Adriana Maggi
description
Transcript of Adriana Maggi
Adriana Maggi
METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI
L’IMAGING FUNZIONALE PERMETTE DI
STUDIARE EVENTI MOLECOLARI IN
CELLULE E ORGANISMI MULTICELLULARI
CON L’APPLICAZIONE DI SISTEMI
REPORTER
SISTEMA REPORTER = MOLECOLE FACILMENTE
VIASUALIZZABILI E MISURABILI CHE
RIPRODUCONO FEDELMENTE L’EVENTO
MOLECOLARE IN STUDIO
Atr i reporter più uilizzati:
Tra i reporter più utilizzati: cloramfenicolo acetiltransferasi, fosfatasi alcalina, beta galattosidasi, beta-glucuronidasi, luciferasi, proteina verde fluorescente
β-glucuronidasi: un enzima presente in vertebrati e molluschi che agendo su substrati incolori quali:5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronide determina la formazione di un composto di colore blu4-metlbelliferil-beta-D-glucuronide determina la formazione di un composto fluorescente
Cloramfenicolo acetiltransferasi: un enzima di origine batterica in grado di transferire un gruppo acetilico da acetil-COA (radioattivo) al cloramfenicolo
β-galactosidase un enzima idrolitico che agisce sul substrato X-gal trasformandolo in galattosio e 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole che, ossidato a 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo produce un prodotto insolubile di colore blu
Low sensitivity in the absence of enhancer (this is not an enzymatic reaction)
Monomeric, no substrate required, not expressed in mammalian, variants with different of emission
Green fluorescent protein (GFP, and variants RFP, BFP)
Very high background in selected cell types
Secreted protein, enzymatic assay extremely sensitive.
Fosfatase (human)
Detection needs the cofactor O2, ATP. Substrate quite expensive
High specific activity, very low background)
Luciferase(insect)
Presence of endogenous activity in mammalian cells, tetrameric enzymes- non linear response
Well characterized, stable, low cost substrate, detectable by automtized systems
B-Galattosidase (Bacateria)
DISADVANTAGESADVANTAGESGENE
Reporter bioluminescenti e fluorescenti
Tipiche molecole reporter per imaging sono:
Molecole fluorescenti (GFP, YFP, others),
proteine strutturalmente omologhe contenenti
sequenze di tre aa in grado di funzionare da
cromoforo
Molecole bioluminescenti (fotoproteine e
luciferasi) proteine che diventano/emettono
particelle luminose in prsenza di specifici
cofattori o substrati
Green fluorescent protein (GFP) di medusa (Aequrea victoria)
Una proteina composta da 238 aa la cui struttura spaziale determina la formazione di una struttura a forma di “lattina di birra” al cui interno risiede il cromoforo (un
tripeptide formato da serine 65, tyrosine 66, glycine 67 ).L’emissione è a = 504 nm)
Discosoma red flu
orescent
protein chromophore
The Zoanthus yellow
fluorescent protein
chromophore
Anemonia sulcata "kindling" fluorescent protein
Trachyphyllia geoffroyi "Kaede" red fluorescent protein chromophore
Natural Fluorescent proteins
Synthetic Fluorescent proteins
luciferin + ATP → luciferyl adenylate + Ppi
luciferyl adenylate + O2 → oxyluciferin + AMP + light
La reazione catalizzata dalla luciferasi consiste in due passaggi:
Nel caso della celentrazina, il Ca++ causa un cambiamento conformazionale che destabilizza la perossi-celentrazina con conseguente ciclizzazione, decarbossillazione ed emissione di Co2 e bioluminescenza
I sistemi reporter nello studio della regolazione dell’espressione genica
Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione.
Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con l’espressione del gene reporter.
Questo principio può essere esteso agli animali transgenici
X
Y
Gene reporterPromotore
Elementi di regolazione cis
Z
Elementi di regolazione trans
Proteina facilmente dosabile
Identificazione di molecole attive su fattori di trascrizione.
ER cDNA
ERE LUC Potenziali ligandi
CTR CTRE2
LU
C U
nit
sLUC
ERER
I sistemi reporter nello studio di rilascio/sintesi di trasduttori del segnale
I sistemi reporter nello studio di interazioni tra proteine
GENERAZIONE DI SISTEMI REPORTER Ingegneria Cellulare
Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o mediante l’inserimento
di DNA esogeno
La scelta del sistema cellulare
• coltura primaria
• cellula immortalizzata
• linea tumorale
Transfezioni stabili o transienti
Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi
Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura.
La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate
Scelta della tecnica di transfezione
Microiniezione
Adsorbimento mediante DEAE-Destrano
Coprecipitazione con calcio fosfato
Lipofezione
Elettroporazione
Infezione con vettori virali
Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP).
Citosol BFP
Golgi GFP