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FISIOLOGIA DELLA
EMOPOIESI
EMOPOIESIdefinizione
L’insieme dei processi che regolano il
mantenimento del numero fisiologico
di cellule circolanti del sangue in
condizioni di omeostasi e intervengono
come compenso in situazioni di
perdita/distruzione, o per rispondere
adeguatamente ad un aumento della
richiesta da parte dell’organismo
EMOPOIESImeccanismi di regolazione
CELLULARE: Presenza di cellule con diverse
potenzialità proliferative e
maturative
INTERCELLULARE: Interazione delle cellule
emopoietiche con elementi
cellulari e proteine dello stroma
ESOGENO:
Cell nonautonomous
Fattori di crescita (citochine) ed
altre molecole non citochiniche
(es. ormoni) che hanno la
proprietà sia di stimolare che di
inibire, a diversi livelli,
l’emopoiesi
ENDOGENO:
Cell autonomous
Molecole di regolazione
intracellulare, come le cascate
dei secondi messaggeri ed i
fattori di trascrizione nucleari.
SCF/cKitproteine della matrice/
recettori
citochine
prodotte
distalmente
cellule dello stroma
osteoblasti Notch/Jagged
HSC
CLP CMP
maturazione
stimolatorie
inibenti
sinusoidi midollari
citochine
prodotte
in loco
IL TURNOVER DELLE CELLULE DEL SANGUE
ERITROCITI GRANULOCITI
NEUTROFILI
PIASTRINE
5 x 106 / l 3.6x 103 / l 2 x 105 / l
5 x 1012 / L 3.6x 109 / L 2 x 1011 / L
25 x1012 / PERSONA 18 x 109 / PERSONA 2 x 1011 / PERSONA
120 GIORNI 12 ORE ~ 10 GIORNI
2 x 1011 / DIE 0.36 x 1011 / DIE 1 x 1011 / DIE
200.000.000.000 36.000.000.000 100.000.000.000
IL-7Ra- c-mpl+
LT-HSC
CLP
ST-HSC
Pro-T Pre-T
Pro-B Pre-B
MPP
B/Mf
NK
IL-7Ra+ c-mpl-
CMP
GMP
CFU-M
CFU-G
Epo-R-
Epo-R+
MEPCFU-Meg
BFU-E CFU-E
DC
DC
CELLULE
STAMINALI PROGENITORI PRECURSORIELEMENTI
MATURI
NUMERO DI CELLULE
SPECIALIZZAZIONE FUNZIONALE
PLASTICITA’ FUNZIONALE
ATTIVITA’ MITOTICA
differenziazione
apoptosi
espansione
differenziazione/
automantenimento
quiescenza
HSC
SELF-RENEWAL DIFFERENTIATION
The capacity to
reproduce themselves
The capacity to
generate terminally-differentiated
specialized cells
…..
“Stemness”
genesON OF
Tumor
suppressor
genes
OFF ON
Differentiation
genesOFF ON
CELLULA STAMINALE
EMOPOIETICAmarkers
c-kit
CD34
Thy1
Non espresse
CD10
CD14
CD15
CD16
CD19
CD20
CD38
Fenotipo staminale
CELLULE CD34+
• 1-2% nel midollo
• 0.05% nel sangue periferico
• 0.3-0.5% nel sangue cordonale
• 0.5-3% nel sangue periferico mobilizzato
• >> in condizioni patologiche (IM)
• LTR dopo terapia mieloablativa
• Proteina transmembrana
• Funzione non nota (adesione?)
