BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE

LEZIONE 3

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

Adriana Maggi

ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI

3’ TRASCRIZIONE

MODIFICAZIONITP

TRADUZIONE

RNA, trascritto primario

Capping e poliadenilazione

Splicing o maturazione

Fuoriuscita dal nucleo

riconoscimento da parte dei ribosomi

traduzione

Modificazioni post-traduzionali

ESPRESSIONE GENICA

Trascrizione (trascrittoma)

Traduzione (proteoma)

Il trascrittoma è mantenuto dalla cellula madre alla cellula figlia ed è modificato a seconda degli stimoli

esterni

Contenuto di RNA in cellula eucariota 20-30 pg – 1% dell’intera cellula0,05-01 pg in cellule batteriche)

TOTAL RNA

CODING 4%transcriptome NON CODING 96%

PRE-mRNA

mRNA

Pre-rRNA Pre-tRNA snRNA snoRNA scRNA

rRNA tRNA

PRE-mRNA mRNA

END MODIFICATIONS

- CAP

- polyA

Splicing

Alternative splicing

RNA editing

Transport to cytoplasm, initiation of translation

Termination transcription, init transl, turnover

No role other than removal of introns

Enables one RNA to code for two proteins

Enables one RNA to code for two proteins

Converts abbreviated transcripts in functional RNAs

Places termination codons in some mitoch mRNAs

FUNCTIONS

 5'-Capping

Capping occurs shortly after transcription begins.   m7G is linked to the first nucleotide by a special 5'-5' triphosphate linkage.  In most organisms, the first nucleotide is methylated at the 2'-hydroxyl of the ribose. 

In vertebrates, the second nucleotide is also methylated.

3'-Polyadenylation

A stretch of adenylate residues are added to the 3' end.  The poly-A tail contains ~ 250 A residues in mammals,  and ~ 100 in yeasts

Polyadenylation at the 3' end.  The major signal for the 3' cleavage is the sequence AAUAAA.  Cleavage occurs at 10-35 nucleotides downstream from the specific sequence. A second signal is located about 50 nucleotides downstream from the cleavage site.   This signal is a GU-rich or U-rich region.

MATURAZIONE DEL TRASCRITTO PRIMARIOO EXCISIONE (SPLICING) DEGLI INTRONI A

FORMARE RNAm

ESISTONO QUATTRO CLASSI DI INTRONI :

• INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO I

• INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO II

• INTRONI DI RNA NUCLEARE BERSAGLIO DELL’APPARATO DI SPLICING (Spliceosomal Introns)

• INTRONI tRNA Nucleare che subiscono matutrazione per via enzymatica

Tom Cech e Sidney Altman hanno ricevuto il premio Nobel per la Chimica ne 1989 per la scoperta del meccanismo di self splicing in Tetrahymena e per la scoperta che la componente catalitica della ribonucleasi P responsabile per la maturazioen del tRNA in E.coli era una molecola di RNA.

Tom Cech

Sidney Altman

1. Nucleophilic attack by the 3' OH group of a free guanine nucleoside on the 5' phosphorus atom at the 5' end of the intron.

2. The 3'OH group at the 3' end of the upstream exon carries out a nucleophilic attack on the phosphorus atom at the 5' end of the downstream exon.

INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO I

INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO I

In questa classe di introni che comprende l’introne di rRNA di Tetrahymena lo splicing dipende dalla struttura terziaria della molecola.

Perché avvenga il “self-splicing” Even though we often think of them as singlela molecola di RNA deve avere una struttura secondaria e terziaria ben definita; alcune variazione sono consentite ma solo se i cambiamenti mantengono i siti di splicing 3’ e 5’ molto prossimi l’uno all’altro e la guanosina catalitica nelle immediate vicinanze.

Introni I tipo

Introni I tipo

1° reazione di transesterificazione promossa da C 2’ adenosina

Rottura legame fosfodiestereo

Formazione nuovo legame 5’-2’ che lega primo nt con adenosina interna

Formazione del lariate e riformazione dellegame fosfodiestereo

MECCANISMO DI EXCISIONE INTRONI DI TIPO II

Sequences, secondary structure and tertiary interactions of group II intron bI1 from yeast mitochondria

Black boxes, exon sequences; continuos line, six major intron domains (D1-D6); 5’GUGAG...AU3’, consensus nucleotides at the intron boundaries. Red line, ID3 subdomain; dashed red lines, interactions of ID3 with intron and exon sequences, (EBS1/IBS1 and a-a´). Marked in blue, individual nucleotides and structures involved in tertiary interactions (EBS2-IBS2, e-e´, d-d´, g-g´ and z-z´). Note, for bI1 the d-d’ interaction (U-U) is not established.

