Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA

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Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA a.a.2015-2016 Pier Franco Pignatti 14.10.2015 Lezioni N. 9-10 Mutazioni e malattie genetiche (Neri-Genuardi cap. 2,18,23) Mutazioni spontanee e indotte, mutagenesi, tipi di mutazione in malattie genetiche

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Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare

GENETICA

a.a.2015-2016

Pier Franco Pignatti

14.10.2015

Lezioni N. 9-10

Mutazioni e malattie genetiche

(Neri-Genuardi cap. 2,18,23)

Mutazioni spontanee e indotte, mutagenesi, tipi di mutazione in malattie genetiche

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Mutazione: una definizione

Mutazione: una alterazione della sequenza del DNA rispetto al normale

Polimorfismo : una variante con frequenza > 1% nella popolazione

NOTA: in medicina è invalso l’uso di chiamare “mutazione” una variazione del DNA ritenuta causa di patologia, e “polimorfismo” una variazione del DNA non ritenuta causa di patologia

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Mutazione: caratteristiche

Insorgenza: casuale, preadattativa

Sede: somatica, germinale

Livello: genica, cromosomica, genomica

Meccanismo: sostituzione, inserzione, ripetizione, inversione, espansione, delezione, riarrangiamento

Cause: endogene, esogene

Effetti evolutivi: neutra, svantaggiosa, vantaggiosa

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Stima diretta della frequenza di mutazione

La stima diretta è probabilmente una sottostima a causa di:

penetranza incompleta, fenocopie, eterogeneità genetica, non

paternità, “polimorfismi”, riparazione, letalità…

Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Saunders 1986

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Livello e frequenza di mutazione

Se un gamete ha 20.000 geni, allora il 2-20% dei

gameti avrà almeno una nuova mutazione genica

*

*

Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Saunders 1986

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Frequenza di mutazione: stime recenti

Il tasso di mutazione per sostituzione di base nella linea germinale è circa 10-8 per coppia di basi per generazione (sequenziamento ad alta densità di 2 trii padre, madre, figlio). Ogni figlio avrebbe perciò circa 60 nuove mutazioni (The 1000 Genomes Project, 2010).

Stima di 70 nuove mutazioni per genoma umano diploide per ogni generazione (Roach JC et al 2010)

Circa 29 mutazioni codificanti per generazione (Genome Research, 30 aprile 2015).

Circa 3 indels (1-20bp) e 0,2 varianti strutturali (>20bp) per generazione (Kloosterman WP et al 2015)

Circa 1/30 individui non selezionati hanno una mutazione con probabile perdita di funzione (pLOF) precedentemente associata con una patologia (Johnston JJ et al 2015)

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The offspring of older fathers harbor a higher percentage of de novo mutations.

(Francioli L C et al. 2015)

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Tipi di mutazione

Strutturali : sostituzione nucleotidica, inserzioni, delezioni, inversioni, duplicazioni, riarrangiamenti

Regolative : trascrizionali o post-trascrizionali, nel promotore o in altre sequenze di regolazione, modificazione dello splicing

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Mutazioni con perdita di funzione

Per la maggior parte dei prodotti genici la quantità esatta non è essenziale: la maggior parte delle mutazioni con perdita di funzione produce fenotipi recessivi, il che significa che una persona che abbia una sola copia funzionale del gene sarà fenotipicamente normale.

In alcuni casi però il 50% del livello normale non è sufficiente per la funzione normale: persone eterozigoti per una mutazione con perdita di funzione mostrano un fenotipo che è perciò ereditato come un carattere dominante. Questo si chiama aploinsufficenza.

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Perdita di funzione

Read A e D Donnai, New Clinical Genetics 2° ed. Scion 2011

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Mutazioni con guadagno di funzione

Mutazioni con guadagno di funzione sono più rare. Determinano fenotipi dominanti

Es: Acondroplasia e Malattia di Huntington

Fenotipi dominanti anche nel caso in cui il prodotto dell’allele mutato interferisca con la funzione del prodotto normale: effetto dominante negativo

Es: Osteogenesi Imperfetta

Strachan e Read 4th ed

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Effetto dominante negativo in OI

I difetti del gene COL1A1 sono più gravi perché il collagene tipo I ha 2 catene alfa-1 e 1 catena alfa-2. Quindi le mutazioni di alfa-1 determinano il 75% di eterotrimeri anomali come indicato in Figura. Invece le mutazioni di alfa-2 producono il 50% di eterotrimeri anomali.

