Mitocon2015 ghezzi

Aggiornamenti sulla diagnostica

delle patologie mitocondriali

Daniele Ghezzi

UO Neurogenetica Molecolare

Per la diagnostica…

Per la ricerca di nuovi geni malattia…

Elevata eterogeneità genetica delle malattie mitocondriali

Difetti del DNA mitocondriale

• Geni correlati alla sintesi proteica mitocondriale (rRNAs, tRNAs)• Geni codificanti proteine strutturali MRC• Grosse delezioni

Mutazioni DNA nucleare

• Geni codificanti proteine strutturali MRC• Geni codificanti fattori d’assemblaggio MRC• Geni codificanti enzimi per biosintesi di lipidi o cofattori• Geni codificanti per fattori importanti per mantenimento mtDNA• Geni codificanti per fattori per la sintesi proteica mitocondriale• Geni coinvolti nella biogenesi/dinamica mitocondriale

DNA mitocondriale

Gen

i nuc

lear

i ass

oci

ati

a pa

tolo

gie

mito

cond

rial

i

2001 Shoudbridge

2004 Zeviani&Didonato

2006 Zeviani&Carelli

2011 Ghezzi&Zeviani

2014 Rotig

2015 Turnbull&Rustin

Clinical categories

Number of distinct phenotypic entities (502 total)

Neurologic 93

Metabolic 72

Oncologic 39

Endocrinologic 34

Ophthalmologic 32

Hematologic 29

Gastrointestinal 28

Musculoskeletal 27

Genitourinary 24

Dermatologic 23

Psychiatric 21

Cardiovascular 18

Respiratory 13

Immunologic 5

Miscellaneous 44

Table 1. Clinical entities concerned by primary genetic mitochondrial disorders.Clinical entities are classified and phenotypes collected for each mitochondrial disease-causing gene according to MitoPhenome. Turnbull & Rustin, 2015

Elevata eterogeneità clinica delle malattie mitocondriali



Targeted resequencing

< €€€ , < Time > ANSWERS

TruSeq Custom Amplicon (Illumina)

1 run= 7Gbasi di dati =7 000 000 000 bp

Pochi geni per tanti pazienti

Tanti geni per pochi pazienti

- minimo 16 massimo 1536 ampliconi (≈80-100 geni) tramite DesignStudio

- Target resequencing basato su PCR, Kit da 96 campioni

Pannello Mitoiso (difetti isolati, PDH, CoQ10)

72 geni (492 esoni; 1195 ampliconi)

Pannello Mitomix (difetti multipli)


Malattie mitocondrialiGeni analizzati per diagnostica: 45Pz/mese: 40-50

Pannello MitoisoB (difetti isolati, PDH, MMDS, CoQ10)


Pannello MitomixB (difetti multipli, alterazioni mtDNA)


Pannello Mitoiso (difetti isolati, PDH, CoQ10)


Pannello Mitomix (difetti multipli)


