Dispense di "Diagnostica di laboratorio"esame di "Semeiotica e metodologia clinica" (dott. Caldin)

A cura dei Rappresentanti degli Studenti e del Manager didattico

DIAGNOSTICA DI LABORATORIOLa diagnostica di laboratorio comprende varie discipline: ematologia, biochimica clinica, patologie urinarie, patologie coagulative, patologie endocrine, microbiologia e biologia molecolare. Questo corso tratter le pi utilizzate: lematologia, la biochimica clinica, le alterazioni emostatiche, il profilo urinario e il profilo endocrino.

EMATOLOGIA Comprende due sezioni: lematologia ematologica, che studia le malattie ematologiche, e lematologia diagnostica, che si occupa delle variazioni dei parametri ematologici causate da altre patologie, o del loro utilizzo per monitorare il decorso delle patologie. Emocromo o Emogramma o Esame Emocromocitometrico suddiviso in tre sezioni: eritrogramma (colonna sinistra), leucogramma (colonna centrale) e piastrinogramma (colonna di destra). C poi una sezione accessoria molto importante per la medicina veterinaria costituita dal dosaggio delle proteine plasmatiche e dalla fibrinogenemia. La prima parte dellemocromo consiste in una conta strumentale tramite contaglobuli, un apparecchio che conta tutte le cellule presenti nel campione di sangue, siano esse eritrocitrarie, leucocitarie o piastrine. Si esegue poi la lettura per la valutazione morfologica delle cellule del sangue per vedere se esse presentino anomalie. Emogramma: accertamento ematologico estremamente generico per ricercare eventuali stati di malattia in atto; un esame a s stante, nel senso che non necessita di altri accertamenti per essere interpreato (come lesame delle urine). Storicamente lesame emocromocitometrico (umano) ha avuto una grandissima evoluzione: - fino a 15 anni fa constava solo di 2 accertamenti: conta dei globuli rossi (RBC), conte dei globuli bianchi (WBC) per valutare eventuali stati infiammatori in corso; - nel tempo si ampliato comprendendo:

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maggiori informazioni sui GB (globuli bianchi) valutazione differenziale delle singole (5) famiglie leucocitarie (formula leucocitaria) con successiva elettronizzazione della conta; conta della piastrine (PLT); indici emocromocitometrici. In veterinaria levoluzione avvenuta con un po di ritardo, ma stato introdotto anche lo studio aggiuntivo di: VES (molto generico ancora), proteine totali (PT) una valutazione simultanea di RBC e PT fa sospettare un'emorragia in corso, fibrinogeno valutazione degli stato infiammatori, pi sensibile della conta dei WBC. RBC: globuli rossi (GR), detti anche eritrociti - 106/l Red Blood Cells: n di eritrociti. Paramentro espresso in milioni/ l, in genere rientrante in un range di riferimento (relativo allo strumento usato): es. nel cane 5.5 - 8.5. Gli eritrociti sono elementi cellulari caratterizzati dallavere: - assenza di nucleo, - forma discoidale, - vita media di 100 giorni (nel cane) o 50-70 giorni (nel gatto), - funzione principale il trasporto di 02 ai tessuti periferici, grazie allHb, proteina contenuta nei RBC in quantit prossima alla soglia di precipitazione (se lHb aumenta, precipita e si ha emolisi), - metabolismo glicolitico (scompongono la molecola fino ad acido lattico): la maggior parte dellenergia viene usata per mantenere la loro deformabilit. Invecchiando gli RBC perdono capacit energetiche e dunque anche quelle di elasticit di membrana, cosicch quando passano attraverso i capillari sinusoidi epatici vengono fagocitati dal SRI (Sistema reticolo istiocitario) avente lindeformabilit come senescenza. La conta automatizzata viene eseguita per mezzo di un tubicino capillare aspirante immerso in una soluzione diluita di sangue. Il tubicino capillare contiene al suo interno 2 elettrodi, fra i quali vi un passaggio continuo di corrente. Quando il capillare viene azionato, aspira una colonnina di sangue che, per ogni particella che contiene, crea uninterruzione di corrente, che viene contata (vedi figura qui sotto) CONTGLOBULI A IMPEDENZA. Inoltre, un elevato numero di RBC comporta eritrocitosi, un basso numero di RBC comporta anemia.

elettrodo capillare aspirante

sangue diluito

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NB: nel sangue, oltre agli RBC, sono presenti anche i leucociti i quali non vengono discriminati dallapparecchio. Fortunatamente per i globuli bianchi sono presenti in titolo minore (migliaia/ l) per cui la loro conta risulta irrilevante. Altri metodi di conta sono: - contaglobuli laser, - conta manuale su camera di Brker. Hb emoglobina - g/dl Lemoglobina una proteina contenuta nei globuli rossi, che permette loro di espletare la funzione principale (trasporta di 02). E un parametro misurato fotometricamente nel canale della conta dei globuli bianchi (GB) ed espresso in g/dl. Il canale per la conta dei GB identico a quella dei GR, con due differenza: - soluzione di sangue meno diluito (perch i GB sono presenti in quantit inferiore) contenente anche una sostanza lisante (es. la saponina) che lisa i GR, - presenza ai lati del cilindro contenente il sangue di un fototrasmettitore e un fotorecettore, tarati sulla lunghezza donda () assorbita dallHb la quantit di luce registrata 1/ (inversamente proporzionale) alla quantit di Hb.

elettrodo capillare aspirante (come per i GR) fototrasmettitore

sangue meno diluito fotorecettore

HCT - ematocrito % Lematocrito la massa eritrocitaria rispetto al totale di sangue ed un parametro espresso il % (per esempio: nel cane 37-55%). Calcolato strumentalmente: durante la conta dei GR lapparecchio in grado di rilevare anche il volume della particella che interrompe il flusso di corrente perch lampiezza dellinterruzione proporzionale alla dimensione della particella. Viene poi rapportato il volume totale dei GR al volume complessivo DI SANGUE (%). Esiste anche un altro valore di ematocrito, detto PVC e misurato mediante centrifugazione del sangue in un capillare che, dopo la sedimentazione, viene inserito in una scala graduata per ricavare il valore.

MICROEMATOCRITO

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plasma sangue PVC 50% globuli rossi

Questo metodo risente di un artefatto fisico perch il procedimento di sedimentazione non mai perfetto, in quanto una piccola quantit di plasma resta sempre intrappolata negli spazi intereritrocitari, per cui PVC HCT (che un dato reale).

INDICI ERITROCITARIMVC: volume corpuscolare medio, calcolato durante la conta del RBC (vedi HCT alto) come media dei volumi eritrocitari rilevati. Riguarda la dimensione. MVC = _HCT_ RBC In base allMVC i globuli rossi si dividono in: normociti, macrociti, microciti. MCH: concentrazione media di Hb, cio peso medio dellHb (g) allinterno dei GR, ma non un dato molto importante. E un parametro indiretto. MCH = __Hb_ RBC MCHC: concentrazione emoglobina corpuscolare media, ossia il volume % dei GR occupato dallHb. Riguarda laffinit tintoriale. MCHC = _Hb_ HCT In base allMCHC i GR si dividono in: normocromici, ipocromici, ipercromici. Fattori che aumentano MCHC. Esistono per alcune condizioni cliniche che ne determinano laumento: 1) strumento non tarato, 2) animale lipemico, unelevata concentrazione di lipidi nel sangue rende opaca la soluzione, meno luce arriva quindi al fotorecettore, di conseguenza vi sar una sovrastima dellemoglobina con un aumento dell MCHC, 3) emolisi; pu essere patologica in seguito a malattie emolitiche o da prelievo, 4) leucocitosi; un cospicuo aumento dei globuli bianchi, come ad esempio in corso di leucemie, causa una sovrastima fotometrica dellemoglobina. In questo caso lemoglobina viene sovrastimata con un aumento dellMCHC, 5) corpi di Heinz (gatto); queste particelle sono corpi densi che assorbono pi luce, di conseguenza vi sar una sovrastima dellemoglobina con aumento dellMCHC. CHCM: MCHC si ottiene misurando lemoglobina con il laser. Misurando lemoglobina con il laser si ha che la diffrazione del raggio proporzionale alla densit dei globuli rossi e dunque alla quantit di emoglobina. Non subisce interferenze.

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RDW: Red Distribution Weight Misurazione dellampiezza di distribuzione delle dimensioni eritrocitarie. La distribuzione delle dimensioni eritrocitarie allinterno della popolazione dei globuli rossi segue una gaussiana, di cui lRDW rappresenta la base, cio la differenza tra le dimensioni. Questo parametro ci fornisce lanisocitosi eritrocitaria misurata dallo strumento. Un aumento dellRDW indica degli eritrociti con diametro molto diverso. Una diminuzione dellRDW indica degli eritrociti con diametro molto simile (questo parametro non patologico). NRBC: Nucleated Red Blood Cells N di eritrociti nucleati La presenza di globuli rossi nucleati genera un artefatto in quanto queste cellule non sono sensibili alla sostanza lisante dei normali GB, di conseguenza si avr una sovrastima dei globuli bianchi. Il numero dei GRn viene determinato durante losservazione del vetrino e se essi sono in percentuale maggiore del 5% (5% GRn contati su 100 GB) si applica una formula matematica correttiva che annulla linterferenza dei GRn sui GB. Situazioni che danno eritrociti nucleati: 1) anemia rigenerativa; 2) avvelenamento da piombo; 3) rottura della barriera ematomidollare; 4) iposplenismo.

VELOCIT DI ERITROSEDIMENTAZIONE (VES)E la velocit di sedimentazione eritrocitaria ed un indice aspecifico di malattia. Si misura in un tubo di vetro contenente sangue + citrato di sodio al 3,8% in rapporto 4:1: posto lo strumento in posizione verticale si osserva la sedimentazione dei globuli rossi che viene valutata dopo 1 ora (mm/h), cio il tempo necessario per la separazione della fasi plasmatici/eritrocitaria. La VES segue la legge di Stokes secondo la quale:

VES = 2 R2 (d1-d2) g 9dove: R = raggio delle particelle disperse, cio il raggio delle sferette; d1 - d2 = densit della fase interna - densit della fase esterna, cio differenza tra densit delle sferette e densit del mezzo; g = accelerazione di gravit; = viscosit della fase continua. La VES direttamente proporzionale alla massa ed inversamente proporzionale alla densit/viscosit del mezzo. I globuli rossi sono dotati di cariche negative sulla membrana per cui si respingono tra loro e durante la precipitazione sono impediti dai loro stessi urti.