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Mutazioni spontanee

Avvengono durante la vita normale della cellula, cioè in individui non esposti a mutageni o radiazioni. Costituiscono il materiale usato dalla selezione naturale per l’evoluzione biologica.

Cause possibili: tautomeria, deaminazione, depurinazione delle basi, radicali liberi, errori replicativi, riparativi o ricombinativi

E. Friedberg, DNA Rapair, Freeman 1985

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Deaminazione

Le transizioni C/T rappresentano il 35-50% di tutte le mutazioni

puntiformi nell’uomo. Il dinucleotide CpG muta per deaminazione

8,5 volte più dell’atteso: 5MeC è “hot spot” di mutazione (anche C

viene deaminata a U, ma il DNA può essere riparato)

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Mutazioni indotte

Mutageni fisici

Radiazioni ionizzanti (raggi X, gamma, cosmici, radioattività artificiale e naturale)

Radiazioni UV

Mutageni chimici

Deaminanti, analoghi delle basi, alchilanti, intercalanti, prodotti di pirolisi, sostanze naturali, prodotti sintetici

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Mutagenesi da raggi X

Hartl. Genetica Umana, Zanichelli 1986

(senza frazionamento di dose)

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Curtoni et al, Manuale di Genetica, UTET 1991

Esposizione prenatale alle esplosioni atomiche

8-15 settimane: divisione e migrazione delle

cellule nervose nella corteccia cerebrale

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Effetti dell’incidente nucleare di Chernobyl

(Aprile 1986)

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Deaminanti

Analoghi delle basi

Alchilanti

Intercalanti

Hartl, Genetica Umana, Zanichelli 1996

Alcuni mutageni chimici

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Mutageni ambientali

Sostanze naturali: es. aflatossina

Prodotti di pirolisi: es. cibi cotti, tabacco

Prodotti sintetici: es. additivi alimentari, cosmetici, tinture permanenti per capelli, farmaci citostatici e immunodepressivi, insetticidi e fungicidi, erbicidi e fitormoni, prodotti per la casa (ipoclorito sodio), il lavoro (cloruro vinile, diossina), nella atmosfera (formaldeide, fumo di sigaretta)

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Mutageni e cancerogeni

his-

Revertenti

his

Test di Ames per tre tinture di capelli

Test di mutagenesi di Ames

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NEJM 330:907, 1994

Il costo umano dell’uso del tabacco

Più di 5 milioni di morti/anno: la prima causa mondiale di morte prematura prevenibile

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Mutazioni puntiformi

Guttmacher e Collins, NEJM 2002

Sinonima o silente

Sostituzione conservativa

Sostituzione non conservativa

Terminazione

Scivolamento del modulo di lettura

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Mutazioni per sostituzione di base

transizioni , transversioni

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Mutazione di sostituzione di AA o Missenso:

betas-globina in falcemia o drepanocitosi

Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

Transversione GAG>GTG (p.6 Glu>Val)

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Mutazione di terminazione o Nonsenso:

HBB p.Gln39X in beta°-talassemia

Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

Transizione CAG>TAG

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Farmaco anti terminazione prematura

25 MAGGIO 2014 - L’Agenzia europea dei medicinali (EMA) ha dato l’approvazione condizionale alla commercializzazione di Translarna TM

(Ataluren) per il trattamento della distrofia muscolare di Duchenne e della Fibrosi Cistica con mutazione non senso (nmDMD e nmCF).

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Mutazione da delezione di 1 nucleotide o

Frameshift in gene GJB2 e sordità AR

Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

6G

5G

c.35delG gene connessina 26 (GJB2)

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Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

Se il codone di Terminazione Prematura (PTC) è nella zona

rossa, l’Exon Junction Complex (EJC) non si stacca e

l’mRNA è degradato.

Es: NMD degrada maggior parte mRNA BRCA1 con PTC

Degradazione dell’mRNA da mutazione

nonsenso o Nonsense Mediated Decay (NMD)

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Varianti strutturali

Le varianti strutturali a volte sono implicate in patologie, più

spesso rappresentano semplici differenze interindividuali

Check E, “Human genome: patchwork people”, Nature 2005

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Delezioni esoniche in DMD e BMD

Read-Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

“Regola della cornice di lettura”

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CNVs o Copy Number Variants

CNVs o Copy Number Variants: tratti di DNA ripetuti

più lunghi di 1 kb che mostrano differenze del

numero di copie nella popolazione normale

Espressione diversa dei geni con diverso numero di

copie

Mappa ad alta risoluzione di 20 europei e 20

africani per CNVs: frequenza >5%

Possibile associazione con malattie come Autismo,

Schizofrenia, Attention Deficit Hyperactivity

Disorder (ADHD)

Conrad DF et al Nature 2009

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CNVs in Autismo

Trovate 277 CNVs, delle quali 13 ricorrenti, in 427 pazienti.

