Identificazione di nuovi geni

malattia nelle patologie

mitocondriali

Daniele Ghezzi UO Neurogenetica Molecolare

Sequenziamento di nuova generazione

Perché il sequenziamento dell’esoma?

85% mutazioni

Strategia tradizionale

Analisi di linkage o mappaggio di omozigosità

Geni candidati

Grosse famiglie con malattia genetica (autosomica recessiva)

Screening mutazionale

Identificazione di nuovi geni malattia

Pazienti singoli e piccole famiglie

Filtraggio

Geni (mutazioni) candidati

Sequenziamento esoma Varianti

Nuova strategia

Analisi familiari

Filtraggio varianti

Conservazione e predizione patogenicità cambio aa

Geni codificanti proteine mitocondriali

Analisi gruppi di pz con stesso fenotipo

Colture cellulari

Lievito

Total variants identified in Individual ID #55554 21336

Synonymous variants 11140

Non Synonimous Variants 10196

NSV with frequency <0.2% in “in-house” + public databases 331

>2 NSV / gene 22

n idsnv chr genesymbo NonSyn/G Omim class function Cases Controls Variant MapQual Depth PercentVa rs1 2032113 chr1:11682 B3GALT6 9 http://www. snp missense 1 0 1 60 5 40 http://www.2 2032120 chr1:65008 ESPN 72 606351 snp missense 1 0 1 43 7 57 rs38179213 1799904 chr1:11522 AMPD1 12 102770 snp missense 1 2 1 60 97 53 rs617524784 2032541 chr11:2062 SLC6A5 18 604159 snp missense,5utr 1 0 2 60 3 67 http://www.5 1669566 chr11:6674 C11orf86 6 http://www. snp missense 1 2 2 60 3 100 rs118060726 2032647 chr14:6520 PLEKHG3 27 http://www. snp missense,5utr 1 0 2 60 6 83 http://www.7 2032663 chr15:2077 GOLGA8E 11 http://www. snp missense 1 0 2 27 13 77 http://www.8 1754118 chr15:4328 UBR1 17 605981 snp missense 1 1 1 59 27 33 http://www.9 2032689 chr15:8378 TM6SF1 8 http://www. snp missense,3utr,missens 1 0 1 60 164 44 http://www.

10 1804636 chr17:8039 HEXDC 13 http://www. snp missense,3utr 1 1 1 60 68 43 rs1129096711 2032834 chr19:7542 PEX11G 11 http://www. snp missense 1 0 2 60 5 80 http://www.12 2032864 chr19:5117 SHANK1 46 http://www. snp missense 1 0 1 60 3 67 http://www.13 2032222 chr2:15239 NEB 83 161650 snp missense 1 0 1 60 148 46 http://www.14 2015210 chr20:5852 TCF15 8 http://www. snp missense 1 1 2 60 5 80 http://www.15 1837500 chr6:35096 TCP11 9 http://www. snp missense,missense,ne 1 1 1 60 64 50 http://www.16 2032068 chr6:74207 MTO1 8 http://www. indel,snp frameshift,missense 1 0 1 60 86 38 http://www.17 2032393 chr6:13724 SLC35D3 13 http://www. snp missense 1 0 2 60 7 86 http://www.18 2018016 chr7:44026 POLR2J4 9 http://www. snp missense,5utr 1 1 2 32 6 83 rs7873395419 1772682 chr7:13207 PLXNA4 22 http://www. snp missense 1 1 1 59 33 33 http://www.20 2032429 chr7:15168 GALNTL5 11 http://www. snp missense,3utr 1 0 1 59 69 54 rs7579783121 2032436 chr8:87483 MFHAS1 23 http://www. snp missense 1 0 1 60 64 55 http://www.22 2032486 chr9:13632 C9orf7 8 http://www. snp missense,3utr 1 0 2 60 3 67 http://www.