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Nelle infiammazioni queste cariche vengono mascherate da proteine la cui azione tanto pi forte quanto pi sono asimmetriche ( e globulina, fibrinogeno che globulina prodotte dal fegato). Ne consegue che in elevata VES, perch i globuli rossi liberati dalle cariche che li tengono separati si aggregano formando i rouleaux, che aumentano cos la loro massa e perci la VES. Unelevata VES indica disprotidemia (per elevati e globulina, fibrinogeno) mentre le albumine non provocano nessuna alterazione della VES perch sono simmetriche. La VES aumenta anche in caso di anemia perch ci sono meno globuli rossi; esistono tabelle che in base allHCT (ematocrito) indicano la VES attesa (quella normale di 2-4 mm/h), con questo dato stata aggiunta: VES CORRETTA = VES MISURATA VES ATTESA Anemia microcitica: HCT sottostimato globuli rossi sono pi piccoli ( un artefatto). VES attesa maggiore perch i

VES DIFASICA: esiste una fase intermedia in cui si forma un anello rosato (reticolociti + globuli rossi immaturi che hanno minor VES, detti eritroblasti) tra la fase plasmatici e la fase cellulare. In caso di: - anemia rigenerativa, - emolisi, - lipidemia, - bilirubinemia. Anemia rigenerativa: spesso la VES difasica indice di rigenerazione di tipo aspecifico. E utile nel diagnosticare unemorragia interna perch altrimenti per rilevarla attraverso un emogramma devo aspettare 24-48 ore che si ripristini la normovolemia per notare lanemia emorragica. A volte pu capitare di avere una VES difasica ma di non trovare reticolociti nella conta: una forma intermedia (ancora in fase di studio) collocata tra i reticolociti e i globuli rossi maturi e pu essere indice attendibile di rigenerazione nel caso in cui non vi siano ancora i reticolociti, dato che il loro picco dopo 3-5 giorni. Emolisi: VES difasica + plasma color rosso chiaro, inoltre la VES elevata (anemia emolitica); se in parte il plasma anche giallo allora si in presenza di ittero pre-epatico secondario. Lipidemia: VES difasica + fase fase plasmatica lattescente. Bilirubinemia: VES difasica + plasma color giallo senza ancora esistenza di ittero. Nel cavallo la VES non pu essere usata perch elevatissima e i globuli rossi precipitano in massa in pochi minuti, nel cavallo si ricorre alla misurazione del fibrinogeno. Stima quantitativa dei globuli bianchi

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I globuli bianchi e le piastrine nella VES si posizionano tra la fase cellulare e la fase liquida, si forma cos una colonnina che ci permette di valutare la quantit di globuli bianchi: nel primo millimetro nei millimetri seguenti 10.000 GB/microlitri 1.000 GB/microlitri

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ALTERAZIONI ERITROCITARIE QUALITATIVE O MORFOLOGICHE REPERIBILI ALLESAME MICROSCOPICO

FASE PREANALITICA: PREPARAZIONE DEL VETRINO Materia - Per la raccolta del campione servono due vetrini che presentino una sabbiatura sul lato per scrivere a matita il codice del campione e/o il nome del cane o del proprietario per poter sempre verificare lappartenenza del campione, e che siano puliti e molati (con angoli arrotondati). Queste caratteristiche sono indispensabili per eseguire strisci omogenei. I vetrini vanno toccati solo sulla parte sabbiata perch il grasso presente sulle mani potrebbe impedire laderenza al vetrino delle cellule del sangue, vanno tirati fuori dalla scatola solo appena prima di essere usati e vanno appoggiati solo su superfici pulite per evitare inquinamenti. Prelievo del campione - Per il prelievo del campione si possono seguire due procedure. La prima prevede di depositare una goccia di sangue direttamente dalla siringa con cui stato effettuato il prelievo sul vetrino. Questa procedura la migliore perch il sangue fresco non prevede lutilizzo di anticoagulante e riduce il rischio di artefatti, ma una procedura poco usata. La seconda procedura la pi usata e prevede lutilizzo di una goccia del sangue preparato per lemocromo, che contiene K2 o K3 EDTA come anticoagulante (complessa il calcio rendendo il sangue incoagulabile), prelevata con una provetta Pasteur. La goccia viene posta a sinistra del vetrino poi si pone il bordo del secondo vetrino al centro del primo in modo che formi un angolo di 45 con la parte sinistra del primo vetrino, a questo punto si sposta il secondo vetrino a sinistra fino alla goccia di sangue che si allunga per capillarit lungo il bordo del secondo vetrino infine si sposta velocemente il secondo vetrino verso destra in modo da distribuire il sangue lungo il primo vetrino. In questo modo avviene una distensione della goccia di sangue sul vetrino, la parte rosata che si vede sul vetrino prende il nome di striscio di sangue. Il vetrino presenta una testa (zona dove era posta la goccia), un corpo (zona centrale) e una coda (zona terminale dello striscio che se posta controluce prima della colorazione presenta dei riflessi arcobaleno). Nel cane la valutazione morfologica va eseguita nella coda, perch solo in questa zona gli eritrociti si dispongono in monostrato e sono separati tra loro da una zona bianca, e il dettaglio morfologico di ottimo livello. Gli eritrociti del cane sono pi grandi di quelli del gatto e presentano un pallore centrale pi pronunciato dovuto alla forma biconcava, quelli del gatto infatti presentano una zona pallida molto esigua o assente. A questo punto bisogna lasciare essiccare il vetrino per alcuni minuti, ed una volta che il vetrino si asciugato si pu procedere alla colorazione manuale o mediante coloratrice automatica. Nella coloratrice automatica i vetrini vengono posti in una centrifuga allinterno della quale vengono nebulizzati i coloranti ematologici prescelti, dopodiche i vetrini vengono lasciati asciugare e infine possono essere visti al microscopio.

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ALTERAZIONII tipi di anomalie riscontrabili sono anomalie di 5 tipi: distribuzione, dimensione, di affinit tintoriali o cromatiche, forma e inclusi eritrocitaria.

ALTERAZIONI DELLA DISTRIBUZIONE

Distribuzione fisiologica o normale: distribuzione uniforme in monostrato dei globuli rossi con una sovrapposizione del 10-50% nella zona ottimale di lettura. Distribuzione a roleaux: i globuli rossi si sovrappongono e si dispongono a formare delle pile di monete. I globuli rossi hanno un carica elettrostatica negativa sulla superficie che li tiene lontani tra loro e dalla parete del vaso, anchessa carica negativamente, durante linfiammazione vengono prodotte delle proteine infiammatorie (proteine della fase acuta) che annullano la carica negativa di globuli rossi che tendono ad aggregarsi e a formare i roleaux. Questa distribuzione quindi indice di infiammazione e analizza lo stesso parametro analizzato nella VES (velocit di eritrosedimentazione), entrambi gli esami forniscono informazioni aspecifiche. Agglutinati: tendenza a formare agglomerati voluminosi e irregolari, anche detta disposizione di eritrociti a grappolo. Si associa alla presenza nel sangue di anticorpi antieritrocita, che essendo polivalenti attaccano i globuli rossi uno allaltro in modo irregolare formando lagglutinato. Di solito indice di anemia emolitica immunomediata, a volte invece i roleaux si frammentano e si riassemblano sembrando degli agglutinati. Per risolvere eventuali dubbi sulla natura degli agglutinati si possono mescolare due gocce di fisiologica e una di sangue del paziente, prendo una goccia della miscela, la metto su un vetrino portaoggetti, ci metto un coprioggetti sopra e la guardo al microscopio a 40x. Se gli agglutinati erano dovuti alla rottura dei roleaux non si ripresentano dopo diluizione perch le proteine della fase acuta si diluiscono, se al contrario erano dovuti ad anemia emolitica immunomediata dato che gli anticorpi sono altamente specifici gli agglutinati si formano anche dopo diluizione.

ALTERAZIONI DI DIMENSIONENormociti: globuli rossi di dimensione normale. Nel cane si usa come riferimento la dimensione di un piccolo linfocita che costante pari a quella di un eritrocita normale. Nel gatto la valutazione pi difficile perch le dimensioni dei linfociti sono diverse da quelle degli eritrociti e variabili e di solito si fanno rilevazioni strumentali. Microciti: globuli rossi di dimensioni troppo piccole. La microcitosi pu essere dovuta a carenze di ferro, infatti i progenitori eritrocitari (eritroblasti) sono nucleati e si dividono10

numerose volte in cellule figlie che sono sempre pi piccole delle precedenti, quando la cellula matura vari segnali bloccano le divisioni e fanno espellere il nucleo dando vita alleritrocita maturo. Il segnale pi importante lemoglobinizzazione citoplasmatica, cio il raggiungimento di una quota ottimale di emoglobina nel citoplasma. Lemoglobina formata da uninsieme di 4 catene proteiche e ferro, in mancanza di ferro non avviene la produzione di emoglobina e lemoglobinizzazione e la cellula continua a dividersi, quando raggiunge dimensioni troppo ridotte estrude lo stesso il nucleo, ma il globulo rosso risulta pi piccolo del normale. Unaltra possibile causa lanemia da infiammazione cronica. I globuli bianchi presenti nel midollo osseo hanno riserve di ferro che cedono per la produzione di eritrociti, durante linfiammazione i mediatori dellinfiammazione (citochine interleuchine 1 e 6 e fattore necrosi tissutale ) bloccano questa cessione, dunque la mancata emoglobinizzazione dovuta non ad una carenza di ferro, ma al suo sequestro, il paziente non pu quindi utilizzare il ferro. Per verificare questa ipotesi si pu procedere con una colorazione del midollo con blu di Prussia che colora i depositi di ferro, se la diagnosi correta si riscontrer molto ferro nel midollo e microcitosi nel sangue. Unaltra causa sono le epatopatie, che operano mediante un meccanismo poco chiaro, forse dovuto ad una difettosa sintesi della catena globinica. Tra le malattie epatiche quelle che pi frequentemente presentano la microcitosi come segno clinico associato sono gli shunt porto-sistemici (anomalie vascolari porto-sistemiche in cui parte del sangue per delle anomalie sistemiche passa direttamente dalla vena porta alla vena cava senza passare dal fegato per essere depurato). La microcitosi pu inoltre essere un segno clinico di diseritropoiesi: il midollo affetto da patologie e presenta dei problemi di sviluppo, come mielodisplasia, causa la produzione di globuli rossi malformati e pi piccoli ed causata da malattie che colpiscono il midollo come la FeLV nel gatto e alcune patologie trasmesse dalla zecca al cane. Vanno inoltre ricordate le microcitosi di razza nei cani, alcune razze asiatiche tra cui la Akita Inu presentano microcitosi costituzionale, questa condizione non quindi patologica. Infatti non unalterazione funzionale ma solo morfologica.

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ALTERAZIONI DELLA DIMENSIONE

Macrociti: per valutare le dimensioni di un eritrocita, lo si pone in confronto con un piccolo linfocita. Nel caso della macrocitosi, leritrocita pi grande. In questo tipo di alterazione eritrocitaria rientra anche la Policromatofilia. I Policromatofili sono cellule eritrocitarie immature, pi grandi del normale. Cause cliniche:

Malassorbimento: un caso raro ma ben studiato. Esso si attua come meccanismo inverso della microcitosi: lemoglobinizzazione citoplasmatica segnala quando le divisioni cellulari devono cessare. Ma la duplicazione cellulare necessita anche di vitamina B12 ed acido folico: se c malassorbimento, la carenza di questi ormoni provoca difficolt nella divisione nucleare e questi vengono estrusi senza che la cellula formatasi sia matura. Questa causa piuttosto rara nel cane; nello Schnauzer Gigante si ha spesso macrocitosi per una causa simile a quella della Malattia di Hirsung nelluomo, cio il malassorbimento di vitamina B12 nellileo. Chemioterapia per la cura delle neoplasie: d macrocitosi con un meccanismo di natura specifica, cio mediante un meccanismo diretto, ma anche mediante un meccanismo indiretto. Il Metotrexate, infatti, agisce come antagonista dei folati, provocandone una carenza; la carenza di folati per strettamente legata a quella della vitamina B12, e si ha il quadro clinico descritto precedentemente. Il meccanismo diretto, invece, viene attuato da farmaci Antiblastici, cio antimitotici, che inibiscono la mitosi non solo delle cellule neoplastiche, ma anche di tutte le altre, cellule del sangue comprese. Anticonvulsivanti. Sindromi mielodisplastiche: sono patologie midollari date da molte condizioni cliniche (retrovirosi nel gatto, malattie da zecche nel cane). I chemioterapici danno delle forme di mielodisplasia. La mielodisplasia pu evolvere a leucemia, ma pi frequentemente sintomo di determinate infezioni, come la retrovirosi nel gatto. Razza: il Barboncino Toy ha delle modificazioni displasiche eritroidi (come inclusi nucleari) che fanno sembrare che lanimale possa sviluppare la leucemia entro breve.

Anisocitosi: Variazione dimensionale dei globuli rossi. Pu essere valutata con dei + a seconda di quanto siano diverse tra loro le dimensioni delle cellule. Lanisocitosi la commistione di cellule di grandi e piccole dimensioni. Cause cliniche: Le medesime di macrocitosi e microcitosi. Anemie rigenerative: emolitiche ed emorragiche. Dopo questi fenomeni, il midollo produce globuli rossi per compensare, e questi eritrociti saranno giovani (policromatofili).

ALTERAZIONI CROMATICHE O DELLAFFINIT TINTORIALE12

Gli eritrociti che possiamo vedere in uno striscio di sangue possono essere classificati, sulla base delle loro affinit tintoriali, in: normocromici, policromatofili, ipocromici e ipercromici. Normocromici: hanno normale affinit tintoriale. La cromia data dallemoglobina che si pone nella parte periferica del disco, lasciando al centro un alone pallido dovuto alla sua assenza. Policromatofili: si riconoscono per le dimensioni maggiori rispetto agli eritrociti normali e per il colore blu o grigio. In linea generale, un policromatofilo impiega comunque 24-36 ore per diventare un eritrocita maturo. Il colore blu dato dalla presenza del RER che viene usato per la sintesi proteica, cio per la sintesi dellemoglobina. E ovvio che mantenendo ancora le vestigia di una cellula immatura ed avendo ancora unelevata quantit di RER ha alta affinit per i coloranti basici. Normalmente sono presenti in bassa percentuale nei nostri animali (nel cane 1%, nel gatto 0,04%, assenti nel cavallo). Se il paziente presenta una quantit elevata di policromatofili nellemogramma significa che soggetto ad anemia emolitica o emorragica (rigenerative). Ipocromici: hanno poca affinit tintoriale e quindi il pallore si presenta esteso. La cromia proporzionale alla quantit di emoglobina. Lemoglobina poca e se lipocromia spiccata sintomo di carenza di ferro. Se invece il pallore meno spiccato ci si pu trovare di fronte ad un caso di epatopatia o ad una anemia da malattia cronica. Ipercromici: lipercromia un artefatto. Infatti, non possibile avere pi emoglobina di quanta non ce ne sia gi nel globulo rosso, perch la quantit dellemoglobina in condizione prossime alla precipitazione. Lartefatto dato dalla forma sferica del globulo rosso, cio dalla perdita del pallore centrale; questa condizione di Sferocitosi data dal fatto che la cellula ha perso la membrana (per un macrofago che lha fagocitata in parte a seguito di una anemia emolitica immunomediata). Il globulo rosso, per mantenere il suo volume, assume cos una forma sferica.

ALTERAZIONI DELLA FORMA

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Echinocitosi: il globulo rosso presenta delle spicolature a base stretta e punta appuntita. Gli echinociti sono degli artefatti dati dal K3 EDTA e dipendenti dal tempo in cui il sangue ha stazionato nella provetta. Ma ci sono anche altre cause, come: Tumori linfoidi Doxorubicina nel cavallo Glomerulonefriti e deplezione di elettroliti (rare) Acantocitosi: gli acantociti assomigliano agli echinociti, ma le spicolature si presentano con base larga e punta tozza, a dente di sega. La causa principale solitamente quella epatica, in quanto la membrana dei globuli rossi si presenta instabile ed il contenuto lipoproteico variato. Altre cause sono: DIC: a causa degli urti degli eritrociti con i coaguli Linfoma Emangiosarcoma: tumore vascolare di origine splenica Glomerulonefrite Codocitosi: i codociti sono anche chiamati Target Cells per la presenza al centro dellalone pallido di un ulteriore alone scuro. Questo dato da un ripiegamento di membrana ed spesso associato a malattie epatobiliari, come le anomalie vascolari portosistemiche. Oltre a queste, vi sono altre cause: Anemia ferropriva Emangiosarcoma Glomerulonefrite Stomatocitosi: il pallore centrale ha forma di bocca. una condizione spesso ereditaria, tipica degli Alaskan Malamute. La forma acquisita invece poco descritta: sarebbe una condizione preemolitica che nelluomo associata al pH ematico, mentre negli animali no. Si pensa possa essere associato a malattie trasmesse da zecche o ad anemia emolitica. Cheratocitosi: sembrano degli sferociti, ma presenta un vacuolo che si rompe alla periferia dando una forma a due corna. un danno ossidativo a carico della membrana del globulo rosso. Le cause sono: Insufficienza cardiaca congestizia Glomerulonefrite Doxorubicina Anemia ferropriva Emangiosarcoma Mielofibrosi Eccentrocitosi: leccentrocita un globulo rosso in cui vi stata una fusione dei due lembi della membrana. Larea di fusione appare pallida, mentre scompare lalone pallido al centro. Il pallore allora periferico ed a forma di semiluna. Le cause sono:14

Avvelenamento da cipolle, che provoca morte per emolisi Vitamina K, ma si dimostrato che non provoca eccentrocitosi Antidolorifici Anestetici Zinco Naftalina Acetilfenilidrozina Ipertiroidismo Diabete mellito Linfomi T Benzocaina Propofol Rodenticidi

Schistocitosi: lo schistoci ta un frammento eritrocitario. Sono eritrociti che si sono rotti; questa rottura pu essere dovuta a: - coaugulazione intravasale disseminata (DIC) cronica o compensata. Il fenomeno di rottura dei globuli rossi avviene per traumatismo multiplo. Leritrocita passa attraverso una maglia di fibrina subendo degli urti che alla fine portano alla rottura delleritrocita stesso. - protesi valvolare. Evento ben descritto in medicina umana quando viene sostituita una protesi valvolare cardiaca con delle protesi metalliche. Lerotrocita urtando queste protesi metalliche subisce un trauma e quindi si nota la schistocitosi. - mielofibrosi. Questa in realt non una vera e propria malattia, ma una condizione clinica terminale del midollo. Esso infatti, subendo degli insulti, si trasforma in tessuto connettivale. La cellula eritrocitaria matura, che dal midollo deve passare al comparto vascolare, trova delle difficolt e quindi subisce dei danni. - alterazioni del microcircolo. Possono essere vasculiti, torsioni dorgano (come ad esempio la torsione splenica e/o quella mesenterica), comunque tutte quelle situazioni nelle quali la vascolarizzazione viene profondamente alterata. Elliptocitosi: globuli rossi a forma di sigaro. Le cause pi frequenti sono malattie midollari. Solitamente, nel gatto lelliptocitosi associata a patologie anche lievi, mentre nel cane legata a patologie pi severe del midollo. Dacriocitosi: globuli rossi a forma di lacrima. Hanno la stessa causa degli elliptociti. Ma pu anche essere un artefatto dovuto ad eccessiva forza nel compiere lo striscio; in questo caso le punte dei dacriociti hanno tutte lo stesso verso. Sferocitosi: lo sferocita ci che resta del globulo rosso dopo lattacco macrofagico, per la presenza di autoanticorpi. Non vi relazione tra la quantit di sferociti e la gravit dellanemia emolitica immunomediata, anche perch lo sferocita un residuo di globulo rosso e non possiamo sapere quanti siano quelli fagocitati per intero.

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Selenocitosi: ( Ghost cells ) il selenocita il globulo rosso fantasma. dovuto allaggressione da parte di autoanticorpi sulle pompe di membrana. In questo modo la cellula si svuota. un sintomo dellanemia emolitica immunomediata; questa patologia si divide in intravascolare ed in extravascolare. La prima d mortalit elevata ed caratterizzata dalla presenza in circolo di frammenti eritrocitari che continuano a stimolare il sistema immunitario. La seconda condizione invece caratterizzato dalla totale fagocitosi e digestione delleritrocita da parte del macrofago. Drepanocitosi: deriva da una alterazione emoglobinica (di solito una sostituzione di aminoacidi); questa perde solubilit e precipita dando una deformazione ai globuli rossi. Cristalli di emoglobina: rettangolari, sono artefatti. Cristalli di hb: fra gli eritrociti si possono trovare dei rettangoli che sono delle precipitazioni di hb. Sono degli artefatti. Non hanno alcun significato a livello diagnostico.

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ALTERAZIONI DEI CORPI INCLUSI

Corpi di Howell Jolly: si presentano come frammenti tondeggianti, di aspetto basofilo, e rappresentano dei residui nucleari. Leritrocita, infatti, nelle fasi iniziali della loro vita sono nucleati e il fatto che questi inclusi siano vestigia del nucleo provato anche dal fatto che vengono facilmente trovati in elementi policromatofilici, cio eritrociti giovani. Le cellule che presentano i corpi di Howell Jolly sono pertanto elementi giovani. I corpi di Howell Jolly hanno significato diverso a seconda che il paziente sia un cane o un gatto. Nel cane, in genere, si trovano raramente poich, a livello midollare, la barriera emato midollare compie una selezione su quelle cellule che andranno ad accedere al sangue periferico e va ad escludere quelle dotate di nucleo o residui di esso. Se quindi si trova un corpo di Howell Jolly in uno striscio di sangue periferico, esso va interpretato come un evento occasionale; un altro motivo per cui cellule dotate di Corpi di Howell Jolly sono molto rare nel sangue periferico che quando queste si trovano a livello dei sinusoidi splenici ed epatici, i macrofagi li scambiano per eritrociti senescenti, poich il residuo del nucleo d una certa rigidit alla struttura membranosa della cellula, e li rimuovono. Le condizioni cliniche che si associano alla comparsa dei corpi di Howell Jolly sono piuttosto numerose: 1. in caso di anemia emolitica o emorragica, che portano ad una risposta compensatoria del midollo che produce un maggior numero di eritrociti. Il midollo, per far fronte a questa richiesta, diventa iperplastico e sottopone la barriera ematomidollare ad una sorta di stress da selezione; poich la barriera commette sempre un minimo di errori, pi elevata la quantit di cellule che deve selezionare, pi elevato lerrore. Ecco che nelle anemie rigenerative non infrequente trovare elementi eritrocitari con corpi di Howell Jolly. 2. alterazioni della barriera ematomidollare. Si hanno a quelle condizioni cliniche associate a patologie intramidollari, come leucemie, tumori metastatici al midollo, intossicazioni da piombo. 3. splenectomia. La milza funge da filtro, in aggiunta alla barriera ematomidollare, nelleliminazione delle cellule con corpi di Howell Jolly; se essa viene meno, magari perch viene asportata per vari motivi (torsione splenica, emangiosarcoma splenico), le cellule con corpi di Howell Jolly saranno destinati ad incrementare il loro numero nel tempo, perch viene a mancare il filtro a livello periferico. Questa situazione associata non solo alla rimozione della milza, ma anche allinteressamento della stessa da parte di tumori piuttosto devastanti, che occupano gran parte della milza; la parte rimanente sana non in grado da sola di svolgere appieno la funzione per cui preposta. Questa condizione viene definita iposplenismo. Liposplenismo si pu avere anche a seguito di terapie immunosoppressive, come chemioterapie o cortisonici, o a seguito di patologie endocrine caratterizzate da iperproduzione di cortisonici, come la sindrome di Cushing; queste situazioni vanno a ridurre lattivit macrofagica splenica e quindi a ridurre lazione del filtro splenico. 4. ematopoiesi extramidollare. Nelladulto, lematopoiesi viene svolta esclusivamente dal midollo osseo; con lavanzare dellet, le sedi ematopoietiche si riducono e si17

localizzano nelle estremit prossimali delle ossa lunghe e nello scheletro assiale. Nei soggetti in fase fetale o embrionale, questa attivit viene svolta anche da milza e fegato; le cellule staminali restano in questi organi anche nelladulto, e non solo in questi (anche nellintestino, nelle surrenali; lematopoiesi pu avvenire in qualsiasi sede anatomica) e possono attivarsi dando una ematopoiesi extramidollare. Non un evento raro e gli organi pi colpiti sono il fegato e la milza. Lematopoiesi extramidollare si pu avere anche allinterno di tumori, come lemangiosarcoma splenico. I corpi di Howell Jolly si formano perch si viene a riprodurre il microambiente midollare, ma non la barriera ematomidollare; quindi, le cellule immature accedono direttamente al sangue periferico senza nessuno che le controlli. Nel sangue periferico si possono osservare anche delle cellule dotate di inclusi molto simili ai corpi di Howell Jolly, ma molto pi grandi; queste cellule sono chiamate eritroblasti e lincluso che contengono il nucleo intero, e non solo una vestigia di esso. Il significato clinico di queste cellule del tutto sovrapponibile a quello dei corpi di Howell Jolly, con la sola differenza che queste indicano un grado di severit maggiore. Esistono per alcune razze di cani, come lo Schnauzer Nano e il bassotto tedesco, che hanno un certo numero di eritroblasti circolanti fisiologicamente. Si possono avere corpi di Howell Jolly multipli, di dimensioni eterogenee e presenti in cellule eritroidi non caratterizzate da segni di immaturit (come la basofilia, ad esempio). Quando si trova questespressione, i copri di Howell Jolly andranno interpretati come anomalie maturative, quindi displasia eritroide, o mielodisplasia. Questa situazione normale nel Barboncino Toy. Punteggiature basofiliche: accumuli di RNA che testimoniano lattivit della cellula, e quindi anche la giovinezza. Nel cane sono spesso espressione di rigenerazione anomala, cio del fatto che la patologia che ha provocato la rigenerazione sta anche influenzando anche il midollo; nel gatto e nel bovino ha significato esclusivamente rigenerativo. Corpi di Heinz: aree pallide e ben delimitate, anche alla periferia delleritrocita, che sono lespressione di un processo ossidativo che ha colpito lemoglobina denaturandola e facendola precipitare. Questo evento pi frequente nel gatto perch questa specie ha una quantit di gruppi sulfidrilici molto pi elevata del cane, il rapporto 8:2, ed i gruppi sulfidrilici sono quelli maggiormente esposti a fenomeni ossidativi. Si pu anche dire che questi corpi sono normalmente presenti nel gatto. Quando li si osserva, sarebbe opportuno sottoporre il sangue ad una colorazione specifica, che quella usata anche per i reticolociti, cio il nuovo blu di metilene, che colora lemoglobina denaturata. Le condizioni cliniche che provocano i corpi di Heinz sono le stesse che provocano leccentrocitosi. La differenza sta nel fatto che lossidazione dei gruppi sulfidrilici a carico della membrana, se parliamo di eccentrocitosi, mentre a carico dellemoglobina nel caso dei corpi di Heinz; non quindi infrequente trovare cani che abbiano sia i corpi di Heinz che gli eccentrociti. La vitamina K non d eccentrocitosi, anche se in letteratura indicata come possibile causa. Il gatto ha una milza non sinusoidale e quindi viene meno quella funzione di filtro che essa ha nel cane e nelluomo; se si trovano sporadici eritroblasti, o corpi di Howell Jolly, o corpi di Heinz, normale perch viene meno la funzione selettiva che lorgano svolge.

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Babesiosi:d inclusi piriformi, di colore variegato. Laspetto piriforme tipico della babesia matura e lo ritroviamo allinterno degli eritrociti, ma, avendo diversi stadi evolutivi, possibile trovare anche il parassita sottoforma di tachizoita, di forma diversa. Inclusi da Emobartonella Felis: inclusi basofilici disposti per lo pi in periferia, che possono anche riempire la cellula. molto frequente nel gatto e causa anemia emolitica immunomediata. Il corrispettivo nel cane molto raro e si chiama Emobartonella Canis; associato a soggetti splenectomizzati o immunodepressi. Corpi inclusi da Cimurro: inclusi di colore rosso, di dimensioni elevate. poco frequente e, se lo si trova, possibile fare immediatamente la diagnosi. Questi inclusi virali hanno la tendenza a porsi negli elementi immaturi. Inclusi da Toxoplasma Gondii: per lo pi negli eritrociti, ma a livello di midollo si possono localizzare anche negli elementi immaturi o possono essere presenti al di fuori delle cellule, liberi nel midollo. La morfologia non ci permette una diagnosi immediata, ma solo un sospetto da confermare o smentire mediante un sierologico o PCR; infatti molto simile a Neospora Caninum.

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ALTERAZIONI QUALITATIVE LEUCOCITARIE

I neutrofili sono la prima linea di difesa aspecifica dellorganismo. Appaiono come elementi tondeggianti, con citoplasma neutro basofilico, con granuli molto poco visibili ed i nuclei hanno due o tre sepimentazioni. Le sepimentazioni vanno da un numero minimo di uno ad un massimo di cinque e sono legate allet della cellula: una giovane ha poche sepimentazioni, una vecchia ne ha molte. Un neutrofilo vive circa 7 ore nel sangue periferico e vive per svolgere funzione difensiva soprattutto nel tratto GI e nel tratto respiratorio. Questi sono luoghi conosciuti come sedi di contaminazione batterica. Nel sangue periferico si possono trovare neutrofili giovani, cio con nucleo non sepimentato, a forma di ferro di cavallo; queste cellule prendono il nome di neutrofili banda. Nei soggetti normali, la loro quantit estremamente esigua; la quantit massima tollerata di 300 per microlitro. Quando le troviamo, sappiamo che sono appena state immesse dal midollo. I linfociti sono le cellule immunitarie per eccellenza e non si conosce la loro vita media, comprendendo questa famiglia un gran numero di popolazioni leucocitarie che svolgono anche funzioni diverse. Dal punto di vista morfologico si dividono in due grandi e piccoli; quelli piccoli sono tondeggianti, con nucleo denso e circolare. I monociti sono cellule estremamente voluminose, con citoplasma moderatamente basofilico e sovente vacuolizzato; il nucleo sepimentato ed irregolare. La dimensione elevata, ma non reale, perch il monocita ha un certo tropismo per il vetro e quando si va a strisciare il vetrino esso si stende di pi e sembra pi grande. Ha funzioni di difesa soprattutto di eliminazione dei detriti successivi a processi flogistici. Gli eosinofili appartengono alla famiglia dei granulociti e si contraddistinguono per avere granuli eosinofilici sparsi nel citoplasma ed alternati con piccoli vacuoli. Nel gatto la morfologia diversa perch i granuli sono di aspetto pulverulento e non molto definiti come nel cane; questo un buon metodo discriminante se si hanno dei dubbi che il sangue che si sta osservando di cane o di gatto. Queste cellule intervengono nei processi allergici e parassitari, incrementandosi. I basofili sono cellule rare da osservare, nel cane pi che nel gatto. Nel cane hanno dimensioni cospicue, citoplasma basofilico con piccoli granuli di colore violaceo o nero; nel gatto le dimensioni sono pi ridotte, nucleo simile a quello di un neutrofilo ed il citoplasma infarcito di questi granuli color lavanda. Nel cane i granuli sono molto pi piccoli e sporadici. Anche i basofili, come gli eosinofili, intervengono nei processi allergici e parassitari, incrementandosi in queste specifiche situazioni.

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ALTERAZIONI NEUTROFILICHESi distinguono alterazioni relative a: et tossicit inclusi di sviluppo, o displastiche Le alterazioni relative allet prendono il nome di deviazione a sinistra o a destra. Il nucleo con poche sepimentazioni indica un neutrofilo giovane e si parla di deviazione a sinistra; quando ha pi di tre lobatura si parla di deviazione a destra. La deviazione a sinistra indica un processo infiammatorio perch, evidentemente, al midollo sono arrivate delle citochine infiammatorie che hanno richiesto un gran numero di globuli bianchi; non avendo il midollo a disposizione molti neutrofili maturi, ha dovuto rilasciare anche quelli immaturi. La deviazione a destra indica che la cellula sopravvissuta nel sangue periferico per un numero eccessivo di ore; questa condizione si associa ai corticosteroidi, che tendono ad inibire la fuoriuscita dei neutrofili per diapedesi dal comparto vascolare. Inibendo questo processo, le cellule sono costrette a rimanervi per un numero maggiore di ore, invecchiando. Le alterazioni relative alla tossicit si possono esprimere in diversi modi; la forma pi lieve e frequente data dai corpi di Dohle, inclusi citoplasmatici fortemente basofilici. Essi sono degli ammassi di RER e testimoniano che la cellula neutrofilica in forte attivit di sintesi proteica. quindi sinonimo di infiammazione, come la deviazione a sinistra e gli eritrociti disposti a pile di monete. Un altro livello di tossicit dato dalla basofilia citoplasmatica; il citoplasma tende al blu e non alla neutralit. Indica flogosi ed pi grave dei corpi di Dohle. La presenza di citoplasma con aspetto schiumoso indica un altro grado di tossicit. Un altro grado di tossicit, pi elevato, la vacuolizzazione. Nelluomo si notano, normalmente, dei granuli neutri; nel cane e nel gatto essi sono per sintomo di tossicit. Le alterazioni neutrofiliche da inclusi: Epatozoon Canis: malattia parassitaria Erlichia Granulocitaria (Anaplasma Fagocitofila): malattia infettiva trasmessa da zecche Cimurro: inclusi eosinofilici di dimensioni diverse. Colpisce diversi tipi di cellule: neutrofili, eritrociti, monociti, linfociti, piastrine Toxoplasma Gondii: pu infettare sia i globuli rossi che i globuli bianchi Emosiderina: inclusi di dimensione variegata, di aspetto bruno verdastro. un evento piuttosto raro ed indica che il neutrofilo ha fagocitato degli eritrociti, essendo lemosiderina il prodotto di degradazione dellemoglobina. Pu essere associata ad anisocitosi con presenza di policromatofili. Il midollo allora stato stimolato, e la stimolazione si ha principalmente in caso di anemie emolitiche immunomediata.

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Le alterazioni displastiche si possono presentare come alterazioni ai danni del nucleo; quando questo si presenta a forma di anello sintomo di una mielodisplasia o una leucemia, cio di una malattia midollare. Elementi di questo tipo si possono trovare nel midollo, ma mai nel sangue periferico. Unaltra alterazione una mancata sepimentazione del nucleo (carattere tipico delle cellule giovani) associata ad una spiccata densit cromatinica (carattere tipico delle cellule vecchie): in pratica, c una asincronia tra laspetto morfologico del nucleo e la densit della cromatina. Questa situazione tipica della Malattia di Pelger Huet, che colpisce in particolare il cane australiano; una anomalia erediataria che non comporta alcun disturbo per il paziente. Questa aberrazione nucleare coinvolge tutti gli elementi leucocitari. Quando si trovano queste cellule si parla di cellule pelgheroidi, ad indicare una somiglianza con quelle della patologia sopra citata, ed in genere si in presenza di una mielodisplasia. Unaltra alterazione displastica la macropolicitosi: gli elementi neutrofilici sono plurisegmentati e giganti e sono detti macropoliciti. Indica una displasia midollare, cio una malattia al midollo.

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ALTERAZIONI LINFOCITARIELe alterazioni che colpiscono i linfociti si dividono principalmente in due categorie: Alterazioni da reattivit Alterazioni da atipia La distinzione avrebbe come target quello di differenziare due grossi capitoli della medicina: le alterazioni da reattivit sono in genere associati ad una stimolazione antigenica, cio infezioni, mentre quelle da atipia sono associati a disturbi linfoproliferativi, cio tumorali. Dal punto di vista morfologico, sono due situazioni difficilmente differenziabili. Le alterazioni da reattivit sono alterazioni citoplasmatiche, mentre quelle da atipia sono esclusivamente nucleari. Le modificazioni citoplasmatiche sono di quattro tipi: Linfocita attivato: citoplasma molto ampio, in quanto viene usato molto citoplasma per produrre anticorpi Basofilia citoplasmatica: associata alla quantita di rRNA preposto alla sintesi proteica, e quindi immunoglobulinica Vacuolizzazione citoplasmatica: i vacuoli indicano modificazioni cistiche del RER, secondarie alla forte attivit Granuli azurofili: si trovano nei linfociti immunologicamente stimolati. Hanno questo nome per la loro affinit con il colorante Azur. Le modificazioni di questo tipo sono presenti in soggetti con infezioni o appena vaccinato. Le alterazioni da atipia sono generalmente orientate verso il processo neoplastico o proliferativo. Sono di due tipi: la clivatura nucleare: i nuclei sono incisi, non tondeggianti. una condizione associata a processi proliferativi, cio a linfomi, ad esempio. Ma possibile avere queste modificazioni in campioni che sono rimasti troppo in provetta. il nucleolo: proietta verso un processo proliferativo. Il linfocita reattivo e quello atipico si trovano frequentemente assieme, come nel caso della piometra; questo perch la condizione di sepsi e di stimolazione immunitaria tipica di questa malattia d un forte coinvolgimento immunitario, tale che i linfonodi cominciano a spruzzare di tutto nel sangue periferico. Per capire se si di fronte ad una linfocitosi reattiva o atipica si valuta quali elementi sono maggiormente espressi: difficile che i due elementi siano presenti in percentuali identiche, ma spesso nella piometra, ad esempio, si trovano quattro + di linfociti reattivi ed uno solo per gli atipici. Questo testimonia che lelemento predominante la reattivit.

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ALTERAZIONI MONOCITARIELe alterazioni monocitarie sono di tre tipi: Da attivazione Da inclusi Displastiche I monociti attivati sono monociti che presentano una vacuolizzazione citoplasmatica molto ampia; il vacuolo infatti in diretta connessione con lattivit che quella cellula svolge. La causa dellattivazione pu essere molteplice, ad esempio una babesiosi. Gli inclusi monocitari sono dati da parassiti, come lEpatozoon, che abita sia nel neutrofilo che nel monocita. Vi sono poi gli inclusi da emosiderina. Un altro tipo di inclusi quella da emosiderina; nel neutrofilo piuttosto rara, ma nel monocita pi frequente. sintomo del fatto che il monocita ha fagocitato almeno un globulo rosso. Le alterazioni displastiche sono tipiche delle leucemie.

ALTERAZIONI EOSINOFILICHEEsistono due tipi di alterazioni eosinofiliche: Da attivazione Displastiche Lattivazione delleosinofilo caratterizzata dalla perdita dei classici granuli eosinofilici e da una maggiore evidenziazione dei vacuoli citoplasmatici. Questo evento era pi frequente in passato nei soggetti malati di filariosi, che magari sviluppavano un trombo embolismo. Nei levrieri normale osservare, fisiologicamente, eosinofili dallaspetto attivato. Le alterazioni displastiche si traducono in una fusione di tutti i granuli eosinofilici a formare uno o pi grandi granuli; questo indice di una sofferenza o di una malattia midollari. Unaltra alterazione displastica data dai granuli che diventano pi sparuti e dal citoplasma che diventa basofilico; anche questo sintomo di una sofferenza midollare.

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LEUCOGRAMMILE ALTERAZIONI LEUCOCITARIE QUANTITATIVE Le popolazioni leucocitarie presenti nel sangue periferico sono 5: neutrofili, linfociti, basofili, eosinofili e monociti. Osservando un leucogramma nellesame emocromocitometrico, le quantit e i tipi di cellule presenti si possono modificare formando dei pattern, ovvero dei modelli di comportamento. Di tali modelli se ne possono riconoscere 5: Leucogramma da eccitazione Leucogramma da stress Leucogramma infiammatorio Leucogramma degenerativo Leucogramma neoplastico Se analizzando il leucogramma, che altro non che una parte dellesame emocromocitometrico, si nota che esso ricade in uno di questi 5 pattern, si in presenza di un paziente con una patologia. Leucogramma basale E il leucogramma osservabile nel paziente sano. I leucociti presenti nel sangue periferico, in questo caso, rappresentano circa l1,5% dei leucociti totali. Ci vuol dire che analizzando i globuli bianchi da un punto di vista quantitativo, si analizza solo una minima parte del mondo leucocitario. Il 90% della popolazione leucocitaria risiede infatti nel midollo, e non quindi esplorabile. Il 7% nei tessuti, ed costituita in prevalenza da neutrofili e linfociti che vanno ad espletare le funzioni di difesa, in prevalenza nel tratto respiratorio e nel tratto ureterico. Addirittura nel torrente periferico, ovvero nel torrente vascolare, in realt ci sono due componenti leucocitarie: una prende il nome di pool marginato, laltra invece prende il nome di pool circolante. Significa che dei leucociti che abitano allinterno dei vasi possibile esplorarne la met, perch laltra met adesa alla parete interna dei vasi e non possibile analizzarli con il prelievo del sangue. Tra cane e gatto esistono delle differenze nel mondo leucocitario; nel gatto infatti il rapporto tra il pool marginato e quello circolante molto pi elevato rispetto al cane. Arriva infatti a 2:1 o anche a 3:1. Quindi del gatto si esplora una porzione ancora pi piccola di leucociti. Ci fa capire come, quando si parla di leucogramma, in realt si parla solo di una piccola porzione dei leucociti totali. Leucogramma da eccitazione Denominato anche leucogramma da paura o fisiologico (questultimo termine per improprio). La patogenesi di questa modificazione leucocitaria ha delle basi endocrine. Quando un paziente si spaventa (e le cause della paura possono essere molteplici!) vengono infatti liberate in quantit elevata le catecolamine, in particolare ladrenalina e la noradrenalina. Queste hanno azione sui leucociti: la principale la riduzione del pool marginato con

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conseguente aumento del pool circolante. Le catecolamine quindi riducono la percentuale di leucociti adesi al comparto vascolare. Nel felino questo leucogramma ha maggiore impatto proprio a causa del rapporto elevato tra i due pool. Il gatto portato in ambulatorio e sottoposto ad una manipolazione per la visita clinica o per la raccolta del campione libera catecolamine creando il leucogramma da eccitazione. Ci nellemogramma si traduce con una serie di modificazioni che coinvolgono in via pi o meno importante tutte e 5 le popolazioni leucocitarie. La caratteristica saliente del leucogramma da eccitazione laumento dei neutrofili maturi. Ci perch sono questi ultimi ad essere marginati e pronti ad uscire per diapedesi dal sistema vascolare e ad espletare le loro funzioni. Quando il cane ed il gatto si spaventano liberano catecolmine e vanno a mobilitare il pool marginato. Inoltre anche la popolazione linfocitaria tende ad aumentare. La linfocitosi deriva da unazione di spremitura che le catecolamine esercitano a livello delle stazioni linfonodali, dalle quali fuoriescono i linfociti che arrivano allapparato circolatorio periferico attraverso il sistema linfatico. Si pu avere come altra caratteristica anche monocitosi e neutrofilia, sempre per il fatto che molte di queste cellule perdono adesione dalle pareti dei vasi. Gli eosinofili e i basofili invece tendono a diminuire perch le catecolamine hanno azione antianafilattica (sono antiallergici), quindi diminuiscono le cellule antagoniste. Anche somministrandole farmacologicamente gli eosinofili e i basofili vengono sequestrati a livello midollare, con diminuzione nel periferico. NB I linfociti presenti nei linfonodi non vengono considerati linfociti tessutali!! Questi vengono infatti considerati una popolazione ematologica perch si possono riscontrare nel sangue, ma effettivamente hanno ben poco a che fare con esso. Ci perch i linfociti usano il torrente circolatorio solo per navigare. Quindi nel 7% di leucociti presenti nei tessuti si intendono soprattutto i neutrofili ed i monoliti, le popolazioni pi rappresentate e che vanno poi ad esercitare lazione difensiva. Quindi in questo leucogramma la leucocitosi non deriva dalla liberazione dal midollo dei leucociti bens deriva dalla demarginazione di queste cellule dalle pareti dei vasi. Leucogramma da stress forse il leucogramma pi frequente. Anche in questo caso si ha come base patogenetica una base endocrina e ormonale e i mediatori principali sono i corticosteroidi. E cos frequente perch si riscontra ogniqualvolta il paziente si ammala o si traumatizza. I corticosteroidi hanno in pratica la stessa azione delle catecolamine perch anche in questo caso si riduce il pool marginato ed aumenta il pool circolante. Agiscono per anche a livello midollare, riducendo leggermente il pool midollare. Questultimo infatti suddiviso in pi compartimenti, ovvero:

Proliferativo, contenente gli elementi immaturi che vanno incontro a mitosi e mantengono la popolazione allinterno del midollo. Maturativo, che identifica quelle cellule (i mielociti, i metamielociti, i neutrofili banda tre livelli di maturazione diversa) che non possono pi moltiplicarsi per mitosi e che possono evolversi solo a neutrofilo maturo per entrare poi nel sangue periferico Di stoccaggio, il pi piccolo compartimento costituito da soli neutrofili maturi, ovvero quelli che sono destinati di l a breve ad entrare nel torrente periferico.

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Quando i corticosteroidi vengono liberati in quantit eccessiva vanno nel compartimento di stoccaggio e fanno liberare i neutrofili maturi che vi erano immagazzinati. Laumento dei leucociti registrato nel sangue periferico ha quindi una duplice origine: da una parte vi lalterazione del pool marginato e del pool circolante, dallaltra vi laumentata immissione di cellule mature dal midollo osseo. La caratteristica saliente la linfopenia. I corticosteroidi prodotti in eccesso infatti hanno azione sulle stazioni linfonodali contraria a quella delle catecolamine: bloccano il ricircolo dei linfociti. Quindi viene meno la quota di linfociti che da tali stazioni si riversa nel sangue periferico. Presenti comunque anche altre alterazioni, dette accessorie, meno importanti. Si ha infatti neutrofilia di tipo maturo, esattamente come nel leucogramma da eccitazione perch gli effetti dei corticosteroidi sul pool marginato sono gli stessi delle catecolamine. Stessa azione di queste ultime hanno anche sugli eosinofili (effetto antiallergico) con diminuzione di queste cellule circolanti che vengono bloccate nel midollo. Paradossalmente, somministrando steroidi ad un cane ed effettuando un prelievo midollare si noterebbe in questa sede un aumento di eosinofili. Altra caratteristica la monocitosi. Leucogramma infiammatorio Acuto Compare negli eventi di natura infiammatoria. Nei processi infiammatori infatti vengono liberate una serie di citochine e di mediatori della flogosi che, mediante la circolazione ematica, arrivano e livello midollare e stimolano la liberazione di neutrofili. Immediatamente si avr rilascio di neutrofili di tipo maturo dal compartimento di stoccaggio perch tali cellule hanno attitudini difensive molto spiccate; la maturazione determinata dalla lobatura nucleare, il che gli consente di essere estremamente deformabili e di passare attraverso vasi e capillari molto esigui, arrivando a siti difficilmente raggiungibili da altre cellule. Il neutrofilo immaturo, con nucleo non segmentato, una cellula pi rigida e ha difficolt a raggiungere i siti infiammatori. Altra caratteristica del neutrofilo maturo che dispone di sistemi enzimatici molto ricchi ed adatti a svolgere le funzioni difensive. Ma la quantit di neutrofili maturi presenti nel midollo estremamente esigua, quindi basta uno stimolo flogistico medio per esaurire tutte le riserve del compartimento di stoccaggio. A questo punto il midollo attinge dal compartimento maturativo, quindi quello formato da mielociti, metamielociti e neutrofili banda. In questo modo si riduce la percentuale di leucociti presenti nel midollo, mentre si riscontra un loro incremento nel sangue. Attenzione! Lincremento riscontrabile tramite prelievo molto modesto in confronto allincremento reale, perch essendo cellule difensive sono attratte dal sito di produzione delle citochine e vanno quindi a marginarsi sui vasi nel tentativo di raggiungere il luogo di infiammazione. Il pool marginato tende ad aumentare!! La caratteristica saliente quindi laumento dei neutrofili immaturi o non segmentati o banda (neutrofilia con deviazione a sinistra). Altre caratteristiche accessorie che non sempre si verificano sono laumento dei neutrofili segmentati (maturi), la facoltativa diminuzione dei linfociti (capita frequentemente se linfiammazione molto grave ed il soggetto produce tanti corticosteroidi leucogramma misto da infiammazione e da stress), il facoltativo incremento dei monociti (indica componente necrotica nel processo

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flogistico, perch il monocita una cellula spazzina), la facoltativa diminuzione degli eosinofili (in caso di grave infiammazione e quindi quando c stress). Cronico E il leucogramma che si stabilisce dopo molti giorni di infiammazione. Ma paradossalmente non ci si accorge di nulle allesame del sangue, ed per questo che la flogosi cronica di difficile identificazione dal punto di vista ematologico. A volte lunico segno la monocitosi. Il leucogramma torna identico a quello iniziale perch nella flogosi consolidata le citohine proinfiammatorie richiedono laumentata liberazione di neutrofili da parte del midollo: questo per soddisfare la richiesta diventa iperplastico, sviluppando molto il compartimento proliferativi. Una cellula a maturare ci mette un numero limitato di giorni, quindi quando lo stimolo flogogeno continua a persistere tale compartimento diventa dapprima iperplastico ma poi comincia ad accorciare i tempi di maturazione per poter dare una risposta con neutrofili maturi. Ci perch avendo ampliato il compartimento proliferativi si ottiene un ampliamento anche del compartimento maturativo, con cellule mature. Ed cos che un numero maggiore di leucociti si marginano per uscire poi nei tessuti: la quota tessutale infatti aumenta. Ad esempio, in una polmonite cronica, a livello respiratorio si avr un incremento di neutrofili esterni ai vasi, cio nei tessuti, ad esercitare la loro funzione difensiva. Nel midollo si trover unespansione, ma nel periferico non si trover nulla!! La flogosi cronica, la maggior parte delle volte, non percepibile dal leucogramma! Non c un pattern caratteristico della flogosi cronica! Leucogramma degenerativo Grossa importanza perch ha significato prognostico. Mette infatti in allerta su una eventuale possibile mortalit del paziente perch indica una condizione clinica estremamente seria. Si distinguono almeno 4 tipi di tale leucogramma: Reazione leucemoide Reazione leucoeritroblastica Aumento dei neutrofili immaturi rispetto ai maturi Neutropenia da consumo Reazione leucemoide C una contraddizione interna: leucemia sta per patologia neoplastica proliferativi, mentre reazione indica un processo che non ha base neoplastica. Infatti non si detto reazione leucemica ma leucemoide: emula una leucemia. Si chiama cos perch lincremento dei globuli bianchi cos spiccato dal punto di vista numerico (generalmente anche superiore ai 40/50.000 leucociti per microlitro) che spesso tali numeri si incontrano negli eventi leucemici. Le cause che danno origine a tale reazione sono tutto sommato un numero limitato:

Piometra Pancreatite (solitamente solo nel cane) Pielonefrite28

Anemia emolitica immuno mediata Infezione da Hepatozoon canis Inferzione da Pneumocystis Carinii Carcinoma bronchiale Ecc. ecc.

Queste le cause pi frequenti. La caratteristica che accomuna tutte queste patologie lavere carattere infettivo e di localizzarsi in distretti con elevato scambio con il sangue, come ad esempio lutero o il pancreas. Tali siti organici, quando vanno incontro ad infiammazione, danno grande accesso nel sangue alle tossine liberate, con ripercussioni sistemiche anche a livello midollare. Altre cause possono essere alcuni sarcomi addominali che producono fattori di crescita leucocitaria come il GCSF (Granulocytes Colonity Stimulating Factor) o il GMCSF (Granulocytes Monocytes Colonity Stimulating Factor). Questi sono ormoni, delle citochine, con effetto trofico nel compartimento mieloide. Sono liberati non solo dai tumori addominali ma anche dal carcinoma bronchiale. La caratteristica saliente la quantit di leucociti (pi di 40/50.000) con deviazione a sinistra. Ci che differenzia un leucogramma infiammatorio da una reazione leucemoide lentit! Le cellule sono tante! La reazione leucemoide annessa ai leucogrammi degenerativi perch se la quantit di cellule immesse nel torrente periferico elevata, la quantit proporzionale alla gravit di ci che lha causata: si ha un importante evento flogistico. Inoltre, essendo una neutrofilia che devia a sinistra, ha cellule immature e quindi poco efficienti: la causa grave ma la risposta parzialmente inefficace. Ecco perch in tale reazione al prognosi riservata. Reazione leucoeritroblastica Leuco- sta per globuli bianchi, -eritroblastica sta per eritrociti nucleati. Questa infatti una reazione leucemoide in cui cominciano a comparire nel sangue periferico eritroblasti, in genere in quota superiore al 4/5%. Le cause che la determinano sono le medesime della reazione leucemoide. La comparsa anche degli eritroblasti avviene perch lintensit e la gravit della causa non hanno agito in senso generale del midollo ma hanno alterato la barriera emato-midollare. In sostanza quindi si tratta di una reazione leucemoide con connotazioni di maggior gravit. Aumento dei neutrofili immaturi rispetto ai maturi I neutrofili presenti nel sangue periferico sono quasi esclusivamente di tipo maturo; gli immaturi rappresentano solo l1/2%, non eccedono mai le 300 cellule per microlitro. I maturi sono invece 8/9.000, quindi le proporzioni sono enormemente diverse. Quando si effettuano conteggi leucocitari con neutrofili immaturi o non segmentati superiori ai maturi, si ha un leucogramma degenerativo molto grave che indica in genere una mortalit imminente. Un leucogramma di questo tipo esprime almeno 2 eventi: da un a parte la liberazione di cos numerosi neutrofili immaturi espressione di un processo flogistico grave che stimola il midollo anche se questo ha gi terminato le cellule mature; dallaltra, i neutrofili immessi nel sangue periferico maturano nel giro di poche ore ( per questo che nel leucogramma infiammatorio di trova, oltre alla deviazione a sinistra, anche neutrofilia di tipo maturo) ma29

se l0intensit del processo flogistico spiccata il neutrofilo non riesce a maturare! Viene subito estratto dal torrente periferico e distrutto nello stesso processo flogistico. I neutrofili maturi quindi cominciano a calare. Il consumo prevale sulla produzione! Trovando questo tipo di leucogramma o si rimuove la causa che lo sta determinando o il paziente in genere muore. Neutropenia da consumo Neutropenia sta per abbassamento dei neutrofili, che per possono diminuire con vari meccanismi (es. malattia midollare per cui non vengono prodotti; patologie autoimmuni per cui vengono distrutti ma abbastanza raro). In questo caso i neutrofili vengono proprio consumati dal processo flogistico. I rilievi semiologici per capire se la neutropenia da consumo sono 2: - rilievo di eventuali altre citopenie se la neutropenia dovesse dipendere da una difettosa produzione midollare e dato che il midollo la fabbrica che produce tutte e tre le filiere ematiche, probabile lassociazione di unaltra citopenia, come lanemia o la piastrinopenia. Pu trattarsi di un problema da consumo se non si rilevano altre citopenie. - Tossicit Se la neutropenia da processo flogistico possibile registrare nei neutrofili una o pi reazioni tra schiumosit, vacuolizzazione, ecc. (vedi lezione precedente). Se si trovano tali alterazioni da tossicit probabile che si stia esaminando una neutropenia da consumo. O si rimuove al pi presto la causa del problema o il paziente muore. Leucogramma neoplastico E forse il pi complesso. Pu avere 3 tipi di pattern: Leucemia acuta Leucemia cronica Leucemia cronica riacutizzata I concetti di acuto e cronico non sono in relazione temporale tra di loro nel caso della leucemia! Tale concetto in questo caso dipende dal tipo di cellula che prolifera. Se prolifera una cellula immatura, primordiale (mieloblasto, promielocita, mielocita) si ha una leucemia acuta; se invece prolifera un neutrofilo maturo si avr una leucemia cronica. Importantissimo differenziare questi due eventi perch nella leucemia acuta le cellule, essendo indifferenziate, sono estremamente aggressive, quindi la morte del paziente si ha nel giro di qualche settimana. Nella leucemia cronica, poich prolifera una cellula matura, con scarsissima aggressivit, molto spesso i tempi di sopravvivenza sono molto lunghi ed i sintomi altrettanto scarsi. Tali soggetti possono avere una qualit di vita praticamente normale perch queste cellule hanno scarso interesse ad andare ad abitare siti a loro non idonei: sono cellule mature e quindi abituate a stare nel sangue! Le altre invece invadono i tessuti.

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Leucemia acuta Il leuocogramma si caratterizza di cellule non identificabili e non classificabili perch hanno perso la somiglianza con elementi standard. In questo tipo di leucemia i leucociti possono essere bassi (leucopenia), normali o addirittura elevati (leucocitosi). Ci pu essere come no anche deviazione a sinistra. Stesse caratteristiche per i neutrofili, che possono essere in numero normale, in neutropenia o neutrofilia. Non c quindi un elemento di riconoscimento, tranne il reperimento nel vetrino di cellule non identificabili. I pattern quantitativi non sono in questo caso daiuto. Leucemia cronica Caratterizzata dallincremento di elementi differenziati. Se la popolazione principale costituita da linfociti si avr una leucemia linfocitica cronica, ma ci pu essere leucemia neutrofilica cronica, eosinofilica, basofilica e monocitaria. Prolifera quindi un solo clone leucocitario, o addirittura potrebbero proliferarne addirittura 4, tutti insieme, dando una leucemia mieloide cronica. Ci potrebbe avvenire perch neutrofili, monoliti, basofili ed eosinofili originano da una cellula di partenza in comune. La peculiarit di questa leucemia quella di avere lincremento di una cellula che altrimenti sarebbe normale: per questo difficile diagnosticare una leucemia linfocitica cronica perch delle linfocitosi possono manifestarsi anche in caso di stimolazione antigenica da malattie infettive (linfocitosi reattiva). In tale caso la differenziazione tra reattiva e neoplastica complicatissima perch si osservano cellule mature e normalissime, lunica differenza la quantit! Quindi la caratteristica saliente laumento numerico di una cellula in maniera persistente. Esistono in realt tecniche molto pi sofisticate di un semplice leucogramma per riconoscere se si tratta di una patologia neoplastica, ad esempio studiando i recettori di superficie con delle immunoglobuline specifiche (indagine citoclorimetrica). Comunque pi elevato il numero di cellule pi probabile che si tratti di leucemia. Leucemia cronica riacutizzata Detta anche blastizzante. E la situazione intermedia alle due precedenti. Sono aumentate le cellule mature nel periferico (cronica) ma cominciano a comparire anche cellule di tipo immaturo (riacutizzata).

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LE PIASTRINEUltrastruttura piastrinica: la piastrina ha una struttura ovoidale, tridimensionalmente parlando, ed una cellula metabolicamente molto attiva. La forma ovoidale, e allapparenza sferica che assume a seconda del punto di vista, dovuta ad una impalcatura che traspare. Questa impalcatura formata da microtubuli. La maggior parte dellenergia prodotta dal trombocita viene usata per mantenere la forma, proprio come accade per i globuli rossi. Allinterno della cellula esiste una complicata rete di canali che , in parte, comunicano con lesterno e che formano i sistemi canalicolari interni. Questi canali, che si invaginano in profondit nella struttura della piastrina, servono alla piastrina per riversare allesterno lenorme quantit di sostanze chimiche che essa produce. Queste invaginazioni possono modificarsi nel momento in cui la piastrina si attiva e diventare delle evaginazioni dette pseudopodi, o filopodi; le piastine sono infatti fondamentali per la coagulazione e le reazioni chimiche che portano alla formazione della fibrina necessitano dei fosfolipidi di membrana della piastrina; questo significa che le cascate coagulative si attivano su queste estroflessioni. Sono anche presenti dei granuli, detti alfa granuli, che sono accumuli di sostanze chimiche, sparsi nel contesto della cellula; quando la cellula si attiva, i granuli vengono spostati verso il centro e formano un unico grande granulo, che pu dare limpressione che la piastrina sia parassitata. Le piastrine sono elementi anucleati, di piccole dimensioni, di colore rosa pallido e nelle colorazioni panottiche traspaiono anche delle deboli colorazioni violacee che sono date dai granuli alfa. Nel gatto le piastrine sono pi grandi rispetto alle altre specie, mentre i globuli rossi sono pi piccoli; questa differenza di dimensioni pu causare dei problemi nel momento in cui si debba compiere una conta eritrocitaria o trombocitaria meccanicamente.

ALTERAZIONI QUALITATIVE DELLE PIASTRINE 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. distribuzionali dimensionali di affinit tintoriale morfologiche, o di forma inclusi forme mature patologiche

Le alterazioni distribuzionali individuabili sono di due tipi: quella fisiologica, in cui le piastrine sono sparse, e quella ad aggregati, in cui le cellule, appunto, si aggregano. Questultima frequente nel gatto, essendo le piastrine in questa specie estremamente attive da un punto di vista metabolico, e quindi anche molto reattive; la formazione di aggregati anche influenzata dal tempo che si impiega per raccogliere il sangue. Quando

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questo tempo aumenta, le piastrine si attivano sempre di pi; nel gatto, i vasi su cui compiere il prelievo sono di piccolo calibro e quindi il tempo necessario si allunga. La formazione degli aggregati pu dare una pseudo trombocitopenia, poich la macchina non li riconosce e non li conta, o li conta come soggetto singolo. Gli aggregati piastrinici sono dunque degli artefatti.

ALTERAZIONI DIMENSIONALI Le alterazioni dimensionali vedono la comparsa di Macropiastrine e Micropiastrine. Le macropiastrine si possono individuare al microscopio ottico, mentre le micropiastrine sono difficili da vedere; la micropiastrinemia quindi solo un rilievo strumentale e non visibile al microscopio ottico da parte delloperatore. Le macropiastrine sono piastrine di dimensioni elevate e sono dovute ad un aumento dellattivit rigenerativa del midollo; le piastrine giovani sono infatti pi grandi. Nei soggetti in terapia immunosoppressiva per trombocitopenia immunomediata queste cellule sono molto presenti. Le piastrine si formano da una estroflessione del megacariocita che si pone allinterno dei seni vascolari del midollo, attraverso le fenestrature dei seni stessi; il flusso ematico frammenta questa estroflessione e si formano le piastrine, non pi modificabili da questo momento in poi. Si pu dunque dire che, mentre i globuli rossi ed i globuli bianchi si formano nel midollo, le piastrine si formano gi nel sangue. Le piastrine normali hanno una emivita di 5 o 6 giorni.

ALTERAZIONI DI AFFINIT TINTORIALE Le alterazioni di affinit tintoriale comprendono la Sindrome della Piastrina Grigia, non ancora ufficializzata nel cane e nel gatto, ma descritta nelluomo. La piastrina appare con citoplasma basofilo, con pochi granuli rosati, o granuli assenti, con estroflessioni accentuate, di aspetto vacuolizzato. Questa anomalia anche detta distrombopoiesi ed associata per lo pi a leucemia; riportata in due soli testi e in entrambi descritta in soggetti affetti da questa forma leucemica. Le alterazioni morfologiche, o di forma sono: 1. sfericizzazione 2. allungamento 3. estroflessioni di filopodi 4. addensamento di alfa granuli

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La sfericizzazione un elemento complesso da osservare al microscopio, perch la piastrina sferica se vista longitudinalmente, anche se tridimensionalmente ovoidale; si individua, quindi, valutando la densit della piastrina; se la densit aumentata, allora la cellula sar sfericizzata e non ovoidale. Lallungamento una aberrazione per perdita di forma, cio i microtubuli non vengono pi sintetizzati e viene meno la loro funzione di mantenimento della forma ovoidale. Lenergia viene infatti persa per liberare le sostanze contenute negli alfa granuli, e non ce n per mantenere la forma. Questa anomalia facilmente associata ad emorragie croniche. Lallungamento pu essere associato a estroflessioni di filopodi. I filopodi si formano quando, a seguito di una lesione vascolare, le piastrine devono accorrere ed attivarsi per garantire la cascata coagulativa. Viene allora formato il cemento che unifica le piastrine. Laddensamento dei granuli alfa si ha quando questi vengono posti al centro della cellula e sono sintomo di attivazione, anche se facilmente scambiabile per un incluso parassitario. Le alterazioni da inclusi parassitari sono quelle date da Ehrichia Platys, responsabile della trombocitopenia ciclica. Si hanno dei dubbi, in questi casi, che ci che si vedono possano essere dei granuli alfa addensati; in definitiva, la diagnostica viene affidata dalla biologia molecolare, cio analizzando il DNA del parassita mediante PCR. Le alterazioni da forme immature vedono la presenza di megacarioblasti in circolo. Queste cellule assomigliano molto a linfociti; il sospetto che non lo siano deve sorgere nel momento in cui si vedano delle vacuolizzazioni e dei frammenti voluminosi. I megacarioblasti sono presenti in caso di leucemia megacarioblastica, o AML7 (leucemia mieloide acuta di tipo 7). Nel midollo del paziente si vedono solo megacarioblasti che poi daranno origine a quelle cellule che si ritrovano nel sangue periferico. I megacarioblasti possono anche presentare le orecchie di coniglio; in fase avanzata il nucleo comincia a replicarsi e aumenta la plolidia nucleare.

VALUTAZIONE QUANTITATIVA DEGLI ERITROCITI La quantit di eritrociti valutabile mediante due metodi: la Camera di Burker e il metodo automatizzato. La camera di Burker ha come vantaggi quello di essere economica, ma molto tempo disperdente; un vetrino in cui si trovano degli spazi a volume noto in cui verr posto il sangue diluito. Mediante dei calcoli matematici possibile determinare il numero di eritrociti per microlitro. La conta automatizzata, invece, viene svolta da un Contaglobuli ad Impedenza Elettrica; questo strumento formato da due camere di conta: in una vengono contati eritrociti e piastrine, sullaltra i leucociti e lemoglobina. La prima camera composta da uno spazio, al termine del quale c una pompa di inspirazione, e due elettrodi cui si applica una certa differenza di potenziale. La macchina aspira il sangue, precedentemente diluito, e le particelle ematiche passano a livello degli elettrodi; le cellule, passando, interrompono il flusso di corrente elettrica e queste interruzioni vengono registrate da un contatore ed interpretate come passaggio di una cellula. Ad ogni interruzione corrisponde una cellula. Con questo metodo si andranno a

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contare come eritrociti anche i leucociti, ma questo non ha importanza essendo i globuli rossi nel numero di milioni per microlitro e i globuli bianchi migliaia per microlitro. Le piastrine vengono differenziate dalla macchina in base alla loro dimensione minore; linterruzione di corrente proporzionale alle dimensioni della particella. Questo metodo mi consente anche di avere il volume corpuscolare medio (MCV). Questa procedura di difficile ottenimento nel gatto. La conta dei leucociti si effettua mescolando il sangue con una sostanza lisante per gli eritrociti; questi ultimi si lisano e liberano il loro contenuto. Le uniche cellule contate attraverso i due elettrodi saranno dei leucociti. Questa camera misura anche il contenuto di emoglobina; la celletta ha una fonte luminosa che emette un raggio di luce di 540 nm (lunghezza di adsorbimerto dellemoglobina) e dallaltro lato si ha un rilevatore della fonte luminosa. La luce viene adsorbita dallemoglobina e la luce che arriva in fondo sar inversamente proporzionale alla quantit di emoglobina; questo un esempio di misura spettrofotometrica. Se ci sono delle patologie dimensionali a carico di una popolazione cellulare, i risultati ottenuti mediante il metodo automatizzato saranno falsati; se si ha un paziente con uno shunt portosistemico, che provoca microcitosi, la differenziazione tra eritrocita e piastrina sar pi difficile. Esistono anche dei contaglobuli ottici, o laser, che riescono a differenziare i globuli rossi dalle piastrine anche sulla base del loro indice di rifrazione; questi strumenti misurano la complessit citoplasmatica mediante un raggio laser e la sua diffrazione, e quindi differenziano anche con un criterio densitometrico, oltre che volumetrico. Questo strumento anche in grado di differenziare le popolazioni leucocitarie e le cellule leucemiche: la differenziazione viene effettuata sulla base del contenuto di mieloperossidasi (enzima dei leucociti ad attivit microbicida) e sulla base delle dimensioni della cellula. Facendo un paragone tra laccuratezza del conteggio manuale e quello automatizzato si vede che uno dei problemi di maggiore rilievo legato al conteggio dei reticolociti: il 39% dei risultati ottenuti manualmente contengono errori, solo 2% nel conteggio automatizzato.

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IL PRELIEVO DEL CAMPIONE EMATOLOGICO necessario sapere: - dove si preleva - come si preleva - con quale anticoagulante - quali sono i fattori interferenti Dove: il sito di prelievo pu essere multiplo, anche se generalmente si seleziona la vena giugulare, la cefalica e infine la safena. La giugulare quella preferibile per il calibro maggiore e quindi consente un prelievo pi agevole con un flusso ematico maggiore e meno aggregazione piastrinica; inoltre, quando si va a rasare il cane, o il gatto, sul collo meno visibile e d meno fastidio al proprietario. La controindicazione lobesit, in quanto diviene meno visibile. La cefalica ottimo sito, indicato su soggetti con arto lungo e vena ben visibile. Non ci sono differenze nei risultati dellesame se si preleva da una vena piuttosto che da unaltra; i risultati sono totalmente sovrapponibili. Come: necessaria una siringa con un ago idoneo, o, in alternativa, una butterfly o un vacutainer sottovuoto. Lago per il prelievo deve avere determinate prerogative: deve essere corto, da comprare a parte, che consente una maggiore maneggevolezza, soprattutto nel prelievo dalla giugulare. In alternativa si pu usare la butterfly, purch non si aspiri in modo eccessivo, tale da traumatizzare il campione che si sta prelevando; laspirazione deve essere fatta di pari passo con il sangue che entra in siringa. Non si deve creare un sottovuoto eccessivo ed aspettare che la siringa si riempia, perch in questo modo il sangue viene stressato e quindi si pu emolizzare. I sistemi sottovuoto sono molto usati in umana, meno in veterinaria; il cane deve avere una certa mole perch la provetta ha una quantit di aspirazione proporzionale al calibro della vena. Non conviene usarli in soggetti di piccola o media taglia. Lanticoagulante da selezionare: - EDTA - Citrato trisodico - Eparina Generalmente quello di prima scelta lEDTA (acido etilentiamino tetracetico) che in genere contenuto in provette dal tappo di colore viola. La quantit di sangue da porre nella provetta non casuale, ma c un segno che varia da provetta a provetta; la quantit di sangue deve essere assolutamente rispettata perch dentro c lanticoagulante e deve essere rapportato in modo idoneo con la quantit ematica che si va ad introdurre. Non c assolutamente rapporto tra le dimensioni della provetta e la quantit di anticoagulante che essa contiene. Se si mette meno sangue di quello richiesto, si otterr una diluizione del campione ed una sottostima dei valori; ma se se ne mette troppo si rischia la coagulazione del sangue, essendo il calcio ancora disponibile. Il citrato trisodico si pu usare come anticoagulante e si preferisce per il conteggio piastrinico, in quanto interferisce di pi nella formazione dellaggregato piastrinico; quando, per, si usa questo anticoagulante bisogna disporre di adeguati intervalli di riferimento. Se infatti si dispone di due campioni, di cui uno con EDTA ed uno con citrato, la macchina non registrer gli stessi valori; quindi indispensabile avere gli intervalli di riferimento per il campione con citrato. I valori che si ottengono non sono mai assoluti, ma dipendono dalla macchina, dallanticoagulante e dal reattivo.

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Leparina si usa ma ostacola la colorazione; cio se dopo, dallo stesso campione voglio fare degli strisci per vedere la morfologia, leparina, purtroppo, crea interferenza. Ma si pu usare per il conteggio automatizzato in quanto si sovrappone perfettamente allEDTA, a differenza del citrato.

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Gli enzimi sono delle proteine che hanno la funzione di accelerare una reazione chimica. Generalmente agiscono su di unapposita sostanza complementare, il substrato. Dal legame origina il complesso enzima-substrato, dal quale poi si crea il prodotto. Lenzima viene nuovamente liberato e reso disponibile per una successiva reazione chimica. E + S = ES P + E I patologici clinici hanno lambizione di riconoscere delle patologie occultate magari in parti recondite dellorganismo attraverso una misurazione delle sostanze contenute nel sangue. Questo nasce dalla peculiarit propria del sangue, ovvero quella di bagnare tutti i tessuti. Attraverso lapporto di ossigeno, per il quale il sangue preposto, esso entra quindi in contatto con tali tessuti e ne riceve informazioni di tipo diagnostico. Alcune delle sostanze che possono aiutare in tale ambizione sono proprio gli enzimi, molecole per piuttosto minute che si rendono per questo difficilmente evidenti da un punto di vista chimico. Si ricorre allora ad uno stratagemma; al posto di misurare lenzima presente nel sangue, si va a misurare direttamente il prodotto di reazione finale. Dopo il prelevo di un campione di sangue dal quale si vuole evidenziare un determinato enzima quindi, si aggiunge un eccesso di substrato in modo tale che la velocit di reazione sia direttamente influenzata dalla quantit dellenzima. Quindi lattivit enzimatica della molecola ricercato calcolata indirettamente.

GLI ENZIMI NELLO STUDIO DELLA PATOLOGIA MUSCOLARENella valutazione muscolare sono studiabili due situazioni: Stato muscolare Funzione muscolare La patologia clinica, cio quella di laboratorio, non si pu occupare della funzione muscolare bens solo delle alterazioni muscolari non funzionali. Es. possibile che da un esame del sangue non si possa minimamente reperire una paralisi. Reperibili invece i danni come la necrosi. Gli strumenti disponibili per tale studio sono diversi:

CK Creatinin kinasi AST Aspartato aminotransferasi ALT Alanina aminotransferasi LDH Lattico deidrogenasi Aldolasi

CK Enzima citoplasmatico, che risiede allinterno della membrana cellulare. Durante le analisi se ne misura quella quota che ha avuto accesso al sangue a seguito della morte

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fisiologica di un certo numero di cellule muscolari, che subiscono una modificazione a livello della membrana liberandolo. La funzione peculiare del CK catalizzare una reazione chimica reversibile trasferendo un gruppo fosfato dalla creatina fosfato allADP per formare ATP, quindi energia spendibile sotto forma di contrazione in questo tipo di cellule. La reazione reversibile perch spostata verso la produzione di ATP o verso la produzione di creatina fosfato a seconda dellattivit metabolica muscolare: in caso di esercizio attivo la reazione spostata verso la produzione di ATP perch serve energia per ottenere lavoro, mentre in condizioni di riposo il rapporto tra ATP e creatina fosfato di 8:1. La CK quindi un deposito di energia che si rende disponibile nel momento in cui al muscolo richiesta unattivit. Tre differenti polipeptidi con la medesima funzione enzimatica e che catalizzano la stessa reazione chimica. Tali polipeptidi, dato che hanno diversa conformazione chimica ma catalizzano la stessa reazione, prendono il nome di isoenzimi: CK1 (composto da un dimero BB) CK2 (composto da un dimero MB) CK3 (composto da un dimero MM) CK1 un isoenzima quasi mai misurato nel sangue periferico perch confinato in tessuti specifici, ovvero lencefalo, i nervi periferici ed il liquor. Potrebbe quindi avere significato semiologico analizzando un campione di liquor per la verifica di uneventuale patologia del sistema nervoso centrale, come negli infarti e nelle trombosi: il danno ischemico produce aumento del CK non ematico bens confinato allinterno del liquor. Tale separazione mantenuta dalla barriera ematoencefalica presente tra sistema nervoso e sangue. La CK degli esami del sangue potrebbe corrispondere effettivamente a qualsiasi dei tre isoenzimi ma nella pratica quasi mai si tratta del CK1. CK2, detto anche enzima MB, settorializzato a livello del muscolo cardiaco. CK3, o MM, costituisce la quasi totalit del CK riscontrato nellesame del sangue e riportato nel referto. E la parte riservata al muscolo striato ed in parte anche a quello cardiaco. Nella patologia clinica generalmente si va a misurare la CK complessiva, in un unico risultato, ma nella maggior parte dei casi il dato riflette la somma del CK2 e del CK3. Volendo studiare selettivamente queste 3 diverse porzioni dellenzima si pu ricorrere ad una elettroforesi o una cromatografia a scambio ionico, ma sono entrambe procedure che nella pratica clinica non vengono quasi mai effettuate. Il CK che appare nel referto espresso in unit/litro ed considerato lesplorativo del danno muscolare. Alcune patologie, quali la toxoplasmosi, la neosporosi, la miosite traumatica, la miosite idiopatica dei muscoli masticatori, investimenti automobilistici con traumi muscolari da schiacciamento causano quindi, dopo alcune ore, laumento della CK nel sangue perch vi un suo rilascio da parte delle fibre muscolari lacerate. Dopo aver misurato lattivit enzimatica (di qualsiasi enzima!) vanno fatte alcune considerazioni riguardo: Et Razza Emivita plasmatica Ci perch alcuni enzimi possono esser presenti a livelli diversificati ma fisiologici a seconda di tali parametri.

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Considerando let infatti, normale che la fosfatasi alcalina sia maggiormente presente nei soggetti giovani perch indispensabile nella loro spinta mineralizzazione ossea. La CK ha unattivit enzimatica molto pi elevata nei primi giorni rispetto ai soggetti adulti, quindi comune trovarne un valore pi alto anche di 6-7 volte il normale in un paziente molto giovane. Tali livelli tendono a decrescere linearmente da poco dopo la nascita per raggiungere valori normali al 7 mese di vita circa. Nei soggetti senili infine, il suo valore leggermente pi basso rispetto agli adulti. Differenze relative anche alle razze. I cani di taglia medio-piccola infatti hanno livelli di CK mediamente pi elevati rispetto ai so