• 105-120 kD
• Altamente glicosilata
• 3 epitopi diversi (mAb di tre classi)
• Varianti molecolari
IN VIVO IN VITRO
CFU-GEMM
CFU-GM
CFU-Mk
CFU-G
CFU-M
BFU-E CFU-E
16-14 gg 14 gg 7 gg
SISTEMI DI ASSAY DELLE CELLULE
STAMINALI E DEI PROGENITORI:
CELLULE STAMINALI:
in vivo: animali subletalmente irradiati, NOD/SCID,
pazienti sottoposti a trapianto allogenico
in vitro: ?? Colture long-term
PROGENITORI COMMISSIONATI:
in vitro: CFU
SIDE POPULATION:
In vitro: trasportatori della famiglia ABCaltamente espressi nella membrana
dei progenitori immaturi estrudono il
colorante Heochst
• La capacità proliferativa e differenziativa delle
CD34+Lin- da PB è inferiore rispetto a BM
• Il # di cellule necessario per la ricostituzione
emopoietica in trapianti xenogenici da PB è
superiore rispetto a BM
• La long-term repopulation ability in trapianti
secondari e terziari delle cellule da PB è inferiore
rispetto a BM
• Non vi è evidenza di senescenza patologica delle
cellule staminali (lunghezza telomerica) in riceventi
di BM vs PB
• L’aggiunta di SCF a G-CSF incrementa il numero di
cellule LTR in topi
CELLULE CD34+
MODELLI DI STRUTTURA DEL
SISTEMA EMOPOIETICO
STOCASTICO I processi di proliferazione e turnover e
differenziamento delle HSC sono guidati da
fenomeni probabilistici
DETERMINISTICO
Potenziale predeterminato: fenomeno
programmato a priori a livello genetico
Controllo Extracellulare: effetto induttivo del
microambiente midollare e dal particolare milieu
citochinico in cui le cellule si vengono a trovare
OSTEOBLASTI
NICCHIA OSTEOBLASTICA
LT-HSCs
I processi di automantenimento e differenziazione
delle HSC richiedono uno specifico microambiente,
formato da elementi cellulari e molecole, noto come la
“nicchia” emopoietica
Ligands in stem cell
niche
Receptors in
HSCs Function
N-Cad N-Cad Cell adhesion
VCAM Integrin Cell adhesion
Ang-1 Tie-2 Stem cell maintenance
Jagged1 NotchPositive regulator of self-
renewal
Wnt3a FrizzledPositive regulator of self-
renewal
Ca2+ CAR Stem cell homing
Some of the important molecules within the HSC
niche and their corresponding receptors on HSCs
Avecilla ST, 2004
NICCHIA VASCOLARE
Stem cell niche Circulation
STEM CELL CIRCULATION
Extrinsic Intrinsic
REGOLAZIONE INTRINSECA
• egr-1 transcription factor gene (Early
Growth Response Factor-1) gene is highly
expressed by HSC and strongly repressed
during HSC mobilization. It functions by
restricting HSC entry into the cell cycle and
limiting HSC migration through a CXCR4-
SDF-1 independent mechanism. It seems to
act predominantly through a transcriptional
repression mechanism
REGOLAZIONE ESTRINSECA
Osteoblastic niche
Cycloph
G-CSF
Proliferation
Chemokine
circulation
SDF1
REGOLAZIONE DELL’EMOPOIESI
• Controllo esogena
• Controllo endogena
Fattori di crescita(CSF)
Interleuchine
citochine
Fattori Trascrizionali
Meccanismi epigenetici
IL-6
IL-11
SCF
LIF
FL...
GM-CSF
G-CSF
TPO
EPO
IL-2
IL-7, -4
IL-7
IL-3
SCF
CITOCHINESORGENTE
CELLULAREBERSAGLIO CELLULARE FUNZIONE
IL-4Linfociti T,
Mastociti
Linfociti T e B, Progenitori
emopoietici precoci
Stimola la proliferazione dei linfociti B, lo sviluppo di
cellule TH2, lo switch isotipico verso la classe IgE e
promuove la crescita dei mastociti
IL-5Linfociti T,
MastocitiEosinofili Stimola la proliferazione e l’attivazione degli eosinofili
IGF-1 Fegato Progenitori eritroidiInduce la formazione di CFU-E; possiede un effetto
anti-apoptotico.
