospora auxotrofi per l’arginina, o arg-

Ceppi diversi portano la mutazione in tre diverse regioni del genoma: arg-1, arg-2 e arg-3

Mutanti arg-3 crescono solo se al terreno minimo si aggiunge arginina; mutanti arg-2 se vengono aggiunte arginina o citrullina; mutanti arg-1 se vengono aggiunte arginina o citrullina o ornitina

Esperimenti di Beadle e Tatum: un gene – un enzima

Conclusioni: arg-1, arg-2 e arg-3 codificano per tre enzimi che intervengono in successione nella conversione di un precursore in ornitina, di questa in citrullina, e di questa in arginina

arg-1 arg-2 arg-3

enzima 1 enzima 2 enzima 3

precursore ornitina citrullina arginina

Beadle e Tatum deducono le catene di rezioni biochimiche (e l’ordine di azione dei geni) dalle

molecole che si accumulano nei mutanti

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM

Welcome to OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man. This database is a catalog of human genes and genetic disorders authored and edited by Dr. Victor A. McKusick and his colleagues at Johns Hopkins and elsewhere, and developed for the World Wide Web by NCBI, the National Center for Biotechnology Information. The database contains textual information and references. It also contains copious links to MEDLINE and sequence records in the Entrez system, and links to additional related resources at

NCBI and elsewhere.

Sequenza proteica: determinabile con il metodo di Sanger

1. Si purifica la proteina, cioè la si separa da impurità e da altre specie chimiche;

2. La si degrada per mezzo di enzimi proteolitici, ognuno dei quali agisce solo se c’è uno specifico amminoacido all’estremità carbossi-terminale.

Yanofsky: Colinearitàgene TrpA di Escherichia coli

TYR LEU THR GLY

CYS LEU THR GLY

TYR ARG THR GLY

TYR LEU ILE GLY

TYR LEU THR ARG

Diversi mutanti (1-4) non sintetizzano triptofano perché l’enzima necessario (TrpA) è modificato. La posizione dell’amminoacido alterato nei mutanti può essere determinata per sequenziamento peptidico

1

2

3

4

wt

Yanofsky: Colinearitàgene TrpA di Escherichia coli

TYR LEU THR GLY

CYS LEU THR GLY

TYR ARG THR GLY

TYR LEU ILE GLY

TYR LEU THR ARG

1

2

3

4

wt

ATA GAC TAT GGG

ACA GCC TGT AGG

mut1 mut2 mut3 mut4

Corrispondenza fra le posizioni di mutazione nucleotidica e sostituzione amminoacidica

Variabilità delle emoglobine umane

Variabilità delle emoglobine umane

Tutto il DNA fa proteine?

NO:Nell’uomo, 3 miliardi di bp; 30 000 geniDimensioni medie di un gene 10 000 bpTotale geni umani 300 milioni di bp 10% del genoma

E il resto?

Regioni non geniche:--GTTCCACACACACACACACACACACACACACATTA—

DNA spazzatura (junk DNA)?

Cosa fa il DNA non genico?

1. Regola il funzionamento degli altri geni (Zuckerkandl)2. Niente, ma male non fa: junk DNA (Ohno)3. Parassita il resto del DNA: selfish DNA (Orgel e Crick;

Dawkins)4. Fa da scheletro al resto del DNA (Cavalier-Smith)

Cosa fa il DNA non genico?

1. Regola il funzionamento degli altri geni (Zuckerkandl)2. Niente, ma male non fa: junk DNA (Ohno)3. Parassita il resto del DNA: selfish DNA (Orgel e Crick;

Dawkins)4. Fa da scheletro al resto del DNA (Cavalier-Smith)

Qualche dato:La perdita di ampli tratti di DNA non genico non ha effetti

fenotipici: 1. non valida il generale.Replicare una grande quantità di DNA è costoso: 2. poco

probabile.In certi casi, variazioni del volume cromosomico

provocano variazioni del volume del nucleo, ma 4. non è valida il generale.

Cosa c’è in un cromosoma tipico

LINE: Long Intespersed Elements SINE: Short Intespersed Elements

35%

DNA ripetuto: tandem repeats, Elementi interdispersi corti (SINE) e lunghi (LINE)

100-300 bp

5000-35000 bp

Short tandem repeats, o STR (microsatellite): 1-6 bp, ripetuti da alcune volte a decine di volte

Variable-number of tandem repeats, o VNTR (minisatellite): più lunghi, ripetuti da alcune volte a decine di volte

VNTR

DNA fingerprintingAlec Jeffreys et al.: Hypervariable minisatellite

regions in human DNA, Nature, 314:67-73, 1985.

DNA fingerprinting: un’applicazione

DNA fingerprinting: un’applicazione

DNA fingerprinting in Yersinia pestis

1.: antiqua2.: medievalis3.: orientalis4., 5. ceppi sconosciuti

DNA fingerprinting: un caso di paternità

DNA fingerprinting: un caso di violenza

sessuale

Riassunto 04•Beadle e Tatum dimostrano in Neurospora che c’è una corrispondenza diretta un gene – un enzima• Yanofsky dimostra in E. coli la colinearità fra sequenza di nucleotidi e sequenza polipeptidica• Alterazioni della sequenza genica si riflettono in alterazioni della sequenza proteica: malattie del metabolismo•Nei vertebrati, meno del 10% del genoma codifica per proteine; il dibattito su ruolo e funzione del restante 90% è aperto