 I prodotti di razione sono la molecola di RNA correttamente maturata e un introne che forma una struttura detta lariate.

Come per gli introni di gruppo I anche per questa classe di introni una corretta struttura secondaria e terziaria è indispensabile per lo splicing.

Introni self-splicing di gruppo II

IN CONCLUSIONE LE DIFFERENZE TRA INTRONI DI GRUPPO I E II SONO:

• L’AGENTE RESPONSABILE DELL’ATTACCO NUCLEOFILO INIZIALE.

Spliceosomal Intron Splicing

I passaggi di base necessari per la maturazione di RNA-trascritto primario in eucariote sono gli stessi visti per il gruppo II di introni self-slicing e i prodotti di reazione anche in questo caso sono l’RNA maturato correttamente e un lariate. A differenza degli introni self-splicing la reazione in eucariote richiede la partecipazione di un sistema elaborato di altri fattori quali le small nuclear ribonucleoprotein particles or snRNPs.

Ogni snRNP è un complesso di diverse proteine e piccoli U-RNA detti small nuclear RNA or snRNA. Gli snRNA coinvolti nello splicing sono cinque

INTRONI DI RNA NUCLEARE BERSAGLIO DELL’APPARATO DI SPLICING

Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 1

Commitment complex (E complex)U1 lega il sito di taglio in 5’ e U2AF legail sito polipirimidinico

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

Complex A U2 lega il sito “branch”

Complex B si associano U5, U6, U4

Complex C U4 si dissocia, U6 e U2 catalizzano la transesterificazione

U5 l’esone al sito di taglio in 3’Avviene il taglio in 5’ e si forma il lariateAvviene il taglio in 3’ e la ligazione Tra gli esoni

Riposizionamento, U1 si dissocia,U5 si associa all’introne; U 6 lega il sito di taglio in 5’

Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 2.

5’ splice site: 5’-GU-3’

Tratto polipirimidinico

3’ splice site 5’-AG-3’

LE SEQUENZE DI SPLICING SONO CONSERVATE NEI VERTEBRATI

Esistono introni AU-AC sono simili a introni GU-AG ma richiedono Un apparato di splicing differente

RNA EDITING

Modificazioni enzimatiche tramite cui nucleotidi di RNAm

vengono modificati

RNA EDITING

•Editing by deamination

•Editing by insertion or deletion

RNA editing: specific nucleotides are modified to change one nucleotide into another. One example is the de-amination of cytidine which occurs in mammalian apolipo protein B mRNA in the intestine.Here, a specific C is changed into a U, introducing a stop codon for translation and thereby a shorter version of the protein.

RNA EDITING

                                              

         

A second example is de-amination of adenosine to inosine. Inosine is read as guanosine by the translation machinery. The adenosine is present in a double stranded region of the mRNA and the enzyme adenosine de-aminase that acts on RNA, ADAR, catalyzes the reaction. Examples of mRNAs edited by ADAR are mRNA encoding glutamate receptors, serotonin receptors and potassium channels in the central nervous system and hepatitis delta virus RNA.

GUIDE RNA

The mitochondria for some trypanosome protozoa undergo gRNA-directed mRNA editing. The gRNA identifies particular sequences and directs the insertion or deletion of uridylates (U) from the mRNA by enzymes residing in a macromolecular complex. The edited portion of the mRNA is in the coding region, which has the effect of modifying the protein that is produced.

ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI

3’ TRASCRIZIONE

MODIFICAZIONITP

TRADUZIONE

RNA, trascritto primario

Capping e poliadenilazione

Splicing o maturazione

Fuoriuscita dal nucleo

riconoscimento da parte dei ribosomi

traduzione

Modificazioni post-traduzionali

TRADUZIONE DI mRNA IN PROTEINE

CELLULE EUCARIOTEMODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DI PROTEINE

ProteolisiGlicosilazione

Acilazione metilazioneFosforilazioneSulfunilazionePrenilazione