Biotecnologie Farmacologiche eBasi molecolari dell’azione del farmaco

AA 2010/11Lezione 19Adriana Maggi

FARMACI BIOLOGICI

Per la Comunità Europea, un composto o un farmaco biologico è definito come: “una sostanza che è prodotta o estratta da una sorgente biologica che richiede per la sua caratterizzazione e controllo di qualità una combinazione di analisi fisiche-chimiche e biologiche, insieme al processo di produzione e suoi controlli” (Dir. 2003/63/EC, part I, Section 3.2.1 (b)).

FARMACI BIOTECNOLOGICI

Farmaci biologici prodotti da cellule procariote o eucariote opportunamente modificate per opera di ingegneria genetica

Considerando l’origine da organismi viventi sono da considerare come composti/farmaci biologici molti antibiotici, ormoni, enzimi, immunoglobuline, emoderivati…

e tutti i farmaci prodotti grazie a tecnologie di ingegneria genetica:

IL MINIMO COMUNE DENOMINATORE DI TUTTI QUESTI COMPOSTI E’ LA COMPLESSITA’ STRUTTURALE

Aspirinapeso molecolare: 180 Da

Prodotti di sintesi

Interferone beta:peso molecolare: 19000 Da

Prodotti biotecnologici

I biofarmaci hanno dimensioni e struttura molto più complesse dei prodotti chimici

Proteine terapeutiche - Svantaggi

1.nuove metodologie di produzione2. riproducibilità nella produzione3.purificazione della macromolecola di

sintesi4.contaminanti nella purificazione5.stabilità del prodotto finito6.vie di somministrazione e

farmacocinetica

Proteine terapeutiche – Vantaggi

1.Generalmente esercitano una attività estremamente mirata e specifica

2.Data la loro specificità hanno limitati effetti collaterali indesiderati

3.Data la loro alta specificità ed essendo di origine umana sono generalmente ben tollerati

4.Possono sopperire a un difetto genetico – nuovi bersagli terapeutici

5.Il tempo di approvazione da parte delle autorità regolatorie è significativamente inferiore a quello di molecole di sintesi (1 anno per 33 proteine/ 294 piccole molecole approvate tra 1980 e 2002 )

6.La protezione brevettuale può essere più lunga di altri composti per le difficoltà di ottenere prodotti biosimilari

Proteine terapeutiche di I e II generazione

Proteine di I generazione identiche alle proteine endogene umane

Proteine di II generazione modificate al fine di:

-Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica (diminuire la biodegradabilità, aumentare la penetrazione cellulare, ecc)-Generare prodotti innovativi con funzioni diverse da quelle originarie-Generare dei prodotti più stabili facilitandone la conservazione

Proteine di II generazione

TNF (Fattore di Necrosi Tumorale) una citochina che gioca un ruolo chiave nel danno infiammatorio in malattie autoimmuni o nella malattia di Crohn

La prima di queste, l’ Etanercept (Enbrel), è una proteina di fusione dal peso molecolare di 150 kDa tra la forma solubile del recettore per il TNFalfa umano e la porzione Fc delle immunoglobuline umane IgG.

Farmaci con funzione analoghe sono l’Infliximab (Remicade), un anticorpo monoclonale “chimerico” cioè in parte umano (frammento Fc umano) e in parte di derivazione murina (domini della catena variabile VK e VH)

Adalimumab (HUMIRA) sviluppato molto recentemente che consta di un anticorpo interamente umanizzato.

MODIFICAZIONI SECONDARIE CHE CAMBINO IL PROFILO DI IDROFOBICITÀ

Possono migliorare il legame con proteine di trasporto plasmatiche di trasporto e quindi la residenza nel circolo:

Insulina detemir della Novo Nordisk),

interferone alfa, peptide GLP1, desmopressina (legame di acidi grassi a residui attivi sulla superficie della proteina)

AGGIUNTA DI POLIETILENGLICOLE (PEG) PER AUMENTARE LE

DIMENSIONI DELLA PROTEINA E RIDURNE IL METABOLISMO E

CLEARENCE RENALE

Analoghi del GH : Pegvisomant

Analogo ricombinante di hGH - lys 120 sostituita con una glypreviene la dimerizzazione funzionale del recettore

qualsiasi aminoacido tranne lys o ala in questa posizione:Promotore della crescita Þ antagonista GH

- Pegilazione – coniugazione via i gruppi aminici a 4 - 6catene di polietilen-glicoleAumento di T1/2 (SC) a circa 6 giorniPicco plasmatico 33 - 77 ore

Ridotta immunogenicitàla pegilazione maschera i determinanti antigeniciRidotta affinità di legamealtri otto aminoacidi sostituiti

La complessità strutturale dei biofarmaci richiede una complessità

nella produzione

Typical Protein Production Process

La scelta della sequenza genica

INIZIO

La scelta del vettore

La scelta dell’organismo

per la produzione

La scelta delle condizioni di

fermentazione

La scelta del downstream processing

Produzione di proteine terapeuticheProcessi diversi danno luogo a prodotti non identici tra loro

FIN

E

Il prodotto finale è il risultato di numerose scelte

Difficoltà nella produzione di biofarmaci

• Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene.

• Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento nell’impianto pilota

• Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks.

• Controllo delle condizioni di produzione • Recupero e produzione• Caratterizzazione del prodotto

CONTROLLO QUALITA’

Difficoltà nella produzione di biofarmaci

Spettrometria di massa

Presenza di DNA cellulare

Presenza pirogeni

Presenza di proteine cellulari

Presenza di proteine seriche

HPLC

SDS PAGE/Western

Determinazione dello stato di purezza

Composizione in acido sialico

Composizione in carboidrati

Sequenziamento N-terminale

Mappa peptidica

HPLC

Isoelectrofocusing

SDS PAGE Western

Saggio immunologico

Saggio biologico

Caratterizzazione della proteina

Controllo di qualità di proteine terapeutiche

Microeterogeneità di proteine terapeutiche

collegate alla biologia del prodotto o al processo produttivo

process related, undesired modifications of side chains(e.g.,carbamylation,citraconylation)

artifical, desired modification (e.g. pegylation)

process related, undesired modifications of amino acids (e.g., oxidation, deamidation pyroglutamate formation)

biologic, desired modifications(e.g., glycosylation, phosphorylation, sulfatation, acylation)

process related, undesired modifications of the tertiary and quaternary structure (e.g., partial denaturation, aggregation)

biologic, undesired modifications(e.g., methylation, acetylation, formylation, proteolysis)

L’esempio del : t-PA (527 amino-acid protein; 17 S-S bridges; 3 glycosylation sites)

COOHNH2

Deamidation of Asn residues

Oxidation of Cys or Met residues

Eterogeneità determinate per via sperimentaleVariability in N-linked carbohydrate side chains

Single-chain and two-chain forms

Additional O-Glycosylation

Proteolysis at Arg-X

N-terminal sequence length variation

Total possible variants: 1.09 x 109References available

Spesso i farmaci biotecnologici sono costituiti da una miscela di isoforme

1313

Isoelectric Focusing: glycosylated product is subfraction of cell culture isoforms

CellCulture

PureBulk

12121111

1010

1414

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

5 7 8 9 10 11 12 13 14

Isoform Number

[U/m

g]

In-vivo Bioactivity

Eritropoietina sintetizzata da diversi laboratori

Source: Schellekens H, EJHP, 3/2004, Scientific Section, pp 43-47.

Different biophysical characteristics when compared to the innovator product (Eprex®)

Cosa sappiamo delle risposte cliniche a “piccole” variazioni nelle molecole sintetizzate da diversi laboratori?

Experience from Innovators and manufacturing process changes

Tissue Plasminogen Activator (tPA) - Genentech• Roller bottle to a fed batch process (new cell line, new downstream processing and new formulation)• Analytics showed different carbohydrate structures; clinical studies showed impact on PK and efficacy• This led to a delay in clinical development whilst differences were further investigatedLenercept - Genentech• Scaled-up the manufacturing process that led to less sialylation of the protein• In clinical studies, this was shown to impact the PK and increase the immunogenicity• The project was terminatedRaptiva - Genentech• Scaled-up the process before conducting phase 3 clinical studies and found small analytical differences• No differences in nonclinical PK. In clinical studies AUC had increased by 30% and efficacy had decreased• Phase 3 study repeatedEprex – J&J• Formulation change; no analytical differences observed• Resulted in >180 cases of pure red cell aplasia (PRCA) in renal failure patients (175/191 Eprex)• SC route of administration contraindication; further drug product changes; 20,000 patient registry

Due farmaci con meccanismo d’azione apparentemente identico

Adalimumab e Infliximab : Adalimumab e Infliximab : legame selettivo con il TNFa e legame selettivo con il TNFa e conseguente blocco della conseguente blocco della interazione con i recettori del interazione con i recettori del TNF, p55 e p75 TNF, p55 e p75

Etanercept: inibizione Etanercept: inibizione competitiva del legame del competitiva del legame del TNF ai recettori di superficie, TNF ai recettori di superficie, che previene le risposte che previene le risposte cellulari mediate dal TNF cellulari mediate dal TNF rendendo il TNF rendendo il TNF biologicamente inattivobiologicamente inattivo

Apparente maggiore efficacia di moAb anti-TNF vs Etanercept

Ma risposta clinica a Etanercept in alcuni casi non-responsivi a Infliximab

Blocco TNF e vs solo

Dosaggi diversi?