Filtraggio (per malattie mitocondriali)

Alterazione proteina Varianti rare Trasmissione recessiva

1 gene codificante una proteina mitocondriale

Classificazione genetica delle malattie mitocondriali Difetti del DNA mitocondriale • Protein synthesis genes (rRNAs, tRNAs) • Protein-encoding OXPHOS subunit genes • Large deletions

Mutazioni DNA nucleare • Geni codificanti proteine strutturali MRC • Geni codificanti fattori d’assemblaggio MRC • Geni codificanti enzimi per biosintesi di lipidi o cofattori • Geni codificanti per fattori importanti per mantenimento mtDNA • Geni codificanti per fattori per la sintesi proteica mitocondriale • Geni coinvolti nella biogenesi/dinamica mitocondriale

Mutazioni mtDNA

Mutazioni nDNA

Non nota

52%

30% 18%

Diagnosi genetica

DNA mitocondriale

Geni codificanti per fattori per la sintesi proteica mitocondriale

MRPL3

MRPL44

MTPAP

MTFMT

EARS2 FARS2

AARS2

MARS2

CARS2 MTO1

Kovalova & Tyynisimaa 2013

Tessuto specificità delle mutazioni aaRS2

•P1:Neonatal onset •Psychomotor delay •Axial hypotonia, hypertonia of limbs •Brain MRI: thin corpus callosum, bilateral lesion of the pallidum •Increased lactate (plasma, CSF) •Multiple OXPHOS deficiency in muscle

•P2:Neonatal onset •Axial hypotonia, hypertonia of upper limbs •Frequent vomiting •Increased lactate (CSF) •Multiple OXPHOS deficiency in muscle

P1 P2 2

0

50

100 Muscle homogenate Cultured fibroblasts

I II III IV V I II III IV V TARS2

Compound heterozygous mutations in TARS2 gene

Ivs6+3 A/G wt TGGgtaaga Mut TGGgtgaga

Pro282Leu (ex8) wt CCC Mut CTC

H.sapiens SSGAPETLQRVSGISFPTTELLRVWEA M.Mulatta SSGAPETLQRVSGISFPTTELLSAWEA C.lupus SSGTPETLQRVSGISFPTVEELRAWEE B.taurus FPDAPETLQRVSGISFPTAEELRAWEE M.musculus SLGAPETLQRVSGISFPKVELLRNWEA R.Norvegicus SSEAPETLQRVSGISFPKAELLRNWEA G.gallus GPSGRLSLQRIAAIAFPSTQELQAWQQ

Phylogenetic conservation

Pathogenicity prediction

Pdeleterious substitution Pwt Psubstituted

0.83211 P282L 0.42337 0.02433 (Panther)

This mutation is predicted to be probably damaging with a score of 0.974

(Polyphen2)

EXON 6 intron 6 .

TARS2

cDNA studies on the splice-site variant

P3: c.845T Ct: c.845C

TARS2

HSP60

P2 Ct

55% 100%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Ct P2 Ct P2

Leu(UUR) Threonine

tRNA

aa-tRNA

TARS2

HSP60

P2 P2+TARS2 Ct Ct+TARS2

0

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

0.0006

0.0007

0.0008

0.0009

P2 Imm P2+TARS2 Ct Imm Ct+TARS2

*** ns

*** ns Complementazione (infezione con TARS2 wt)

TARS2

0

50

100 Muscle homogenate Cultured fibroblasts

I II III IV V I II III IV V

•A 29 year-old woman •No family history for neurological disorders •Since 2 years of age psychomotor delay •Progressive severe cerebellar ataxia and psychotic features •Brain MRI: cerebellar atrophy and periventricular leukopathy. •Profound COX deficiency in muscle

AARS2

GT

P1

COX/SDH

P1

Arg521STOP (ex11) wt CGA Mut TGA

Phe50Cys (ex1) wt TTT Mut TGT

H.sapiens AAKASAVRAAFLNFFRDRHGHRLVPSAS P.troglodytes AAKASAVRAAFLNFFRDRHGHRLVPSAS C.lupus PAQATAVRDAFLSFFRDRHGHRLVPSAS B.taurus PPHGAAVRDAFLSFFRDRHGHRLVPSAT M.musculus PPHGAAVRDAFLSFFRDRHGHRLVPSAS G.gallus PIQAAAVRDAFLSFFRDRHGHRLVPSAS D.rerio EFTSKRVRRKFIDFFREGYGHRVVPSSS

F50C R521X

wt mt Position NN output Prediction

F C 50 0.6877 PATHOLOGICAL

Phylogenetic conservation Pathogenicity prediction

This mutation is predicted to be probably damaging with a score of 1.000 (Polyphen2)

(PMUT)