GM-CSF
Cellule stromali
Linfociti T,
Mastociti
Progenitori emopoietici,
Precursori della linea
granulocitaria e monocitaria
Stimola l’emopoiesi precoce, la proliferazione e
l’attività di monociti, granulociti e mastociti
G-CSF
Cellule stromali,
Macrofagi,
Monociti
Progenitori granulocitari,
Granulociti maturi
Stimola l’emopoiesi precoce, la proliferazione e
l’attività dei granulociti.
M-CSF
Cellule stromali,
Macrofagi,
Monociti
Progenitori monocitari, Monociti Stimola la proliferazione e l’attività dei monociti
Eritropoietina Reni, Fegato Progenitori e Precursori eritroidi Fattore di regolazione della eritropoiesi
Trombopoietina Fegato, ReniCellula staminale, Megacariociti,
Progenitori eritroidi
Fattore di regolazione della megacariocitopoiesi;
attivo sulle cellule staminali; interviene in alcune fasi
della eritropoiesi; stimola l’adesione dei progenitori
emopoietici alla fibronectina
CONTROLLO ESOGENOCITOCHINE
SORGENTE
CELLULAREBERSAGLIO CELLULARE FUNZIONE
IL-3 Linfociti T Progenitori emopoietici precoci
Fattore di crescita multipotente che stimola la
crescita dei progenitori emopoietici precoci e
induce l’espressione di M-CSF dai macrofagi
IL-6
Fibroblasti,
Linfociti T,
Macrofagi,
Epatociti,
Cellule
somatiche
Linfociti T, Megacariociti
Stimola la sintesi delle proteine di fase acuta negli
epatociti; induce il differenziamento del linfocita B
verso la plasmacellula; stimola la
megacariocitopoiesi; ha un’azione sinergica con
IL-3, IL-4, IL-1 e IL-2
IL-7Cellule
stromaliProgenitori linfoidi precoci Stimola la proliferazione dei precursori linfoidi
IL-11
Fibroblasti,
cellule
stromali
Megacariociti, Progenitori
eritroidi, Linfociti B
Interviene durante la megacariocitopoiesi e nelle
fasi terminali dell’eritropoiesi .
SCF
(kit
ligand)
Cellule
stromali,
Fibroblasti,
Epatociti
Mastociti, Progenitori
pluripotenti, Progenitori
mieloidi, eritroidi e linfoidi
Fattore di crescita delle cellule staminali
pluripotenti; interviene sinergicamente con IL-3,
GM-CSF e Epo nelle fasi terminali dell’emopoiesi;
stimola la proliferazione, il diffenziamento e la
chemiotassi dei mastociti
Flt-3LFibroblasti
stromali
Cellule staminali e progenitori
emopoietici
Fattore di crescita delle cellule staminali e dei
progenitori emopoietici
LIFCellule
stromali
Progenitori emopoietici
multipotenti
Riduce la capacità proliferativa; induce il
differenziamento dei progenitori emopoietici;
stimola la piastrinopoiesi
• Il differenziamento di linea si spiega in
maniera convincente con il profilo di
espressione di fattori di trascrizione critici
per le diverse linee
• I FT critici agiscono in maniera coordinata,
contesto-dipendente, e interattiva
• Molti di questi FT sono stati scoperti per il
loro coinvolgimento in traslocazioni
cromosomiche in pazienti con leucemia
CONTROLLO ENDOGENO
Geni del “differenziamento”
La specificità di azione dello stesso FT in linee diverse
può essere spiegato con 2 meccanismi diversi:
1. La presenza di co-fattori linea-specifici
es. FOG-1 e GATA1. FOG-1 presenta regioni diverse in grado di
influenzare il differenziamento verso le diverse filiere
emopoietiche .
2. La presenza di differenti livelli di espressione del FT.
Es. GATA1 in cui il differenziamento megacariocitario richiede
livelli di espressione più elevati rispetto a quello eritrocitario .
Es. PI.1 in cui elevati livelli indirizzano verso la differenziazione
macrofacica, livelli intermedi verso quella granulocitaria e livelli
minimi verso il differenziamento B-linfocitario.