Eterogeneità genetica: cI

NDUFV1 Complex I Leukodystrophy, myoclonus, Leigh syndrome

NDUFV2 Complex I Cardiomyopathy, encephalopathy

NDUFS1 Complex I Leigh syndrome

NDUFS2 Complex I Lactic acidosis, hypertrophic cardiomyopathy


NDUFS4 Complex I Atypical Leigh syndrome

NDUFS6 Complex I Fatal infantile lactic acidosis



NDUFA1 Complex I Leigh syndrome



NDUFA11 Complex I Fatal infantile metabolic acidosis, encephalocardiomyopathy

NDUFB3 Complex I Fatal infantile encephalomyopathy

NDUFB9 Complex I Infantile encephalomyopathy

Subunità strutturali complesso IEterogeneità genetica: cI

NDUFAF1 Complex I assembler Cardiomyopathy

NDUFAF2 Complex I assembler Progressive encephalopathy, Leigh syndrome

NDUFAF3 Complex I assembler Myoclonic seizures, brain leukomalacia

NDUFAF4 Complex I assembler Encephalopathy, antenatal cardiomyopathy

NDUFAF5 Complex I assembler Leigh syndrome

NDUFAF6 Complex I assembler Leigh syndrome

NUBPL Complex I assembler, Fe/S clusters biogenesis

Leukodystrophy, myopathy, ataxia

FOXRED1 Complex I assembler, aminoacid metabolism? Leigh syndrome

ACAD9 Complex I assembler Cardiomyopathy, encephalopathy, lactic acidosis

Fattori di assemblaggio del complesso IEterogeneità genetica: cI

TSCA24 pz con difetto biochimico cI

NDUFA1, NDUFA10, NDUFS2,NDUFS3, NDUFS4 (2), NDUFV1ACAD9ELAC2

38%

Exome seq22 pz con difetto biochimico cI

NDUFV1, NDUFV2, NDUFS4, NDUFS6, NDUFA12TMEM70, ELAC2FBXL4, VARS2, COQ4

45%

18%

Eterogeneità genetica: cI

Eterogeneità clinica: AIFM1

Patient XAt 1 year walking difficulties. During childhood gait and limb ataxia, hearing loss, and cognitive impairment At puberty, evident visual deficit and distal muscle wasting and weaknessOptic atrophy and retinopathyAt 20 years chair-bound

Nerve conduction study showed axonal neuropathyOnly one (13 yrs) of several assays showed elevated lactate and pyruvate serum levels.

Brain CT scan and MRI: cerebellar atrophy (19 yrs) and mild cortical and thalamic atrophy (30 yrs), then (35 yrs) further involvement of bulbar olives, dentate nuclei and spinal cord.

Pt

Complex IV deficiency in muscle

94x

ChrX

Pt

c.784A

c.784G/A

c.784G/G

AIFM1c.784G>A p.Gly262Ser

Species Amino acid numbering and sequenceH.sapiens 249-298 SQITYEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRSLEK--IM.mulatta 245-294 SQITYEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRSLEK--IC.lupus 249-298 SQITYEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRTLEK--IM.musculus 248-297 SQITFEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRALEK--IR.norvegicus 248-297 SQITFEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRALEK--IG.gallus 227-276 TQISYDKCLIATGGSPRNLPAIERAGKEVQQRLTLFRKIEDFKNLEK--ID.rerio 251-300 SEISYEKCLIATGGVPRNLQVIDRAGEEVIKRTTLFRKIEDFRSLEK--IX.tropicalis 271-320 TQISYEKCLIATGGVPRSLPAIERAGEEVTKRTTLFRRISDFRTLEA--I

ct1 ct3ct2 Pt

AIF

GAPDH

129% 99% 72% 41%

WB analysis(fibroblasts)


c.601_603del; p.Arg201delPsychomotor delay, seizures and psychomotor regressionMuscle: multiple defects, mainly IV

c.923G>A; p.Gly308Gluhypotonia, swallowing difficulties, neonatal seizures. Cardiopulmonary failureMuscle: cIV + cI

c.1478A>T; p.Glu493ValSlow progressive axonal neuropathy associated with cognitive impairmentMuscle: normal


Anna Ardissone, MD1,*, Giuseppe Piscosquito, MD2,*, Andrea Legati, PhD3, Tiziana Langella, MSc3, Eleonora Lamantea, MSc3, Barbara Garavaglia, PhD3, Ettore Salsano, MD1, Laura Farina, MD4, Isabella Moroni, MD1, Davide Pareyson, MD2, Daniele Ghezzi, PhD3

c.784G>A; p.Gly262SerSensory and cerebellar ataxia, hearing and visual loss, muscle wasting Muscle: cIV

c.727G>T; p.Val243LeuProgressive muscular atrophy, ataxia, hearing loss and external opthalmoplegiaMuscle: cI (+II, IV)

c.1013G>A; p.Gly338GluPerinatal marked hypotonia-proximal muscle weakness (SMA-like); cortical and motor neuron involvementMuscle: cIV


Targeted resequencing

Aspetti positivi:- Possibilità analisi di molti geni contemporaneamente

- Buona copertura

- Applicabile ad un numero elevato di pazienti

Exome sequencing

Aspetti negativi:- Analisi solo dei geni presenti

- Copertura geni presenti non completa

- Strumentazione (hardware/software) dedicata



TRS< €€€ , < Time > ans

CollaborazioniMassimo Zeviani, Aurelio Reyes, Alan Robinson (MRC Cambridge, UK)Holger Prokisch, Tobias Haack, Thomas Meitinger (Helmoltz Center, Munich, Germany)Mingyan Fang (BGI, Shenzen, China)E. Baruffini, C. Dallabona, I. Ferrero (Università di Parma)R. Costa, C. DePittà, F. Argenton (Università di Padova) I. Moroni, A. Ardissone, G. Piscosquito, D. Pareyson (Istituto Neurologico “Besta”)E. