ENZIMI

Tutti gli enzimi sono PROTEINE che funzionano da catalizzatori biologici nelle

reazioni cellulari e lavorano in condizioni blande di temperatura e pH (sono in

grado di aumentare la velocità delle reazioni biologiche anche di 1020 volte).

Durante la reazione l’enzima può essere temporaneamente modificato ma

alla fine del processo ritorna nel suo stato originario, un enzima viene riciclato

in modo da poter prendere parte alla stessa reazione numerose volte.

Gli enzimi catalizzano le reazioni con una Specificità molto elevata: quando un enzima funziona correttamente non si

formano mai prodotti secondari di reazione (che potrebbero essere potenzialmente tossici per la cellula)

Affinché un enzima funzioni correttamente è essenziale:1) Che conservi la sua conformazione nativa: struttura proteica tridimensionale biologicamente attiva 2) La presenza di gruppi funzionali specifici che partecipano alla catalisi (quelli delle catene laterali dei suoi residui amminoacidici e/o quelli di cofattori)

3) Condizioni appropriate di temperatura e pH, che influenzano la stabilità della struttura proteica degli enzimi e quindi la loro attività catalitica. Ogni enzima possiede un intervallo ideale di valori di temperatura e pH all’interno del quale è attivo.

Ioni inorganici (Mg2+, Zn2+), o molecole organiche o metallorganiche (coenzimi)

Classificazione: In base al tipo di reazione che catalizzano

OSSIDORIDUTTASI (deidrogenasi, ossigenasi, perossidasi, ossidasi, riduttasi)Reazioni di ossido-riduzione (trasferimento di elettroni, ioni H:¯ o H•)

TRANSFERASI (chinasi, transamminasi o amminotransferasi…)Reazioni di trasferimento di un gruppo, richiedono spesso la presenza di un coenzima (es.: le Chinasi >> trasferiscono un gruppo fosfato dall’ATP su un substrato; le Transamminasi>> trasferiscono un gruppo amminico)

IDROLASIReazioni di idrolisi dei legami C=O, C-N, C-C, P-O-P….(l’H2O agisce da accettore del gruppo eliminato)

LIASI (sintasi, decarbossilasi…)Reazioni di lisi di un substrato che danno luogo alla formazione di un doppio legame. Reazione di eliminazione non idrolitica e non ossidativa.

ISOMERASIReazioni di cambiamenti strutturali all’interno di una stessa molecola (isomerizzazioni)

LIGASI (sintetasi)Reazioni di condensazione di 2 substrati che richiedono l’energia chimica di un nucleotide trifosfato (ATP).

L’enzima partecipa alla reazione che catalizza senza modificare lo stato di equilibrio della reazione. L’enzima accelera i tempi con cui reagenti e prodotti raggiungono l’equilibrio.

L’enzima non modifica la variazione di energia libera tra reagenti e prodotti che si verifica durante la reazione

GA = Energia libera reagentiGB = Energia libera prodotti

ΔG0 = variazione di energia libera della reazione (rende conto della spontaneità della reazione)ΔG0 < 0 = reazione esoergonica(spontanea)ΔG0 > 0 = reazione endoergonica (non spontanea)

Per es.: A B

A BΔG1

0‡ = Eatt della reazione direttaΔG-1

0‡ = Eatt della reazione inversa

Affinché avvenga la trasformazione dei reagenti in prodotti è necessario superare un dislivello energetico: ENERGIA DI ATTIVAZIONE (ΔG0‡)(correlata alla velocità della reazione)

A B

ENERGIA DI ATTIVAZIONE (ΔG0‡)

Quantità minima di energia che lemolecole di reagente devono avereper superare gli ostacoli che sioppongono alla trasformazione inprodotti:1) URTI MOLECOLARI2) ORIENTAMENTO3) FORZE REPULSIVE fra le molecole

È fornita dall’En. Cinetica delle molecole di reagente in movimento, che è convertita in energia libera G: le molecole di reagente che hanno un’En. Cin. ≥ all’Eatt passano dallo stato iniziale allo STATO DI TRANSIZIONE

È l’energia necessaria a raggiungere e superare lo stato di transizione della reazione. STATO DI TRANSIZIONE: è il momento più difficile della reazione, le molecole di reagente che urtano sono disposte correttamente per trasformarsi, subiscono distorsioni e sono tese perché contemporaneamente si devono rompere alcuni legami e formarsene degli altri. Solo le molecole con energia sufficiente possono superarlo e andare avanti nella reazione.

