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Terapie personalizzate: i cocktails di farmaci e gli integratori

Mitocon 2014

Carlo Dionisi-Vici U.O.C. Patologia Metabolica

Dipartimento di Medicina Pediatrica

carlo.dionisivici@opbg.net

a) Malattie che causano “intossicazione” (acuta & cronica) Aminoacidopatie - PKU, MSUD, tirosinemia, omocistinuria Acidemie Organiche (Propionica, Metilmalonica, Isovalerica, Glutarica) Difetti del Ciclo dell’Urea Intolleranza a zuccheri - Galattosemia, Intolleranza al Fruttosio Intosicazione da Metalli - rame, ferro Porfirie b) Malattie del Metabolismo Energetico Difetti ossidazione acidi grassi, difetti catena respiratoria, PC, PDH, Krebs Malattie citosoliche (glicolisi/gluconeogenesi/glicogeno, difetti metabolismo pentoso fosfati) c) Malattie da Carenza di Substrati Difetti metabolismo delle vitamine - B12, folati, B6, B1 & metalli – rame Difetti metabolismo creatina Difetti di sintesi dei neurotrasmettitori & aminoacidi - serina, glutammina Difetti di sintesi del colesterolo d) Disordini di Molecole Complesse Malattie lisosomiali Malttie perossisomiali Sindromi CDG Disturbi metabolismo fosfolipidi

Classificazione delle Malattie Metaboliche

ac. grassi zuccheri proteine

FFA G6P

piruvato

glucosio

lattato acil-CoA

acil-carnitine PDH

ciclo Krebs

I II III IV V

catena respiratoria ATP

β-ossidazione

Acetil-CoA e-

CORPI CHETONICI

aminoacidi

ac.organici

ciclo urea

UREA

NH4+

IL METABOLISMO INTERMEDIO

Terapia delle Malattie Metaboliche

• Dietetica • Vitamine - cofattori • Farmaci • Terapia cellulare • Trapianto d’organo • Terapia enzimatica sostitutiva • Inibitori sintesi substrati tossici • Terapie chaperon • Terapia genica

nessuna terapia # 40-30% trattamenti di supporto – cure palliative

Pronto Soccorso OBG 1987 > 3 anni LARINGITE ACUTA Eo: condizioni generali gravi, dispnea intensa, stridore inspiratorio, FR 56/min + ATASSIA

….in ANAMNESI…….. Abortività materna ripetuta Ricorrenti episodi di dispnea/tachipnea con STRIDORE LARINGEO @ 1 e 2 anni: DERMATITE SEBORROICA del capo seguita da ALOPECIA

Esami di laboratorio: lattato elevato pH 7.4 EB – 19 bicarbonati 6 mEq - pCO2 15.4 Anion Gap 25

Malattia Metabolica ???

Diagnosi?……..laringite???

SCARSISSIMA RISPOSTA ALLA TERAPIA STEROIDEA e O2

Dionisi-Vici C, Bachmann C, Graziani MC, Sabetta G. Laryngeal stridor as a leading symptom in a biotinidase-deficient patient. J Inherit Metab Dis. 1988;11(3):312-3.

Sospetto deficit BIOTINIDASI

BIOTINA 5 mg per os Dopo 2 ore COMPLETA NORMALIZZAZIONE DEL QUADRO RESPIRATORIO E DELLE ALTERAZIONI DI LABORATORIO

ELISA nel 2006 laurea in Economia

Pt. 1 • 5 mesi diagnosi Leucemia Linfatica Acuta cellule B • Chemioterapia in accordo con INTERFANT 2006 • Diarrea e vomito dopo la prima somministrazione di Metotrexate (MTX) ad alto dosaggio dosaggio • Nutrizione parenterale totale (TPN) • giorno 19: 3 settimane di terapia MTX, deterioramento clinico, tachipnea, letargia • Grave acidosi metabolica + iperlattacidemia • Infusione di bicarbonati senza miglioramento > dialisi • Valutazione matabolica: Analisi degli acidi organici urinari

Pt. 2 • 9 anni diagnosi di Leucemia Mieloide Acuta. • Vomito persistente dopo chemioterapia • Nutrizione parenterale totale (TPN) • giorno 19 TPN: deterioramento clinico, tachipnea, rapido cambiamento dello stato mentale • Grave acidosi metabolica + iperlattacidemia • Infusione di bicarbonati senza miglioramento •Valutazione matabolica: Analisi degli acidi organici urinari

Maiorana 2014

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

1e+07

1.1e+07

1.2e+07

1.3e+07

1.4e+07

1.5e+07

1.6e+07

1.7e+07

1.8e+07

1.9e+07

Time-->

1 2

3 4

5

6

7

8

is is 9

10

1) Lattato 2) 2-OH-butirrato 3) Piruvato 4) 2-OH-isovalerato 5) 2-cheto-butirrato 6) 2-cheto-isovalerato 7) 2-cheto-3-metil-valerico 8) 2-cheto-isocaproato 9) 2-cheto-glutarato 10) 2-cheto-adipato

Maiorana 2014

Enzimi dipendenti dalla Tiamina

L’effetto della Tiamina in caso di deficit secondario

Maiorana 2014

Carrozzo 2014 submitted

Caso clinico Maschio, primogenito da genitori italiani consanguinei - Nella prima infanzia: ricorrenti episodi di sonnolenza e chetonuria

- All’età di 3 anni dolore muscolare e faticabilità

- All’età di 4,5 anni un episodio di letargia, ipotonia, sudorazione e pallore dopo 17 ore di digiuno. Citolisi epatica GOT/GPT 199/209, chetonuria, epatomegalia, iperecogenicità epatica → biopsia epatica → deficit di fosforilasi (glicogenosi VI) - A 15 anni progressivo sviluppo di intolleranza allo sforzo (test da sforzo interrotto dopo 1 minuto). ECG, ecocardiogramma, neurografia, elettromiografia nella norma

Parametri biochimici: aumento intermittente di lattato plasmatico + un caratteristico profilo di aumento degli AA ramificati e alloisoleucina (range 4-16µM/L) e presenza di α-chetoacidi urinari

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00

2000000

4000000

6000000

8000000

1e+07

1.2e+07

1.4e+07

Time >

4

pyruvic

2-OH-isovaleric

2-ketoisovaleric

2-keto3-CH3-valeric

2-ketoisocaproic

lactic

IS

2-ketoglutaric

IS

Carrozzo 2014 submitted

43 215 245 387 50973 3181

I40LfsX4 G461E

Carrozzo 2014 submitted

Muscle

DLD

VDAC

Ctrl Pt. 1st Pt. 2nd

Pre-Riboflavin On Riboflavin

On-R

1. Partial restoration of the DLD protein at SDS-page of 2nd muscle biopsy and disappearance of increased mitochondrial proliferation at histochemical reactions (COX, NADH).

2. Complete resolution of clinical symptoms and normalization of urinary organic acid profile

Pre-R

Pt. 2nd

Muscle biopsies

Carrozzo 2014 submitted

cytosol

FFA fatty acyl-CoA

carnitine

fatty acid oxidation

acetyl-CoA

βOX- cycle e- transfer

fatty acylCoA

carnitine Carnitine cycle

ketones CO2+H2O ketogenesis

mito

Deficit Primario di Carnitina

No terapia carnitina 3 g/die

Tein 1990; Lamhonwah 2002

anamnesi negativa, a 2 anni episodio febbrile → trasferita dall’Ospedale di Avezzano al OBG per scompenso cardiaco in cardiomiopatia dilatativa glicemia 23 mg/dl ammonio 215 mcg/dl acido urico 14 mg/dl EB -14 HCO3 12 SGOT 950 SGPT 938 CPK 1036 chetoni urine assenti

Difetto della beta-ossidazione > VLCAD

Ipoglicemia - cardiomiopatia

DIETOTERAPIA LIPIDI CARBOIDRATI (MAIZENA) PASTI FREQUENTI - ENTERALE OLIO MCT (solo dif. lunga catena) DIGIUNO - FEBBRE – VACCINAZIONI

PRINCIPI DI TRATTAMENTO

FARMACI CARNITINA RIBOFLAVINA

FASI ACUTE INFUSIONE GLUCOSATA

CINZIA deficit di VLCAD

carnitina

acil-carnitina acil-CoA

Le acilcarnitine: una finestra sul mitocondrio 16/37

459.5

542.6

200 250 300 350 400 450 500 550 m/z, amu

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

Inte

nsity

, cps

CTD

MC

AD

SCAD

VLC

AD IV

A H

MG

GA1

- G

A2

MM

A - P

A

CAC

T

LCH

AD -

MTP

Screening acilcarnitine in MSMS

Enhance electron transfer within the respiratory chain

• Riboflavin (FAD precursor) • Niacin (NADH precursor)

CoQ (Idebenon, EPI-743)

Vitamin E

Coenzyme Q10 • Primary CoQ deficiencies (mutations in enzymes involved in CoQ synthesis)

• Secondary CoQ deficiencies (mutations in other genes)

• Neonatal-onset • full-term babies • normal pregnancy • symptom-free period • feeding refusal • vomiting • abnormal posturing, • lethargy, seizures, coma • death within a few days if

not appropriately treated

• Late-onset • variable clinical picture • acute life-threatening

enchephalopathy • intermittent or chronic

symptoms (ataxia, abnormal behaviour, recurrent vomiting with or without ketoacidosis, failure to thrive, liver dysfunction,developmental delay..)

ORGANIC ACIDURIAS Classical forms > disorders that cause intoxication

High risk of “acute metabolic decompensation” triggered by stress events fever, infections, diarrhoea, fasting,immunisation, etc

Organ complications

CNS Mental Retardation at long term follow-up (>2ys) ~ 70% of neonatal onset pts Basal ganglia stroke (MMA-PA)

MMAmut0

HEART Cardiomyopathy PA – MMA

KIDNEY Chronic renal failure MMA

PANCREAS Acute pancreatitis in PA

Propionic

2-oxoisocaproic ac.

Isovaleryl-CoA

3-Methylcrotonyl-CoA

Acetyl-CoA

2-oxo-3methyl-valeric ac.

Tiglyl-CoA

Propionyl-CoA Methylmalonil-Co-A

Succinyl-Co-A

2-oxoisovaleric ac.

Methylacrylyl-CoA

Leucine

2-Methylbutyryl-CoA Isobutyryl-CoA

acetoacetate

Isoleucine Valine

3-Methylglutaconyl-CoA

3-OH-Methylglutaryl-CoA

2-methyl-3-OH butyryl-CoA

2-Methylacetoacetyl-CoA

3-OH-Isobutyryl-CoA

3-OH-Isobutyryc ac.

Methylmalonic semialdeide

methionine odd-chain fatty acids

cholesterol

B 12 biotin

biotin

thiamine

Vitamins in OAs

PCC

carnitine

propionyl-carnitine

carnitine +

carnitine

CoA

Carnitine buffer function in OAs

J Pediatr 1996

u. 5-oxoproline 156 2145 17

pl. GSH uM 0,3 0,005 0,1

GSH:structure and function

NH3+

C

H2C

O-

O

H2C C

O

HHN C

CH2

O

SH

H

NH

CH2

C

O-

O

• GSH is the most abundant non-protein thiol in the cell • Functions: antioxidant, cytoprotection - critical in maintaining cell redox status • GSH is up-regulated during oxiative stress

Oxidative stress

• Free radical generation is an essential contributor to health and homeostasis

• Free radicals (ROS & nitric oxide) play a vital role as mediators of , cell signalling, vascular tone, cell generation and degeneration, control of cellular homeostasis and defence against microorganisms • Free radical species are physiologically indispensable in maintaining redox homeostasis

severe disturbance in the prooxidants–antioxidants balance leading to cells and organs damage which activates/accelerate disease processes

Free radicals

Mild oxidation/physiology

Oxidative equilibrium

Free radicals

Severe oxidation/pathology

Oxidative stress

• GSH (or reduced glutathione) is consumed in many enzymatic and non-enzymatic reactions, where it serves as a source of reducing equivalents

• GSH is used by glutathione peroxidases and can exchange with disulfides to yield GSSG

• GSSG (oxidized glutathione) via the action of glutathione reductase regenerates GSH at the expense of NADPH

• The glutathione S-transferases (GST) • plays a protective role generating GS-Pro from GSSG

GSH: uses, loss and replacement

EPI-743 is a therapeutic small-molecule designed to replete reduced glutathione through NQO1-catalyzed electron transfer from NADPH

EPI-743 is orally bioavailable and readily crosses the BBB

Shrader, W.D. et al 2011

α-tocotrienol quinone

EPI-743 restores glutathione cycle and lowers oxidative stress

Pastore MGM 2013

EPI743: a treatment for SUCLA2 (& Leigh syndrome)?

Newcastle Pediatric Mitochondrial Disease Scale

GMF PedQL MDCRS Improvement 10.0±11.1 p 0.006 Improvement 15.0±20.8 p 0.02

Martinelli et al. MGM 2012

EPI743: a treatment for SUCLA2 (& Leigh syndrome)?

•The apparent safety of most agents has motivated a continued prescriptions • Patients and physicians shoul no longer rely on potentially biased data, with the assiciated costs & risks

• Recommendations for treatment trials in mitochondrial diseases

Nat Rev Neurol 2013

35 studies selected from 1039 publications

The need of an EBM based approach

EPI743

Cobalamin

Rutsch 2009

Inherited cobalamin defects

Fischer et al.

Pastore et al.

GSH in lymphocytes from 18 cblC patients

C. Dionisi-Vici PI

Retinopathy – optic atrophy - nistagmous

OX/TOT ratio in IEM

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

CTRLS

NPC-Untreated

NPC-Treated

GAUCHER

GM1

Menkes

Wilson

SO

CBS

MTHFR

CBLC

HHH

OTC

ASL

ASS

VLCAD

MTP

MCAD

CACT

CPT1

PA

MMA

HMG

IVA

MITO

P = significant