ENZIMI

catalizzatori organici per lo più di natura proteica

• a differenza dei catalizzatori inorganici sono altamente specifici nei confronti del reagente (substrato) e nel tipo di reazione catalizzata

Enzimi (nel fermento)

• sono necessari in piccole quantità in quanto il processo catalitico non comporta modificazioni permanenti della molecola enzimatica NON SONO COMPONENTI STECHIOMETRICI delle REAZIONI in cui INTERVENGONO

• accellerano la velocità di una reazione senza alterarne la costante di equilibrio

Fino a 10 14

p-nitrofenil fosfato p-nitrofenolo (PN)

02N PO4 PO4 OH +

02N

PNP

P+

substrato

prodotti

PN fosfato libero

reagente

PNP

P+

prodotti

PN fosfato libero

enzima

•accellerano la velocità di una reazione senza alterarne la costante di equilibrio

Come misurereste la velocità della reazione PNP PN ?

V= [nmol PN /min ]

[PN ] µ 0

0

Reazione non catalizzata

3

1.5

P

P

P

P

Reazione catalizzata

P

PP

P

P

0

0

[PN ] 0

V=

[n

mo

l P

N /

min

)

0

[PN ]

la velocità della reazione non

aumenta in maniera indefinita

all’aumentare del substrato

3

1.5

Reazione non enzimatica

A B

[A]

V

Reazione enzimatica

[S]

Vo

Cinetica ordine 0

Cinetica primo ordine

S E K1

K2

K3

K4

ES E + + P

Complesso

Enzima -Substrato Substrato

+ K1

K2 Enzima

Prodotto

P

+

K3

K4

Enzima

Fasi di una reazione enzimatica

Evidenze sperimentali dell’esistenza del

complesso enzima-substrato

• cristallografia a raggi X

• modifiche spettro assorbimento dell’enzima

• modifica altre proprietà chimico-fisiche dell’enzima

(i.e. solubilità)

• isolamento del complesso enzima-substrato

• ha struttura tridimensionale (garantisce specificità)

SITO ATTIVO

• rappresenta una piccolissima

parte dell’enzima (1-2%)

• è in genere una cavità da cui è esclusa l’acqua

Include sia gli amminoacidi implicati nel legame del substrato (SITO DI LEGAME) sia quelli responsabili del processo catalitico (SITO CATALITICO)

SITO ATTIVO

Legami enzima-substrato

Le interazioni tra l’enzima ed il substrato sono in genere di tipo debole:

legami idrogeno interazioni elettrostatiche forze di van der Walls

Più raramente di tipo covalente

Nome sistematico • il nome del substrato o substrati

• il tipo di reazione catallizzata (-asi) (Lattico:NAD ossidoreduttasi)

Nome raccomandato: es. Lattico deidrogenasi)

Enzyme Commission Number: es. E.C.1.1.1.27

L'enzima può essere identificato mediante:

E.C. n1.n.2.n3.n4

1. tipo di reazione

2. tipo di substrato

3. tipo di accettore, o gruppo rimosso

4. numero di serie identificante l'enzima

IN CHE MODO GLI

ENZIMI ACCELLERANO

UNA REAZIONE?

+ +

Perchè una reazione avvenga….

……è necessario ……………

1. che i reagenti collidano

2. che collidano nel giusto orientamento

Perchè una reazione avvenga è necessario :

3. che i reagenti posseggano sufficiente energia per superare il livello energetico dello stato di transizione

tensione dei vecchi legami e incompleta formazione dei nuovi legami

Perchè una reazione avvenga è necessario :

Gli enzimi accelerano le reazioni

TERMODINAMICAMENTE possibili ( G<0) in quanto

consentono la formazione di stati di transizione

a più basso contenuto energetico :

“abbassano l’energia di attivazione”

in quanto consentono la formazione di stati di

transizione a più basso contenuto energetico….

• via polarizzazione dei legami da

rompere

• via stabilizzazione dello stato di

transizione (legami deboli)

• riducendo la solvatazione dei

reagenti

“Il potere catalitico degli enzimi deriva dall’energia

rilasciata durante la formazione di legami e

interazioni deboli tra l’enzima e il substrato

ENERGIA DI LEGAME

(interazioni ottimali allo stato di transizione)”

L’ENERGIA DI LEGAME

<<forza trainante la catalisi>>

L’ Energia di legame contribuisce sia alla catalisi che

alla specificità

“Il potere catalitico degli enzimi deriva dall’energia

rilasciata durante la formazione di legami e

interazioni deboli tra l’enzima e il substrato

ENERGIA DI LEGAME

L’ENERGIA DI LEGAME

<<forza trainante la catalisi>>

L’ Energia di legame contribuisce sia alla catalisi che

alla specificità

(interazioni ottimali allo stato di transizione)”

Modelli interazione Enzima-substrato

Chiave-serratura

Sito attivo complementare al substrato

Adattamento indotto

Più comunemente usata : International Unit ( IU)

1.0 IU = la quantità di enzima in grado di convertire

1.0 mmole di substrato in prodotto in 1 minuto in

condizioni standard (specificate)

ed a [substrato] >> [enzima]

In teoria ciascun laboratorio può

stabilire la propria “unità”

UNITA’ ENZIMATICA

1.0 katal = that amount of enzyme that will convert

1.0 mole of substrate to product in 1 second

given the initial [substrate] >> [enzyme]

and all relevant conditions stipulated

1.0 DEA Unit = that amount of phosphatase that will

hydrolyze 1.0 mmole of PNP per min

@ 370C in diethanolamine buffer at

pH 9.6. Initial [PNP] 6.0 mM

In teoria ciascun laboratorio può stabilire la propria “unità”

Standard” UNIT = that amount of phosphatase that will

produce 1.0 mmole of PN per min @

room temperature in TRIS-HCl buffer

at pH 7.5. Initial [PNP] 50 mM

Catalisi

acido-base

Catalisi

acido-base

Ossicatione instabile

Generale

donatore/accettore di protoni

diverso dall’acqua

Specifica

l’acqua è donatore/

accettore di protoni

Come è possibile che uno stesso aa

possa agire da acido o base?

Aspartil-proteasi:

pepsina, catepsina D

Anche la dissociazione

dell’acqua è guidata dall’Asp

Catalisi covalente: Serin-proteasi

His

R1-COO- +

+

R2-NH2

Serin-proteasi : Chimotripsina

Catalisi covalente: Cistein-proteasi:

catepsina B, caspasi, calpaina

Catalisi covalente: Cistein-proteasi:

catepsina B, caspasi, calpaina

H2O

ossianione

ossianione

Catalisi da metallo: Metalloproteinasi

(carbossipeptidasi A)

Gly-Phe

da rompere

Aa leganti lo Zn++

Aa implicati nella catalisi

Cofattori molecole non proteiche che partecipano al processo catalitico e che come l’enzima non risultano modificati alla fine del processo

a) ioni metallici

• gruppi prostetici (Apo ed Olo enzima)

• coenzimi (in alcuni casi risultano modificati alla fine del processo

catalitico, ma esistono processi metabolici che ne consentono

il riciclaggio)

b) molecole organiche

a) ioni metallici

Zn Fattori trascrizionali (proliferazione cellulare)

Risposta immunitaria

Coinvolto come cofattore in 200 processi enzimatici

Fe Sintesi collagene (idrossilazione lisina e prolina)

Amplifica l’attivita’ leucocitaria

Cu Favorisce legami crociati nella genesi del collagene

Forma metallo enzimi (ossidasi) essenziali

per il metabolismo energetico tessutale connettivale

Se, Mn, Mg

Cofattori molecole non proteiche che partecipano al processo catalitico e che come l’enzima non risultano modificati alla fine del processo

a) ioni metallici

• gruppi prostetici (Apo ed Olo enzima)

• coenzimi (in alcuni casi risultano modificati alla fine del processo

catalitico, ma esistono processi metabolici che ne consentono

il riciclaggio)

b) molecole organiche

I coenzimi sono derivati di vitamine: ……

- sono ESSENZIALI per la sopravvivenza

- sono di NATURA ORGANICA

- sono necessarie in PICCOLE QUANTITA’

- devono essere introdotte con la DIETA

VITAMINA : “ammina della vita” (Fuck, 1912)

FUNZIONE: preminentemente coenzimi

FUNZIONE: varie (para-ormoni, biosegnalatori, antiossidanti, etc.)

TIAMINA ( Vitamina B1)

Vitamine del gruppo B

RIBOFLAVINA (Vitamina B2)

ACIDO PANTOTENICO ( Vitamina B5)

PIRIDOSSINA (Vitamina B6)

ACIDO FOLICO (Vitamina B9)

COBALAMINA (Vitamina B12)

BIOTINA (Vitamina H, B8)

NIACINA ( Vitamina B3, Vitamina PP)

Vitamina C

RDA (recommended daily intake) U.S. Food and Nutrition Board of the National Research Council

Tiamina (B1) 0.5- 1.5 mg

Riboflavina (B2) 1.4- 1.8 mg

Niacina (B3,PP) 9- 10 mg

Acido pantotenico (B5) -- --

Piridossina (B6) 2- 2.6 mg

Biotina (B8, H) 30- 60 mg

Acido folico (B9 M o Bc) 0.1- 0.2 mg

Cobalamina (B12) 4-6 mg

Acido ascorbico (C) 30- 100 mg

Vit. A 600 RE (1 RE=1 mg RetOH)

Vit. D < 10 mg

Vit. E 15 mg

Vit. K 10 mg

(fillochinone)

LE VITAMINE IDROSOLUBILI SONO quasi sempre

PRECURSORI DEI COENZIMI

Tiamina (B1) Tiaminapirofosfato

Riboflavina (B2) Flavinadenindinucleotide (FAD),

flavin mononucleotide (FMN)

Niacina (B3,PP) Nicotinammide dinucleotidi (NAD)

Acido pantotenico (B5) Fosfopanteteina (CoA, ACP)

Piridossina (B6) PiridossalP

Biotina (B8, H) legata all’enzima

Acido folico (B9 M o Bc) Tetraidrofolico

Cobalamina (B12) legata all’enzima

Acido ascorbico (C) ---------

STRATEGIA n. 7

Intrappolamento nutrienti all’interno della cellula

A

A A-x

VITAMINE LIPOSOLUBILI

Vitamina A Retinolo

Vitamina K fillochinone, menadione, etc.

Vitamina D2 ergocalciferolo Vitamina D3 colecalciferolo

Vitamina E , , , - tocoferolo

Ribozimi