Effetto biologico diverso? (efficacia in m. granulomatose, i.e. Crohn)

Due farmaci con meccanismo d’azione apparentemente identico

Biosimilari in quanto sono simili, non identici, ai prodotti originali copiati

EMEA Guidelines• “It is not expected that the quality attributes … will

be identical”• “Minor differences in the active substance, such as

variability in post-translational modifications may be acceptable, however, must be justified”

• “there may be subtle differences between biosimilars”

These differences can have clinical implications eg. different efficacy or safety

Perchè biosimilare e non generico• Biosimilar, Follow-on Biologic, Follow-on Protein, Subsequent Entry

Biologic …….• Prodotto biologico che vuole essere assimilabile a un prodotto

biologici innovativo il cui brevetto è scaduto. Tuttavia, la produzione del biosimilare– Avviene da parte di ditte diverse dalla Ditta originaria detentrice

del brevetto– Richiede un nuovo orgaismo per la produzione, un nuovo

processo produttivo, nuovi metodi analistici• I primi biosimilari:

– Omnitrope® (somatropin) in Australia, EU e USA– Valtropin® (somatropin) in EU– NON esistono prodotti-copia in Asia e in S. America

Leggi e regolamentiL’European Medicines Agency (EMEA) nel 2004 ha elaborato una serie di direttive per l’approvazione di farmaci biosimilari : i primi tre farmaci biosimilari approvati in Europa sono stati: 1.Ormone della crescita2.Eritropoietina3.Granulocyte-colony stimulating factor

Nell’ottobre 2010 i funzionari EMEA hanno iniziato a prendere in considerazione la legislazione per l’immissione sul mercato di anticorpi monoclonali (mercato globale 36,4 miliardi di US$): nel 2013 scade il brevetto del Rituximab (mercato globale 5,6 milioni di US$)

Biosimilar views outside the EU

Omnitrope® (somatropin) - SandozDifferent opinions in different regions

Australia

Genotropin• Children; GHD• Adults; GHD• Turner syndrome• Prader-Willi syndrome

Omnitrope• Children; GHD• Turner syndrome• Growth disturbance; renal insufficiency

United States

Genotropin• Children; GHD• Adults; GHD• Prader-Willi syndrome• Children small for gestational age

Omnitrope• Children; GHD• Adults; GHD

Europe

Genotropin• Children; GHD• Adults; GHD• Turner syndrome• Prader-Willi syndrome• Children small for gestational age

• Growth disturbance renal insufficiency

Omnitrope• Children; GHD• Adults; GHD• Turner syndrome• Prader-Willi syndrome• Children small for gestational age

• Growth disturbance; renal insufficiency

Omnitrope Clinical Programme• Phase 1 (PK/PD)

• 3 studies in healthy volunteers; n = 60• Phase 3

• 1 study in children with GHD; n = 89

Post- approval commitments (EU)• Safety in children small for gestational age• Safety in children with Prader-Willi syndrome• Occurrence of malignancy• Occurrence & impact of anti-GH antibodies

United StatesLegal and Regulatory Status

Legal basis for approval

• Several provisions for abbreviated approvals

• eg. Hatch-Waxman for drugs• Biologics are specifically excluded• 505(b)2 offers a pathway for FDCA

proteins eg. Omnitrope

• Majority of biologics approved under this act

• PHSA does not have provisions for abbreviated approvals

• Congress discussing legislative pathway now (proposed legislation under debate)

Food, Drug & Cosmetics Act (FDCA) Public Health Service Act (PHSA)

• FDA has published a “white paper” 4 and testified at Congressional hearings• Science allows a legal and regulatory pathway to be established• Generics principles cannot be applied• Data exclusivity provisions for innovators (proposals range from 0 to 14+ years)

Outstanding issues

Issues still being addressed in Europe

Interchangeability(ie. automatic substitution)

Should or can we adopt the same “automatic substitution” principles that we have in place for small-molecule generics?

Generic principles are based on the active substance being identical – biosimilars will be similar, not identical

Pharmacovigilance & Traceability

“to support pharmacovigilance monitoring, the specific medicinal product given to the patient should be clearly identified” 1

Decisions/guidance on how this will work in practice still pending

Non-proprietary Names

On-going debate at international level Questions centre on role of INN in clinical practice ie.

prescribing/dispensing and pharmacovigilance WHO decision expected in late 2007

Prescribing Information

What information should be provided to healthcare providers and patients – should we follow the generic model?