ACRD: Autism Chromosome Rearrangement Database

(Marshall CR et al. 2008)

La ricerca delle CNV fa parte ormai della valutazione

diagnostica iniziale di malattie dello spettro autistico ed altre

malattie con ritardo mentale e dello sviluppo

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Crossing-over fra sequenze alleliche

Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

Scambio reciproco: sono prodotti geni di fusione senza ins/del

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Crossing-over fra sequenze non alleliche

Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

A: crossing

over diseguale

(UEC) B: scambio

diseguale fra

cromatidi fratelli

(UESCE)

Sono prodotte inserzioni e delezioni

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Crossing-over diseguale in emoglobinopatie

Harris, Genetica Biochimica Umana, Zanichelli 1972

Emoglobine Lepore

Cr. 11p15.5

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C-o diseguale in geni per la visione dei colori

Connor e Ferguson-Smith Essential Medical Genetics Blackwell 1993

Xq 28: 1 copia gene pigmento rosso e 1-3 copie verde

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Dosaggio genico in CMT1A e HNPP

Il gene PMP22 (cr.17) codifica per il componente principale della mielina. Ripetizioni a basso numero di copie (REP) fiancheggiano il gene. CMT1A: Polineuropatia demielinizzante di Charcot-Marie-Tooth tipo 1A HNPP: Neuropatia ereditaria con paralisi da pressione

Lupski JR, “Genomic disorders ten years on” 2009

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FISH per il gene PMP22 in CMT1A e HNPP

Fluorescent In Situ Hybridization con sonda (rosso)

per la regione 17p11.2 contenente il gene PMP22 e

con sonda (verde) di riferimento per il cromosoma 17.

a) duplicazione del gene in CMT1A; b) delezione del

gene in uno dei due cromosomi 17 in HNPP

Neri e Genuardi, Genetica umana e medica, Elsevier Masson 2010

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Conversione genica

Connor e Ferguson-Smith, Essential Medical Genetics, Blackwell 1993

Scambio non reciproco

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Geni CYP21 e C4 del complemento duplicati nella regione HLA. 21A:

pseudogene. 21B: gene espresso steroido-21-idrossilasi. Mutazioni 21B:

iperplasia surrenale congenita con diminuita produzione di cortisolo. Tre

forme: con perdita di sali (inattivazione genica), semplice virilizzante

(attività enzimatica ridotta a circa il 2%), o non classica attenuata con inizio

tardivo solo nelle femmine (attività enzimatica ridotta a circa 10%-75%)

Ricombinazione gene CYP21

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Strachan e Read, Genetica Umana Molecolare, UTET 2000

Microconversione nel gene CYP21

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Inversione

Lewin B, Il Gene, Zanichelli 1985

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Inversione gene F8 ed emofilia

Rettangoli rossi: sequenza nell’introne 22 e due copie invertite a monte

del gene. Nella meiosi maschile non c’è partner: si può formare un’ansa

con due copie appaiate con lo stesso orientamento. La ricombinazione

produce una inversione cromosomica di circa 500 kb che interrompe il

gene. Il 40% dei casi gravi di emofilia A è provocato da inversione

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Trasposizione

I trasposoni sono stati scoperti da Barbara McClintock

nel mais negli anni ’40. Premio Nobel nel 1983

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Trasposizione replicativa

Es: il retrotrasposone L1 si può inserire nei

geni F-VIII o DMD: inattivazione inserzionale

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Variazioni in gemelli MZ da retrotrasposizione

con inserzione di L1

Martin SL, “Developmental biology: Jumping-gene roulette”, Nature 2009

Gemelli geneticamente identici al concepimento, ma alla nascita i loro

cervelli sono diversi a causa di nuove inserzioni L1 che avvengono

durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale nel feto. In relazione ai

geni bersaglio ed ai neuroni colpiti dalle inserzioni, i gemelli possono

essere diversi nella funzione o disfunzione cerebrale