Adriana Maggi

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Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI
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    02-Feb-2016
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Adriana Maggi. METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI. L’IMAGING FUNZIONALE PERMETTE DI STUDIARE EVENTI MOLECOLARI IN CELLULE E ORGANISMI MULTICELLULARI CON L’APPLICAZIONE DI SISTEMI REPORTER. - PowerPoint PPT Presentation

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  • METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI

  • LIMAGING FUNZIONALE PERMETTE DI STUDIARE EVENTI MOLECOLARI IN CELLULE E ORGANISMI MULTICELLULARI CON LAPPLICAZIONE DI SISTEMI REPORTER

  • SISTEMA REPORTER = MOLECOLE FACILMENTE VIASUALIZZABILI E MISURABILI CHE RIPRODUCONO FEDELMENTE LEVENTO MOLECOLARE IN STUDIOAtr i reporter pi uilizzati:Tra i reporter pi utilizzati: cloramfenicolo acetiltransferasi, fosfatasi alcalina, beta galattosidasi, beta-glucuronidasi, luciferasi, proteina verde fluorescente

  • -glucuronidasi: un enzima presente in vertebrati e molluschi che agendo su substrati incolori quali:5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronide determina la formazione di un composto di colore blu4-metlbelliferil-beta-D-glucuronide determina la formazione di un composto fluorescente

    Cloramfenicolo acetiltransferasi: un enzima di origine batterica in grado di transferire un gruppo acetilico da acetil-COA (radioattivo) al cloramfenicolo -galactosidase un enzima idrolitico che agisce sul substrato X-gal trasformandolo in galattosio e 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole che, ossidato a 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo produce un prodotto insolubile di colore blu

  • Low sensitivity in the absence of enhancer (this is not an enzymatic reaction)Monomeric, no substrate required, not expressed in mammalian, variants with different l of emissionGreen fluorescent protein (GFP, and variants RFP, BFP)Very high background in selected cell typesSecreted protein, enzymatic assay extremely sensitive.Fosfatase (human)Detection needs the cofactor O2, ATP. Substrate quite expensiveHigh specific activity, very low background)Luciferase(insect)Presence of endogenous activity in mammalian cells, tetrameric enzymes- non linear responseWell characterized, stable, low cost substrate, detectable by automtized systemsB-Galattosidase (Bacateria)DISADVANTAGESADVANTAGESGENE

  • Reporter bioluminescenti e fluorescenti

  • Tipiche molecole reporter per imaging sono:

    Molecole fluorescenti (GFP, YFP, others), proteine strutturalmente omologhe contenenti sequenze di tre aa in grado di funzionare da cromoforoMolecole bioluminescenti (fotoproteine e luciferasi) proteine che diventano/emettono particelle luminose in prsenza di specifici cofattori o substrati

  • Green fluorescent protein (GFP) di medusa (Aequrea victoria)

    Una proteina composta da 238 aa la cui struttura spaziale determina la formazione di una struttura a forma di lattina di birra al cui interno risiede il cromoforo (un tripeptide formato da serine 65, tyrosine 66, glycine 67 ).Lemissione a l= 504 nm)

  • Discosoma red fluorescent protein chromophore The Zoanthus yellow fluorescent protein chromophore Anemonia sulcata "kindling" fluorescent protein Trachyphyllia geoffroyi "Kaede" red fluorescent protein chromophore Natural Fluorescent proteins

  • Synthetic Fluorescent proteins

  • luciferin + ATP luciferyl adenylate + Ppi

    luciferyl adenylate + O2 oxyluciferin + AMP + light La reazione catalizzata dalla luciferasi consiste in due passaggi:

  • Nel caso della celentrazina, il Ca++ causa un cambiamento conformazionale che destabilizza la perossi-celentrazina con conseguente ciclizzazione, decarbossillazione ed emissione di Co2 e bioluminescenza

  • I sistemi reporter nello studio della regolazione dellespressione genicaCon i sistemi reporter possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione.Inoltre possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con lespressione del gene reporter.Questo principio pu essere esteso agli animali transgeniciXYGene reporterPromotoreElementi di regolazione cisZElementi di regolazione transProteina facilmente dosabile

  • Identificazione di molecole attive su fattori di trascrizione.ER cDNAERELUCPotenziali ligandiCTRCTRE2LUC Units

  • I sistemi reporter nello studio di rilascio/sintesi di trasduttori del segnale

  • I sistemi reporter nello studio di interazioni tra proteine

  • GENERAZIONE DI SISTEMI REPORTER Ingegneria CellulareModificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o mediante linserimento di DNA esogeno

  • La scelta del sistema cellulare

    coltura primaria cellula immortalizzata linea tumorale

  • Transfezioni stabili o transientiTransfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura.La probabilit di integrazione stabile dellordine di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate

  • Scelta della tecnica di transfezione MicroiniezioneAdsorbimento mediante DEAE-DestranoCoprecipitazione con calcio fosfatoLipofezioneElettroporazioneInfezione con vettori virali

  • Imaging dellespressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP).Citosol BFPGolgi GFP