LA VELOCITÀ DELLA REAZIONE DIPENDE DALL’ENERGIA DI ATTIVAZIONELa velocità di reazione è elevata se Eatt è bassa: vuol dire che un maggior numero di

molecole hanno l’en. Cinetica media ≥ all’Eatt .La velocità di reazione è bassa se Eatt è alta: vuol dire che poche molecole hanno l’en. Cinetica

media ≥ all’Eatt .

L’ENZIMA AGISCE ABBASSANDO L’ENERGIA DI ATTIVAZIONE Modifica il meccanismo della reazione e crea un ambiente in cui i reagenti non

incontrano ostacoli alla reazione

S + E ES E + P

E + S

ΔG0‡ ES

ES‡

ES

EP‡

ΔG0‡ EP

E + P

S‡ (in assenza di

enzima)

Stato intermedio della reazione che si trova ad un minimo energetico

Substrato(reagente)

Prodotto

Complesso Enzima/substrato

L’enzima lega il reagente (o i reagenti) >> SUBSTRATO/I. Abbassa l’Eatt nella formazione di un complesso enzima/substrato (ES)

Promuove direttamente l’evento catalitico rilasciando il prodotto e ritornando inalterato nel suo stato originario

S + E ES E + PS + E ES E + P

L’interazione reversibile fra enzima e substrato (o più substrati) è il passofondamentale anche nelle reazioni enzimatiche più complesse.La formazione del complesso ES comporta il legame fra il SITO ATTIVO dell’enzimae il substrato/i.

Tasca della proteina in cui sporgono le catene laterali di alcuni residuiamminoacidici che costituiscono il sito di legame per il substrato (responsabiledella specificità) e di altri residui amminoacidici, o cofattori che costituiscono il sitocatalitico (responsabile dell’evento catalitico)

La formazione di legami fra il sito attivo dell’enzima e il substrato è un processo esoergonico: libera l’energia necessaria ad abbassare la barriera di Enatt.

EP

E + S

ΔG0‡ ES

ES‡

ES

EP‡

ΔG0‡ EP

E + P

Quando si forma il complesso ES il substrato è bloccato nella corretta posizione (La specificità di legame

fa si che il complesso ES si formi molto facilmente).

S = substrato da scindere

stato di transizione

Il substrato nel complesso ES subisce distorsioni in modo che gli atomi che devono reagire sono

avvicinati. Le interazioni fra sito attivo di un enzima e substrato diventano ottimali solo quando è raggiunto

lo stato di transizione del passaggio ES → E + P

6 | 10Nelson • Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2014

Se il sito attivo fosse perfettamente complementare al substrato la reazione non procederebbe

La specificità del legame enzima/substrato può essere spiegata col modello chiave-serratura di Fisher

Il sito attivo possiede dei punti di ancoraggio specifici per i gruppi funzionali del substrato

Il potere catalitico di un enzima può essere spiegato col modello dell’adattamento indotto di KoshlandL’enzima ha un sito che può alloggiare in modo specifico un substrato

ma questo sito diventa complementare al substrato

solo nello stato di transizione e solo attraverso

un cambiamento conformazionale

dell’enzima stesso

Nel distorcere il substrato l’enzima stesso cambia conformazioneadattando perfettamente la forma del sito catalitico allo stato ditransizione del substrato e presentando ad esso i suoi gruppicatalitici.

esochinasi (è una trasferasi: trasferisce sul C-6 del glucosio un gruppo fosfato donato dall’ATP e produce glucosio-6-fosfato)

velo

cità

di r

eazi

on

eEffetto della temperatura sulla velocità

di una reazione enzimatica

Optimum di temperatura: è diverso per i diversi enzimi

La velocità di reazione aumenta all’aumentare della temperatura sino a raggiungere un valore massimo (Mantenendo costanti pH, [E] e [S])

A T° superiori a quella ottimale viene alterato lo stato energetico del sistema e l’enzima va incontro a modificazioni strutturali del sito attivo (rottura dei legami deboli, denaturazione)