Compound heterozygous mutations in AARS2 gene

AARS2

AARS2

AARS2

M. Van der Knaap (University Medical Center, Amsterdam)

A

B

Phe50Cys Arg521*

Leu155Arg Arg592Trp

Aminoacylation domain Editing domain

Gly965Arg Glu405Lys

Gln537* Glu784Serfs*9 Ala77Val Arg199Cysa

Phe131del Val730Meta Thr871Asnfs*21

AARS2

Nuovi geni malattia

Nuove mutazioni e nuovi fenotipi

42%

3%11%8%

37% validatidelezprobabilivarianti dubbiesenza diagnosi

- 38 pz con diagnosi clinica e biochimica di malattia mitocondriale - Sequenziamento dell’esoma (Istituto di Genetica, Monaco, Germania; BGI, Shenzen, Cina; MBU, Cambridge, UK)

La nostra esperienza…

Sequenziamento dell’esoma

Rispetto alle tradizionali analisi di linkage, l’exome sequencing è una strategia

molto più efficace per identificare varianti rare, responsabili di malattie mendeliane

Il sequenziamento dell’esoma è indicato per trovare le mutazioni responsabili di malattie molto eterogenee dal punto di vista genetico

A differenza dell’analisi di linkage, l’exome sequencing può essere applicato a piccole famiglie e a singoli individui

Per definizione, l’exome sequencing identifica varianti nelle regioni codificanti; quindi, anche se più informativo degli approcci classici, non è un metodo esaustivo

- mutazioni negli introni - esoni non “analizzati” - delezioni esoniche …

Sequenziamento dell’esoma

Richiede strumentazioni costose e personale specializzato

Genera un enorme quantità di dati, la cui analisi richiede personale dedicato e

adeguata forza biocomputazionale

La capacità di distinguere mutazioni patogene tra centinaia di varianti è fondamentale - importanza dei filtri utilizzati - possibilità di validazione funzionale

Il sequenziamento dell’esoma associato a opportuni filtri, è efficace

nell’individuare la causa genetica in malattie mitocondriali, grazie alla possibilità di validare la patogenicità delle varianti identificate

Questo approccio permette di identificare nuovi geni malattia (MTO1, FBXL4,

VARS2, TARS2) e presentazioni fenotipiche inattese (AIFM1, TMEM70, AARS2)

Exome sequencing nelle malattie mitocondriali

Per la diagnostica…

Per la ricerca di nuovi geni malattia…

Targeted resequencing

< €€€ , < Time > ANSWERS

TruSeq Custom Amplicon (Illumina)

E’ importante pianificare la strategia di utilizzo del pannello già al momento del disegno

1 run= 7Gbasi di dati =7 000 000 000 bp

Pochi geni per tanti pazienti

Tanti geni per pochi pazienti

- minimo 16 massimo 1536 ampliconi (≈80 geni) tramite DesignStudio

Caratteristiche: - Target resequencing basato su PCR, Kit da 96 campioni

Pannello Mito1 (difetti isolati, PDH, CoQ10) 72 geni (492 esoni; 1195 ampliconi)

Pannello Mito2 (difetti multipli) 61 geni (586 esoni; 1370 ampliconi)

In letteratura descritte mutazioni in circa 150 geni

Malattie mitocondriali Geni analizzati per diagnostica: 45 Pz/mese: 40-50

UO Neurogenetica Molecolare (Istituto Neurologico “Besta”, Milano)

Pannello MD1 (distonie, discinesie, NTL, folati, pterine) 45 geni (495 esoni; 1253 ampliconi)

Pannello MD2 (Parkinson, NBIA, Wilson, CLN) 49 geni (504 esoni; 1376 ampliconi)

Pannello MD3 (glicolisi, Aicardi-Goutieres, calcificazioni) 50 geni (587 esoni; 1435 ampliconi)

Altre patologie neurologiche Disturbi movimento infantili e giovanili Neurodegenerazione con accumulo di ferro Disturbi glicolisi

Vantaggi:

- Sistema molto flessibile

- Dinamico (implementabile con nuovi geni)

- basso costo per paziente (250-600 €)

- high troughput: possibilità di screening di molti più geni

Svantaggi:

- ottimizzazione manuale del disegno

- non copre al 100% tutti i geni

- elevato investimento iniziale (x 96 campioni 10.000-30.000 €)

- necessità di interpretazione e validazione di molte varianti nuove di

significato incerto

TruSeq Custom Amplicon (Illumina)

Sequenziamento di pannelli di geni (Targeted resequencing)

Collaboratori Holger Prokisch, Tobias Haack, Thomas Meitinger (Helmoltz Center, Munich, Germany) Massimo Zeviani, Aurelio Reyes, Alan Robinson (MRC Cambridge, UK) Mingyan Fang (BGI, Shenzen, China) E. Baruffini, C. Dallabona, I. Ferrero (Università di Parma) Graziella Uziel, Isabella Moroni (NPI, Istituto Neurologico “Besta”) E. Bertini (Osp. Pediatrico Bambin Gesù, Roma), R. Parini (Osp. San Gerardo, Monza), A. Burlina (Università di Padova) M.A. Donati (Osp. Meyer, Firenze), P. Balestri (Università di Siena), M. Van der Knaap (University Medical Center, Amsterdam), R. Taylor (University of Newcastle, UK)

www.mitopedia.org

Grazie!

