BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHEAA 2008/09

LEZIONE 6Acidi nucleici e farmaci

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

Adriana Maggi

GLI OLIGONUCLEOTIDI ANTI-GENE (TRIPLEX)

L’oligonucleotide si lega in modo specifco al DNA, intercalandosi nella struttura a doppia elica, formando un tratto di catena tripla che determina l’inattivazione della replicazione del DNA e della trascrizione dell’mRNA

VANTAGGI DELLA TERAPIA ANTIGENE RISPETTO AGLI ODN

Tale modalità di impiego mostra prospettive alquanto interessanti poiché l’azione diretta sul gene implica l’uso di quantità inferiori di ODN essendo in questo caso solo due i targets (le due copie del gene) rispetto ai numerosissimi targets della strategia ODN (le copie dell’mRNA). Si garantisce inoltre una più durevole attività terapeutica contando sulla maggiore durata dell’emivita del gene rispetto a quella del messaggero.  

Questa strategia comporta la formazione di un breve tratto a tripla elica (mediante legami di Hoogsteen) nelle regioni di controllo della trascrizione presenti nel DNA.

TRIPLEX

Le prime indicazioni, indirette circa la possibilità di formazione di un tratto di DNA a tripla elica risale a studi sulla densità ottica con miscele di poli U e poli A condotti da B. Felsenfeld nel 1957.

Hoogsteen chiarisce la natura dei legami che consentono la formazione della tripla elica in tratti omopurinici e omopirimidinici (AG o TC). In questo contesto la C non presenta atomi disponibili per un ponte idrogeno con la G prospiciente e deve essere quindi protonata. Tale reazione può avvenire a un pH leggermente acido (6,6) e in presenza di ioni bivalenti. In queste condizioni l’ODN ibridizza con la sequenza omopurinica complementare mediante legami di Hoogsteen, formando così le due triplette T-AT e C-GC. L’ODN si colloca nel solco maggiore del duplex preesistente con una orientazione parallela alla sequenza omopurinica del DNA bersaglio.

LEGAMI DI HOOGSTEEN

PROBLEMATICHE DELLA TERAPIA ANTI-GENE

1. Il bersaglio deve essere costituito da sequenze omopuriniche/pirimidiniche

2. La lunghezza della sequenza bersaglio deve essere minimo di 15 nucleotidi consecutivi

3. Il rapporto A/G non deve essere inferiore a 4

molte sequenze 5’ rispetto ai DNA codificanti hanno tratti omopurinici

4. Tutte le C devono essere protonate e quindi occorre agire a pH più bassi di quello fisiologico.

Questo problema può essere superato con alcuni stratagemmi

METODICHE PER SUPERARE L’OSTACOLO DELLA PROTONAZIONE

1. utilizzo nella sintesi dell’ODN di 5-metilcitosina che consente l’ibridizzazione al duplex anche a pH neutri

2. Utilizzare ODN costituiti da PNA che hanno una migliore capacità di ibridizzare

3. Utilizzo di molecole intercalanti legate all’ODN, capaci di legare una base sul duplex conferendo una maggiore stabilità alla tripla elica

4. Sostituire la base citosina con l’eterociclo 2-aminopiridina, il cui pKa è maggiore di quello della citosina e ciò favorisce il legame a pH neutro

Watson-Crick PNA Strand

HoogsteenPNA Strand

DNA Strand

N

N

N

N

N

Watson - Crick

HH

Hoogsteen

N

NO H

O

CH3

N N

CH3

O

O

H

T

A

T

NH3+ C T C T T C T T C

'3 G A G A A G A A G 5'

COO- C T C T T C T T C

PNA Strand invasion

COO-

NH3+

5’

3’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

CHIMICA DEL LEGAME PNA-DNA

I PNA possono legarsi al DNA sia attraverso legami idrogeno sia di Hoogsteen

I RIBOZIMI

RIBOZIMI NATURALI

Producono nel taglio di un RNA substrato estremità 3’OH e 5’ fosfato.Sono raggruppabili in classi in base alla loro struttura ed alle reazioni in cui sono coinvolti

RNAsi P: Ubiquitaria, è responsabile della maturazione dei tRNA nel loro estremo 5’