Antagonismo funzionale dei FT
CMP
MEP GMP
RBC MK GN Mo/MAc
PU.1
GATA-1
EKLF
Fli
Gfi-1
PU.1
Cell lineage reprogramming:
single-factor activity
GATA-1
Induction of megakaryocytic differentiation in primary human erythroblasts
Goldfarb AN, Am J Pathol 2001; 158:1191
Green: HbA
Red: GPIIb Purified GPA+ erythroblasts
+ HEL conditioned medium
+ Thrombopoietin
Day 2
Day 5
Day 0
PRIMITIVEEMBRYONIC
Yolk sacE7.5 to E11
DEFINITIVE
LiverE9.5
to newborn
ADULT
DISTINCT STAGES OF ERYTHROPOIESIS
DURING DEVELOPMENT
Shimizu R, 2001; Zang H, 2001
E 9.5
Bone MarrowE15
throughout life
E 12.5
PRIMITIVE EMBRYONIC DEFINITIVE
DEVELOPMENTAL BLOCK OF
ERYTHROPOIESIS
8.5 9 10-11 11.5 12.5
SCL LMO2
GATA-2
GATA-1
FOG1
16
EKLF
13.5
WT WTKO KO
c-Myb“bloodlessmice”
PRIMITIVE EMBRYONIC
DEFINITIVE
8.5 9 10-11 11.5 12.5 1613.5
Bcl-X
WT WTKO KO
EpoR
Stat5a
Jak2
Lyn
GRdim/dim
DEVELOPMENTAL BLOCK OF
ERYTHROPOIESIS
FL
SCF
IL-3
GM-CSF
Epo
Tpo
MplKitFlt3
Epo
GM-CSFRIL-3Rα
gp130
MplKit
Epo
GM-CSFRIL-3Rα
gp130
Mpl
Epogp130
Mpl
Epo
Stem cell BFU-E CFU-E Erythr
ERITROPOIESI
L’ eritrone
Costituisce l’ unità anatomo-funzionale dell’ eritropoiesi e comprende l’ intera popolazione cellulare che va dalle cellule staminali orientate in senso eritroide fino agli eritrociti circolanti . Si disstinguono :
• Progenitori eritroidi ( BFU-E, CFU-E ), non individuabili morfologicamente
• Precursori eritroidi, morfologicamente riconoscibili ( proeritroblasto, eritroblasto basofilo, eritroblasto policromatofilo, eritroblasto ortocromatico )
• Reticolociti
• Eritrociti
La più precoce cellula eritroide è chiamata BFU-E (burst forming unit
erythroid). Essa è in grado di dare origine, in terreno di coltura
semisolido (es. metilcellulosa), ad aggregati cellulari che dopo 14-16 giorni
di incubazione danno origine a macrocolonie (burst), di 30.000-40.000
cellule: eritroblasti (ortocromatici e policromatofili) ed eritrociti maturi ricchi
di emoglobina.
Un progenitore più maturo è il CFU-E (colony forming unit erythroid), che
genera in coltura dopo 7 giorni aggregati più piccoli di cellule
emoglobinizzate (8-65 cellule).
I “precursori” sono più maturi dei progenitori e sono identificabili senza essere
messi in coltura. Nella serie eritroide essi comprendono proeritroblasti,
eritroblasti basofili, policromatofili ed ortocromatici. Questi perdono il nucleo e
non contengono più DNA.
La “progenie” è invece rappresentata dai reticolociti che poi diventano
eritrociti.