Ministero della Salute

Exome seq

Lievito

Clinici

•A 7 year-old boy •No family history for neurological disorders •Congenital onset •Psychomotor delay and microcephalia •Seizures, hypotonia, hypostenia •Brain MRI: periventricular hyperintense lesions, and in the insula and fronto-temporal right cortex. Spectroscopy also revealed increase of lactate in the frontal white matter. •Isolated cI deficiency in muscle

0

50

100 Muscle homogenate Cultured fibroblasts

I II III IV V I II III IV V

VARS2

Homozygous mutation in VARS2 gene

Thr337Ile (ex10) wt ACA Mut ATA

H.sapiens SFGLLFSVAFPVDGEPDAEVVVGTTRPETL C.lupus SFGLLVSVAFPVDGEPDAEVVVGTTRPETL B.taurus SFGLLFSVAFPVDGEPDAEVVVGTTRPETL R. norvegicus SFGLLVSIAFPVDGDPGTEIVVGTTRPETL M.musculus SFGLLASVAFPVDGEPDTEIVVGTTRPETL D.rerio EFGTMVTFAYPLEGQ-EGEVAVSTTRPETM

Phylogenetic conservation Pathogenicity prediction

wt mt Position NN output Prediction

T I 367 0.6061 PATHOLOGICAL

(PMUT)

This mutation is predicted to be probably damaging with a score of 0.998

(Polyphen2)

aminoacylation domain editing domain

T337I

VARS2

VARS2

VARS2

HSP60

P1 P1+VARS2 Ct Ct+VARS2

***

0

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008

0.001

0.0012

P1 Imm P1+VARS2 Ct Imm Ct+VARS2

*** ns

*** ns

Complementazione (infezione con VARS2 wt)

VARS2

HSP60

P1 Ct

69% 100%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Ct P1 Ct P1

Leu(UUR) Valine

tRNA

aa-tRNA

Nucleus

YDR ∆YDR

pFL38 YDR

Il lievito come modello per le malattie mitocondriali

∆ strain

2% glucose 2% acetate

104 103 102 104 103 102

wt

RESPIRATION AND FERMENTATION

ONLY RESPIRATION

ALA1

vector

ala1F22C

ala1V500X

Glucose Glycerol

ala1

L-16

X

28°C

37°C

ALA1

vector

ala1F22C

ala1V500X

ala1

L-16

X YEAST MODEL: Oxphos growth

AARS2

ALA1

vector

ala1F22C

ala1V500X

Glucose Glycerol

ala1L125R

ALA1 vector

ala1F22C

28°C

37

°C

A

ALA1 vector ala1F22C ala1V500X ala1L125R

ns ***

ns % re

spira

tion

rate

0

20

40

60

80

100

120

0

20

40

60

80

100

120

140

ALA1 vector ala1F22C ala1V500X ala1L125R

CIV CI/CIII

% a

ctiv

ity

0

20

40

60

80

100

120

ALA1 ala1F22C

B

0

20

40

60

80

100

120

ALA1 ala1F22C

*** 28°C 37°C

C CIV CI/CIII

28°C 37°C

28°C 37°C

Var1 Cox1 Cox2 Cob Cox3 Atp6

Atp8/9

normalized ratio 1.0 0.9 <0.1 1.0 0.4

28°C 37°C

overexposed

Loaded

Unloaded

D 28°C

E

F

28°C

ALA1

ala1F22C

ala1V500X

vector

ala1L125R

37°C

ALA1

ala1F22C

550 560 602 nm

550 560 602 nm

AARS2

The protein apparatus is provided by specific

nuclear genes

mtDNA translation takes place in mitochondria

The RNA apparatus is provided by mtDNA genes

(tRNAs, rRNAs)

aaRSs are a group of enzymes that charge tRNAs with their cognate aminoacids (crucial step for the

initiate of translation)