Effetto del pH sulla velocità di una reazione enzimatica

Da ricollegare al diverso stato di protonazione delle catene laterali di residui amminoacidici che costituiscono il sito catalitico e il sito di legame per il substrato.

velo

cità

di r

eazi

on

e

pH2 3 4 5 6 7 8 9

PAPAINA = enzima proteolitico, scinde i legami peptidici delle proteine. In quest’enzima la cisteina è più acidae l’istidina più basica di quanto non lo siano in altre condizioniFORMANO UNA COPPIA IONICA NEL SITO ATTIVO

O=C

l

HN―C ―

HlCH

2lS¯

O=Cl

HN―C ―H

lCH2

l H

C―N+CH

C―N

H H

O=Cl

HN―C ―H

lCH2

l H

C―N+CH

C―N

H H

Massima attività

His-159Cys-25

His-159

Cys-25

His-159

Cys-25

Massima attività: intervallo di pHcompreso fra i pKa di due residui amminoacidici del sito attivo (fra pH 4.2 e 8.2). In questo intervallo le catene laterali di entrambi i residui aminoacidici sono ionizzati.

Cys-25 (pKR 4.2)

His-159 (pKR 8.2)

1) Perché studiare la cinetica di una reazione enzimatica?Per determinare dei parametri specifici e caratterizzanti per un dato enzima che ci dicono:

- Quanto un enzima è affine ad un dato substrato- Quanto l’enzima è efficiente

- Come posso controllare la velocità della reazione- Come posso regolare l’attività catalitica dell’enzima (inibendolo o attivandolo)

2) Cosa devo misurare per studiare la cinetica enzimatica?LA VELOCITA’ DI REAZIONE AL TEMPO ZERO

IN FUNZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI SUBSTRATO(misurata come variazione della concentrazione di prodotto ottenuto nel tempo, o di

substrato consumato nel tempo)

3) Come interpreto i dati ottenuti?Applico delle equazioni matematiche.

Il modello matematico BASE per elaborare i dati di una cinetica enzimatica (per enzimi non allosterici)

è quello proposto da L. Michaelis e M. Menten (1913)/Haldane e Briggs (1925)

CINETICA ENZIMATICAGli esperimenti di cinetica enzimatica si basano sulla determinazione della velocità di reazione

ad una determinata [S], misurata come variazioni della concentrazione del prodotto o del reagente in un dato intervallo di tempo.

S → P[P] = aumenta nel tempo[S]= diminuisce nel tempo

tempo

[P][S]

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

Col procedere della reazione le curve cinetiche si appiattiscono: la velocità non subisce variazioni. S è consumato perché trasformato in P e la reazione

tenderà a raggiungere l’equilibrio.

Se voglio avere una stima esatta di quale sia la velocità di reazione quando utilizzo una data concentrazione di substrato, devo misurare la velocità della reazione al momento iniziale (entro i primi 50-60 sec), quando la quantità di prodotto formato è molto bassa e la concentrazione del substrato ha un valore preciso (quello iniziale stabilito dallo sperimentatore).

S → P

v = k [S]

Per es.: faccio 4 esperimenti con 4 diverse concentrazioni di substrato. La velocità di reazione varia al variare della concentrazione del substrato

e dipende da una costante di velocità k che è specifica per ogni reazione.

k = -1/Δt (costante di velocità)

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

COME DETERMINO LA VELOCITA’ INIZIALE?

Studio di una reazione enzimatica semplice (1 solo substrato e 1 solo stadio intermedio):

1) miscelo l’enzima con il suo substrato, lavoro a temperatura e pH costanti, 2) mantengo inalterata la [E] e modifico la [S]: per ogni esperimento misuro come

varia la velocità di reazione nel tempo. v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

3) Determino il valore della velocità di reazione nello stadio iniziale (v0) alle diverse [S].

v0 (3)

(4)

v0 (2)

v0 (1)

È direttamente proporzionale alla concentrazione iniziale di reagente [S] usata per la reazione.

Per gli enzimi che seguono la cinetica di Micaelis-Menten la dipendenza della v0 dalla [S] è descritta da una curva iperbolica

VELOCITA’ INIZIALE (v0) è calcolata come pendenza della tangente alla curva cinetica.Per ognuna delle curve cinetiche ottenute a diverse [S] viene calcolata la v0

v0 = k [S]

Inserendo i valori di v0 ottenuti per le diverse [S] utilizzate in un grafico ottengo una curva iperbolica

Concentrazione substrato [S] (mM) V

elo

cità

iniz

iale

v0

(μM

/min

)

Alte [S] = la v0 non varia molto al variare di [S], l’enzima è quasi completamente saturato, viene raggiunta asintoticamente una velocità di reazione massima

Basse [S] = la velocità di reazione v0

dipende strettamente dalla [S], aumenta all’aumentare della [S]

Posso spiegare questo comportamento con un’equazione che correla la v0 alla [S], alla Vmax e ad una costante di affinità (Km)

ENZIMI CHE SEGUONO LA CINETICA DI MICHAELIS-MENTEN

ENZIMI CHE SEGUONO LA CINETICA DI MICHAELIS-MENTEN

Mostrano una dipendenza della velocità iniziale (v0) dalla concentrazione di substrato di tipo IPERBOLICO.

Catalizzano una reazione enzimatica che nel caso più semplice prevede:1 prima tappa veloce (ΔG‡ minore e k maggiore)

S + E ES

1 seconda tappa lenta (ΔG‡ maggiore e k minore) che determina la velocità globale di reazione

ES E + P

k1

k-1

k2

k-2

k1 = cost cinetica reazione di formazione del complesso ESk-1 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + Sk2 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + P

Formazione rapida e reversibile del complesso ES

S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1

k-1

k2

Si assume che questo passaggio raggiunga velocemente lo STATO STAZIONARIO: in cui[ES] rimane costante, la velocità della sua formazione è uguale alla velocità della suademolizione.

La velocità di formazione di ES dipende da [E] e da [S] e dalla cost. cin. k1

La velocità di demolizione di ES dipende da [ES] e dalle cost. cin. k-1 e k2

S + E → ES

ES → S + E ES → E + P

Se questo è vero il rapporto fra le costanti cinetiche della dissociazione di ES e quella della sua formazione è uguale alla costante di dissociazione del

complesso ES, chiamata Km (Costante di Micaelis-Menten)

(k2 << k-1 = trascurabile) k-1+ k2

Km =k1

k-1+ k2Km =

k1

k-1Km =

k1

k-1Km =

k1

La Km fornisce informazioni sull’affinità che un enzima ha nei confronti del suo substrato ed è SPECIFICA per ogni diverso enzima nei confronti di un dato substrato.Più è grande, minore sarà l’affinità dell’enzima per il substrato (maggiore sarà la costante di dissociazione, k1 > k-1)

Più è piccola maggiore sarà l’affinità (minore la costante di dissociazione, k1 < k-1)

k-1Km =

k1

k-1Km =

k1

Considerazioni valide per reazioni enzimatiche semplici a due tappe e in cui k2 << k-1

non per tutti gli enzimi, molte reazioni enzimatiche sono a più tappe e la Km diventa una funzione più complessa che dipende

da varie costanti cinetiche.

Se [ES] = [E]TOT⟹ la v0 = VmaxPossiamo raggiungere questa condizione quando utilizziamo concentrazioni

saturanti di substrato. La velocità di reazione non dipende più dalla concentrazione di substrato, ma solo dalla concentrazione totale dell’enzima:

Vmax = k2 [E]TOT

Stabilite queste condizioni, il comportamento degli enzimi che seguono la cinetica di Micaelis-Menten è giustificato dalla

seguente EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

Da questa relazione se ne può dedurre un’altra che consente di determinare la velocità massima di reazione.

Infatti, esiste un momento della reazione in cui tutto l’enzima che ho messo a reagire è complessato col substrato e quindi è in forma ES: ossia quando è raggiunta la

VELOCITA’ MASSIMA di reazione (Vmax)

S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1

k-1

k2 Passaggio lento: la v0 della reazione globale dipende da questo passaggio e quindi da [ES]

v0 = k2 [ES]

Corrisponde alla [S] alla quale raggiungo la metà della Vmax.Ha le unità di misura di una concentrazione

[S] (mM)

v 0(μ

M/m

in)

Equazione di Michaelis-Menten

La velocità iniziale della reazione enzimatica dipende dalla [S] in modo iperbolico ed è correlata allaVmax (= k2[E]tot) e alla Km

Km

v0 = ½ VmaxKm + [S] = 2 [S]

Km = [S]

Vmax [S]v0 =

Km + [S]

Vmax [S]v0 =

Km + [S]

S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1

k-1

k2

Vmax [S]=

[S] + Km

Vmax [S]=

[S] + Km

1 [S]=

2 [S] + Km

1 [S]=

2 [S] + Km

Costante di Michaelis

1 enzima2 substrati simili A e Bmedesime condizioni di reazioneVerso quale dei due l’enzima è più affine?

A

B

v 0 (μM

/min

)

[S] mMKmA KmB

½ Vmax

A

Costante catalitica o n° di Turnover

k2 per una reazione semplice ad uno

stadio corrisponde alla kcat

Indica il numero di eventi catalitici che avvengono nel sito attivo dell’enzima nell’unità di tempo (le sue unità di misura sono s-1 o min-1).

Misura quanto velocemente un dato enzima può catalizzare una data reazione. E’ SPECIFICA per ogni enzima.

Vmax = k2 [ES] = k2 [E]TOT

Se lavoro con una miscela di reazione enzimatica in cui utilizzo una [S] saturante e voglio raddoppiare la velocità di reazione cosa devo modificare nel mio sistema? In che modo?

S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1

k-1

k2

Vmax

[E]TOT

k2 =Vmax

[E]TOT

k2 =

[S] saturante = la v0 raggiunge il suo valore massimo (Vmax), non può più variare infunzione della concentrazione di substrato perché tutto l’enzima presente èsaturato. Se voglio aumentare la Velocità di reazione devo aggiungere altro enzimaalla miscela di reazione.Vmax = k2 [E]tot

VmaxB = k2 [E]B[E]B = 2 [E]A

per raddoppiare la velocità di reazione (Vmax) devo raddoppiare la concentrazione dell’enzima

v 0(μ

M/s

ec)

[S] mM

Vmax A = k2 [E]A

Km

LA Km RIMANE INVARIATA

Determinazione sperimentale di Km e Vmax per una reazione enzimatica:GRAFICO DEI DOPPI RECIPROCI (Eq. di Lineweaver-Burk)

(linearizzazione della curva iperbolica) >>>> 1 Km 1 1v0 Vmax [S] Vmax

= +

Determinazione sperimentale di Km e Vmax per una reazione enzimatica:GRAFICO DEI DOPPI RECIPROCI (Eq. di Lineweaver-Burk)

(linearizzazione della curva iperbolica) >>>> 1 Km 1 1v0 Vmax [S] Vmax

= +

Trasformo i valori sperimentali di v0 nei loro reciproci: 1/v0

e i valori sperimentali di [S] nei corrispettivi reciproci 1/[S] ↓

[S] = 1,0 mM[S] = 10 mM

0,1 1,01/[S] mM-1

-1/Km

1/v

0m

in/μ

M

1/Vmax

La curva iperbolica del grafico di Micaelis-

Menten diventa una retta che interseca gli assi in

punti precisi consentendo di determinare con

esattezza Vmax e Km, e quindi anche kcat

[S]2,0 (Km) mM

50Vmax

v0 (μM/min)

½ V

max

Vmax [S]v0 =

Km + [S]

Vmax [S]v0 =

Km + [S]

1 Km 1 1

v0 Vmax [S] Vmax= + 1 Km 1 1

v0 Vmax [S] Vmax= +

[S] = 10 mM

[S] = 1,0 mM

0,1 1,01/[S] mM-1

1/v

0m

in/μ

M

-0,5 = -1/Km

1/Vmax = 0,02

Per calcolare la Vmax devo fare il reciproco del reciproco =

1 = 0,02 min/μM → Vmax = 1Vmax 0,02 min/ μM

Vmax = 50 μM/min

Per calcolare il valore della Km devo fare il reciproco negativo del reciproco = -1/Km = -0,5 mM-1 → Km = - 1 = 2mM

-0,5 mM-1