ENZIMI DI RESTRIZIONE

Reazioneligasica di frammenti direstrizione

DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONOUNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNALIGASI

CLONAGGIO-IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI

-IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICAOTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

Vettori e clonaggio

Vettori

PlasmidiFagiCosmidiYAC

Vettori e clonaggio

Plasmide

Molecola circolare di DNA a doppiofilamento, normalmente presentenella cellula batterica, in gradodi replicarsi autonomamente

dal cromosoma.

VETTORI DI CLONAGGIO

Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear)

Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble)

+

galactose

-galactosidase

Bacteria from ligation platedon ampicillin and X-Gal

Containswild typeplasmd

Containsrecombinantplasmd

Vettori e clonaggio

Lunghezza massima delDNA clonabile in un plasmide:

circa 20 Kb

Vettori e clonaggio

I virus sono piccoli parassitinon in grado di replicarsi.Dopo aver infettato una

cellula-ospite utilizzano i suoisistemi di replicazione e sintesi

delle proteine per riprodursi

Vettori e clonaggio

I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.

Vettori e clonaggio

Il fago più utilizzato in biologiamolecolare è il fago

Vettori e clonaggio

Assemblaggiodi un fago

Vettori e clonaggio

Mappa del genoma del fago

Vettori e clonaggio

Clonaggio diframmenti diDNA nelfago

Vettori e clonaggio

Formazione di cloni fagici

Vettori e clonaggio

L’infezione dei batteri con il fago è circa 103 volte più efficiente

della trasformazione con un plasmide

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in un fago:

20-25 Kb

Vettori e clonaggio

Un cosmide è un plasmidecontenente la sequenza COS

dal fago

Vettori e clonaggio

Vettori e clonaggio

Clonaggio diframmenti diDNA in uncosmide

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in un cosmide:

circa 45 Kb

EcoR I

Genomic LibraryInfect cells

AAAAAA AAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAAAAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

cDNA synthesis

Infect cellscDNA library

• Preparing the insert– Partial digestion preferred

Genomic Library Construction

Genomic library cDNA library

Genomic DNA mRNASource

Species or strains Species or strainsTissuesDevelopmental stages

Variation

12k -- 20k 0.2k -- 6kInsert size

Equal Correlate with expression level

Representation

Only one Expression vs. nonexpression

Type

DNA DNA or antibody orprotein

Probe

Gene structureInfer protein identity

Encoded proteinInfer protein identity

Purpose

Screening with DNA probe

• Probe is identified cloned– From other organism

– Same organism• Looking for variants

• Chromosome walk

Chromosome walk

Genome Projects

• Whole genome sequencing

• Fragment and clone• Sequence ALL clones!• Computer assembles

Genome Projects

   Bee             Cat             Chicken             Cow             Dog             Fruit fly    Human    Malaria parasite    Microbial Genomes    Mosquito     Mouse    Nematode    Pig              Plant Genomes Central    Rat    Retroviruses     Sea urchin Tribolium            Sheep             Zebrafish

• Multiple organisms provide suitable systems for experimentation– Zebrafish-development– Rat-physiology– Dog- genetic disease– Fruit fly- behavior

• Some of practical significance– Mosquito/Malaria parasite

Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad

1) Uno stampo a singola elica

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

ha bisogno di:

4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegueindefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotiditrifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché

posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Terminazione della catena

DNA stampo a singola elica

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC5’ 3’

Ibridazione conIl primer

+ [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA -ddC-C ddC

-CC ddG-CCGATT ddG

-CCGA ddT-CCGAT ddT

Sequenza: 5’-CCGATTG

A C G T

-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC

GT

T

AGCC

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

Direzione dilettura

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTPun diverso marcatore fluorescente, è

possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio

e caricare il tutto in solo pozzetto di gel

ddA

ddC

ddT

ddG

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Fluorescent DNA Sequencing

A G T A C T G G G A T C

GelElectrophoresis

Detection of Fluorescently Tagged DNA

DNA FragmentsSeparated by

Electrophoresis

Output to Computer

Scanning Laser Excites

Fluorescent Dyes

Optical Detection System

Fluorescent DNA Sequencing Data

Fluorescent DNA Sequence Trace

Size of gene library

N = ln(1-P) ln (1-A/B)

N = Number of clones P = 95 % probability of finding geneA = Average size of DNA fragmentsB = Total size of genome

E. coli has genome of 4,800,000 nucleotidesAverage size of insert is 10,000 nucleotidesNumber of clones for 95 % probability is 1700

Size of gene library

• If genome is large e.g. human genome (3 x 109) then number of clones to make library becomes unrealistic (1058000) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed)

• Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA– I.e. if each vector contains a large piece of DNA

you don’t need so many clones to make a gene library

What vectors for what libraries?

VectorInsertsizeWhat librariesPlasmid<10 kbBacteriaLambda phage18-25 kbYeastCosmid34-45 kbIntermediateeukaryotesYAC etc0.1 – 1 MbHigher Eukaryotes

Human library requires 14000 YAC clones

Human library requires >1,000,000 plasmid clones

Vettori e clonaggio

YAC=yeast artificial chromosome

Vettori e clonaggio

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in uno YAC:

fino a 1000 Kb

Vettori e clonaggio

Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors

Vector Type Cloned DNA (kb)

Plasmid

λ phage

Cosmid

P1 phage

BAC (bacterial artificial chromosome)

YAC (yeast artificial chromosome)

20

25

45

100

300

1000

Whole Genome ShotgunWhole Genome Shotgun • Celera Genomics

Fragment and sequence entire genome

Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

Overview of Facts Asserted

• 2.91 billion base pairs (bp)

• 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA

• 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s)

• less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

Structure of the genome

http://genome.ucsc.edu

http://www.ncbi.nlm.nih.gov