Transparency seems to be ultimate direction ie. not generic model

eg. clinical data for approval, advice on substitution

Conclusioni

Conclusioni• Biosimilari sono una nuova classe di prodotti medicinali

– Non sono generici come inteso per le piccole molecole di sintesi• L’ EMEA ha stabilito ottimi standard per l’approvazione

– Una serie di importanti domande deve trovare una risposta solo dopo l’approvazione

• Rimangono punti di discussione che riguardano l’introduzione dei biosimilari nella pratica clinica– Regole per la sostituibilità automatica– Farmacovigilanza– Labelling– Scelta del nome

• La comunità medica deve avere la piena consapevolezza delle problematiche legate all’uso di biosimilari

References1. EMEA guidelines for similar biological medicinal products. Available at

http://www.emea.europa.eu/htms/human/humanguidelines/multidiscipline.htm2. European Public Assessment Report (scientific assessment) for Omnitrope.

http://www.emea.europa.eu/humandocs/Humans/EPAR/omnitrope/omnitrope.htm3. European Medicines Agency Questions and Answers on recommendation for refusal of marketing

application for Alpheon. http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/opinion/19089606en.pdf4. The FDA’s assessment of follow-on protein products: a historical perspective

Nature Reviews Drug Discovery, published online 13 April 2007; doi:10.1038/nrd2307 http://www.nature.com/nrd/journal/vaop/ncurrent/pdf/nrd2307.pdf

FARMACI INTELLIGENTI(TARGETED THERAPY)

…..ogni terapia, per definizione, ha un bersaglio.

forse ad oggi non abbiamo ancora compreso tutti i bersagli esatti da colpire, purtroppo i nostri pazienti soffrono ancora per questa

mancanza…

George W. Sledge, Jr; J Clin Oncol, 2005

Initiating event

estrogen receptor in an infiltrating

ductal carcinoma

hyperproliferation

resist. to death

migration

invasion

inflammation

ECM remodeling

angiogenesis

lynphoangiogenesis

.. ma per molte neoplasie il bersaglio è ben definito

Alterazioni della funzione di geni che giocano un ruolo importante nell’origine e patogenesi delle neoplasie

umane.

Tre categorie principali di alterazioni delle funzioni geniche sono alla base della progressione tumorale;

queste comprendono •geni che codificano per proteine “sopressore”

•geni che codificano enzimi per il riparo del DNA •oncogeni

Una terapia con un bersaglio molecolare ben definito

COSA SI INTENDE PER TARGETED THERAPY

La “targeted therapy” dovrebbe agire su un processo biologico rilevante (generalmente, anche se non sempre, su una singola molecola) preferibilmente il processo caratteristico della patologia da curare. Il bersaglio dovrebbe poter essere misurabile clinicamente e la misura dell’effetto della terapia sul bersaglio dovrebbe correlare con lo stato di salute del paziente.

TARGETED THERAPY – LE MOLECOLE

Molecole di piccole dimensioni-farmaci più tradizionali •Imatinib mesylate (Gleevec, also known as STI–571)•Gefitinib (Iressa, also known as ZD1839), targets the epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase •Erlotinib (marketed as Tarceva). Erlotinib inhibits epidermal growth factor receptor•Bortezomib (Velcade) is an apoptosis-inducing drug that causes cancer cells to undergo cell death by interfering with proteins. •Newer BCL-2 antagonists (e.g. Gossypol). •The selective estrogen receptor modulator tamoxifen has been described as the foundation of targeted therapy

• Rituximab targets CD20 found on B cells. • Trastuzumab (Herceptin) targets the Her2/neu (also known as ErbB2)

receptor• Cetuximab (marketed as Erbitux) targets the epidermal growth factor

receptor. • Bevacizumab (marketed as Avastin) targets circulating VEGF ligand

Farmaci biologici – anticorpi monoclonali (chimerici-umanizzati-umani)

Un trattamento che utilizza farmaci o altre sostanze, quali anticorpi monoclonali, per identificare e agire selettivamente sulla cellula neoplastica ….

…..non mirato a colpire tutte le cellule in mitosi (es. la chemioterapia più tradizionale)

Dictionary of Cancer Terms National Cancer Institute USA

Targeted therapy deve avere minori effetti collaterali rispetto a trattamenti più tradizionali.

Targeted therapy

ALLA TERAPIA MIRATA OCCORRE AFFIANCARE METODI PRECISI:

•PER L’IDENTIFICAZIONE DEL PAZIENTE

•PER LA IMMEDIATA VERIFICA DELLA EFFICACIA DEL TRATTAMENTO

Il prossimo obiettivo per le “targeted therapies” sarà l’identificazione dei pazienti che possono rispondere al meglio alla terapia. La via per l’identificazione di queste-sottopopolazioni sono marcatori e “molecole di misura” surrogati.

FARMACOGENETICA

Tecnologie per l’analisi dell’immagine applicabili alla verifica degli effetti positivi del

trattamento in tempi reali

IL COSTO DEI FARMACI INTELLIGENTI

ricerca biologica

trattamento di pazienti