ERITROPIESI
Tempo di produzione – 5 giorni
• Nucleo sempre più piccolo
• Cromatina sempre più aggregata
Il citoplasma cambia dal blu all’arancione
• diminuzione di RNA
• aumento in emoglobina
PROERITROBLASTOERITROBLASTO BASOFILO I ERITROBLASTO
BASOFILO II
ERITROBLASTO POLICROMATOFILO
I
ERITROBLASTO POLICROMATOFILO II
ERITROBLASTO ORTOCROMATICO
RETICOLOCITA
GLOBULI ROSSI
Fe
-O2
Fe
ERITROPOIETINAEPO
mRNA
Goldberg MA et al, 1988
SINTESI DELLA EPO•Cellule del sistema monocito-macrofagico intorno ai tubuli prossimali nella corticale del rene•Cellule renali peritubulari•Cellule epatiche
(epatociti e cellule di Ito)
•Progenitori eritroidi
ERITROPOIETINA
PERCHE’ NEL RENE? IL FLUSSO EMATICO RENALE E’ PARI AL 20%
DEL TOTALE E IL CONSUMO DI O2 NELLA CORTICALE DEL RENE E’
PRESSOCHE’ COSTANTE (PROPORZIONALE AL RIASSORBIMENTO DEL
Na). QUINDI NON VI SONO ELEMENTI LOCALI CHE MODIFICHINO LA
pO2. LA pO2 DIPENDE DALLA QUANTITA’ DI O2 TRASPORTATA DAGLI
ERITROCITI. LE CELLULE PERITUBULARI “SENTONO” LA pO2
ATTRAVERSO UN SISTEMA DI PROTEINE EMICHE LA CUI
CONFIGURAZIONE OSSI/DESOSSI REGOLA LA SINTESI DI UN FATTORE
DI TRASCRIZIONE (HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR, HIF) CHE REGOLA LA
SINTESI DI EPO.
La visione “classica” del sistema eritropoietico
La visione “classica” del sistema eritropoietico
stimolo
sensoreprodotto
bersaglio
EpoEpo-R
effetto
JAK2 JAK2P
EPO
P
P P
P
P
P
JAK2 JAK2P
EPO
P
P P
STAT5STAT5
P
P P
P P
STA
T5
STA
T5
P
Transcription
PI-3 K RAS
LYN
MAP/ERK Kinase
JAK2 JAK2P
EPO
P
P P
P
P P
Transcription
STA
T5
STA
T5
P
X
EPO
STA
T5
STA
T5
P
SHP
1
SHP
1
P P
JAK2 JAK2P P
P
P P
JAK2 JAK2P P
P
P
R129C
SOCS
PIAS
Bcl-XLprom
immediate
delayed
Motoyama 1995; Merika 1985; Gregory 1999; Wagner 2000; Haughn 2003; Vannucchi 2002
APOPTOSISX
GATA-2prom PROLIFERATIONX
β-globinprom -globin
RIBOSOME
miRISC
Pre-microRNA
microRNA
Methylation
C
G
C
G
G
CC
G
C
G
Me Me
MeMe
C
G
Me
C
G
Me
C
G
MeMe
Transcriptionallyactive
H3H4
H2AH2B
Ac
K4
Ac
K4
K27K9
K27K9
K27K9
H3H4
H2AH2B
Transcriptionallyinactive
gene
Vannucchi AM et al, JCMM 2009
MECCANISMI di CONTROLLO EPIGENETICO
1
2
3
4
5
6
• Cell Development
• Metabolism
• Cell Proliferation
• Stress Response
• Angiogenesis
• Apopotosis
• Cell Dead
• Differentiation
miRNAs Functions:
CLP
CMP
MEP
Pro-T
Pro-B
HSC
T
B
miR-10a, miR-10b, miR-20,
miR-17, miR-126, miR-130a
miR-181a
miR-223 miR-142
miR-221 miR-222 miR-16
Chen ey al science 2004 , Fazi et a Cell 2005l Felli et al 2005, Garzon et al 2006, Bruchova et al 2007
microRNAs nell’EMOPOIESImiR-150 miR-146
miR-155
C/EBPb, BREBBP, JUN, MEIS1, PU.1
AGTR1, AGTR2, FOS
NFI-A
c-KIT, CREBBP, FOS,
ETS1, PPARg
PluripotentStem cells
MultipotentStem cell
CommittedPrecursors
Maturecells
miR-142, miR-16, miR-15