RNAsi HRP: Replicazione DNA mitocondriale tagliando RNA primer

INTRONI tipo I: Tetrahymena pre RNA mitocondriale di

lievito geni di cloroplasti

INTRONI tipo II: con meccanismo di splicing conservato (precursori di mRNA in

organelli di funghi e piante)

CARATTERISTICHE COMUNI AI RIBOZIMI

Reazione di formazione e rottura di legami covalenti in molecole substrato a RNA

I ribozimi sono catalizzatori di reazioni che li vedono altresì implicati come substrato

La struttura tridimensionale dell’enzima determina la sua specificità di legami con il substrato a creare il sito catalitico

Le reazioni catalizzate sono basate sullo scambio di protoni (con conseguente idrolisi o transesterificazione risultanti nel taglio di legami fosfodiesterici)

I ribozimi sono metallo-enzimi

MECCANISMO D’AZIONE DEGLI INTRONI DI TIPO I

1. Attacco nucleofilo della guanina presente nell’ambiente

2. Generazione di un terminale OH

3. Seconda transesterificazione per attacco nucleofilo del terminale libero sul primo nucleotide dell’esone in 3’

SITI ATTIVI NEGLI INTRONI DI TIPO I

GGGAGG

GGGAGG 5'

G

GGGAGG5'

3'GOH

GGGAGG

G

+

G414

G-OH

3'

CUCUCU5'

G-binding site

Substrate binding site

IGS

ex1

ex2

414

3'1st transfer

CUCUCU5'

ex1

G

OH

ex2

ex1

ex2+

414

2nd transfer

UUUACCUG

3rd transfer

414

5'G UUUACCU

MECCANISMO D’AZIONE DEGLI INTRONI DI TIPO II

• Usano il 2’ OH di una adenina interna all’introne

• Attacca il 5’ fosfato sul primo nucleotide dell’introne

• L’introne assume una struttura circolare tipica detta “lariat”

• Gli esoni sono uniti e l’introne è exciso mantenendo la struttura “lariat”

• Un enzima appositamente deputato taglia il “lariat” e origina un introne lineare

• L’introne lineare viene degradato

2’

AHO

2’

Exon 1 Exon 2

OH

A

Exon 1+22’ A

+

STRUTTURA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD

Lo schema rappresenta il cambiamento di struttura in due fasi, indotto dal legame di ioni Mg2+.La prima fase consiste nella formazione di un dominio coassiale tra due eliche la seconda genera il core catalitico.Il ribozima con la struttura finale è in grado di auto-tagliarsi nel punto indicato dalla freccia rossa

STRUTTURA SECONDARIA E TERZIARIA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD

La sequenza CUGA adiacente allo stem loop I è sufficiente per il taglio

Struttura terziaria

STRUTTURA CRISTALLOGRAFICA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD

La struttura cristallina evidenzia 5 siti di legame per il Mg2+

PICCOLI RNA CATALITICI-1

VIROIDI

Molecole di RNA infettive che funzionano indipendentemente, prive di capside proteico

VIRUSOIDISimili ai viroidi ma sono incapsulati insieme al genoma virale in virus di piante. Non replicano indipendentemente dal virus. Sono perciò detti RNA satelliti

Questi RNA promuovono reazioni di auto-taglio. Tale reazione è favorita da cationi divalenti e genera terminali 5’ OH e 2’-3’ ciclici. Molti di essi per tagliare assumono una struttura hammerhead

PICCOLI RNA CATALITICI-MECCANISMO D’AZIONE

1. legame fosfodiestere

intatto

2. Stato di transizione che coordina il mg2+

3. Taglio del legame

fosfodiestere

RIBOZIMI MECCANISMO D’AZIONE -1

RNA è una molecola meno stabile del DNA perché l’O in 2’ può attaccare il legame fosfodiesterico adiacente (attacco nucleofilo) e romperlo, lasciando un fosfato 2’-3’ ciclico e un ossidrile in 5’.

MODALITA’ DI TAGLIO DI RNA:

RNAsi P e introni di tipo I e II catalizzano l’idrolisi del legame fosfodiesterico, lasciando un fosfato in 5’ e un ossidrile in 3’

Le reazioni di taglio che dipendono dall’O in 2’ possono essere attivate in due modi:1) Ambiente alcalino: l’O in 2’ si attiva per ionizzazione

2) Ribonucleasi A catalizza la reazione di taglio usando un residuo basico di istidina per spostare il protone dell’O al 2’ e un residuo acido di aspartato per trasferirlo al 5’

La carica positiva di un residuo di lisina adiacente interagisce con il fosfato e lo stabilizza durante lo stato di transizione.

Il fosforo tende ad assumere una conformazione a bipiramide trigonale durante lo stato di transizione e questo può spiegare perché il taglio mediato dall’O al 2’ è più rapido in presenza di nucleotidi (pirimidina, adenosina) specifici perché le interazioni tra basi possono influenzare la conformazione del legame fosfodiestere

RIBOZIMI MECCANISMO D’AZIONE -2

APPLICAZIONI TERAPEUTICHE DEI RIBOZIMI-1

Ribozima con mRNA corretto

Sono attivi in “CIS” cioè intramolecolarmente. Studi in

corso prevedono manipolazioni per indurli a lavorare in

“TRANS” ad esempio per il riparo di RNA mutati o

danneggiati.

Esempio: ripristino del controllo della proliferazione cellulare agendo su p53

mRNA mutato

+

mRNA corretto mRNA scartato ribozima

+ +

ANGIOZYME TM

HEPTAZYME TM

Ribozima disegnato per inibire il VEGF (Vascular EndothelialGrowth Factor).

ANGIOGENESIS

Ribozima che lega sequenze altamente conservate del virus dell’epatite C

HCV DRUG RESISTANCE

RIBOZIMI IN CLINICAL TRIALS-1

HIV Gene Therapy...Bone Marrow Sample

Treat Stem Cells with Retroviral Vector

Re-Implant Treated Cells

Encodes Gene for anti-HIV Ribozyme

RIBOZIMI IN CLINICAL TRIALS-2

APTAMERI

Sono ORN o ODN capaci di riconoscere una specifica

sequenza amminoacidica o un epitopo appartenente

ad una proteina

Sono stati scoperti per caso osservando l’alterazione

del processo di coagulazione, dovuto ad un aumento

del tempo di protrombina in seguito alla

somministrazione di ODN antisenso.

In queste molecole e’ presente un “G quartet” che

conferisce al DNA la capacità di legare la trombina

inattivandola

APTAMERO PER L’-TROMBINA

Organizzazione strutturale dell’aptamero per l’-trombina e disposizione dei quartetti di guanina che ne stabilizzano la conformazione

APTAMERI CON STRUTTURA 3D DETERMINATA

Ligando Affinita’ Kd (M)Acido nucleico

Teofillina

FMN

AMP

Arginina

Citrullina

Tobramicina

Neomicina B

HIV-1 Rev peptide

HTLV-1 Rex peptide

MS2 coat protein

Trombina

RNA

RNA

DNA/RNA

DNA/RNA

RNA

RNA

RNA

RNA

RNA

RNA

DNA

0,3

0,5

6/10

125/60

65

0,009

0,115

0,004

0,025

ND

0,025

STRUTTURA DI ALCUNI APTAMERI

Riconoscimento di ligandi aromatici piatti:A: strutture B: teofillina-RNA C: FMN-RNAD: AMP-DNA E: AMP-RNA

Riconoscimento di aminoacidi basici:A: strutture B,C: arginina-DNA D: arginina-RNAE: citrullina-RNA

Riconoscimento dell’antibiotico aminoglicoside tobramicina:A: struttura B: aptamero tobramicina-RNA C: la tasca che accoglie il ligando

Riconoscimento di peptidi e proteine:A:peptide derivante dalla proteina Rev del virus umano HIV-1 B,C: diversi aptameri RNA Rev D, E: aptamero proteina di rivestimento del batteriofago MS2-RNA

                                                                    

       

MOTIVI STRUTTURALI CHE RICONOSCONO IL DNA

FLESSIBILITA’ DEL DNAFLESSIBILITA’ DEL DNA

Struttura del complesso CAP-DNA. Il DNA risulta ripiegato in due punti in seguito all’interazione con la proteina. I cilindri rappresentano la regione proteica interessata.

A tutt’oggi è impossibile indicare a priori se esistano e quali siano le sequenze di DNA in grado di riconoscere una definita struttura enzimatica

L’analisi basata sui metodi computazionali richiede tempi di elaborazione esageratamente prolungati per stabilire la conformazione spaziale di macromolecole

L’isolamento di aptameri ad attività biologica richiede lo sviluppo di metodologie sperimentali specifiche

SELEZIONE DEGLI APTAMERI-1

SELEX ( Systematic evolution of ligands by exponential amplification)

Random or doped DNA pool

Trascribed RNA pool

cDNA

Regenerated DNA pool1. Generazione di una

diversità di sequenza (sintesi chimica, manipolazione enzimatica, PCR)

2. Selezione di forme funzionali attraverso il legame con il bersaglio e l’eliminazione di molecole non affini

3. Amplificazione della popolazione selezionata con metodiche di PCR

4. Step successivi di selezione e riamplificazione per isolare le molecole più efficienti

UTILIZZO DEGLI APTAMERI

L’UTILIZZO TERAPEUTICO è ancora incerto

Sono utili MEZZI DIAGNOSTICI grazie alla loro alta affinità e specificità per il bersaglio.

Come gli anticorpi possono essere legati a molecole radioattive o ad enzimi la cui attività può essere facilmente valutata. Sono però più piccoli e maneggevoli degli anticorpi

APTAMERI IN TERAPIA

Il primo aptamero approvato come farmaco è stato il MACUGEN per il trattamento della degenarazione maculare (OSI Pharmaceuticals).

Archemix (Cambridge, Ma) sviluppa aptameri antagonisti del Fattore di Willebrand attualmente in Fase clinica 2 per sindrome acuta coronarica

Aptameri non modificati sono in studio per la coagulazione ematica e per la terapia di patologie oculari

APTAMERI IN DIAGNOSTICA

Aptamero legante della tenascina per imaging di neoplasie in sviluppo da parte della Schering AG

SVANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI

1. Come gli aODN sono molecole relativamente poco stabili

2. Problemi nella distribuzione e nella biodisponibilità

3. Costo di produzione

NB. Possono però essere modificati chimicamente per aumentarne la stabilità e si possono utilizzare le metodologie di veicolazione già viste per gli ODN

VANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI

1. Interagiscono specificatamente con i loro target

2. La grande area superficiale degli acidi nucleici permette la formazione di più interazioni con il bersaglio rispetto ai farmaci classici, ciò determina un legame molto stretto (Kd nel range nanomolare e picomolare)

3. Sono in grado di inibire la funzione del loro bersaglio ma anche di modificare il metabolismo associato a quel bersaglio es. aptameri anti-trombina bloccano anche la coagulazione del sangue

DECOY

Sono brevi sequenze di DNA omologhe ad

una sequenza consenso per una proteina

transattivante. Il decoy inibisce la funzione

della proteina legandosi in modo

competitivo al sito di riconoscimento della

proteina con la sequenza consenso

MECCANISMO D’AZIONE DI DECOY CHE INIBISCONO LA PROLIFERAZIONE CELLULARE

TTTCGCGC

TTTCGCGC

TTTCGCGC

TTTCGCGC

TTTCGCGC

TTTCGCGC

TTTCGCGC

E2F

E2F

E2F

cdk

cdk

cdk

P

P

P

RB

RB

RB

Ciclina A

Ciclina A

Ciclina ASilente

Silente

Transattivante

C-mycC-mybCdc2KinasePCNA

oligonucleotide mimicking a negative regulatory sequence of promoter C of estrogen receptor alpha (ER alpha) gene is sufficient for its re-expression in ER-negative human cancer cell lines

NFκB decoy oligo therapy for IBD (Inflammatory Bowel Disease)

E2F Decoy Transfection by HVJ-AVE–Liposome Method Cardiac Allograft Arteriopathy

DECOYS IN THERAPY

NUOVI TARGET TERAPEUTICI

DIFFERENZE APTAMERI/DECOY

APTAMERI

•RNA o DNA singolo o doppio filamento

•Omologhi di consensus dell’RNA

• legano proteine citoplasmatiche

DECOY

•ODN a doppia elica

•Omologhi di consensus dell’DNA

• legano proteine nucleari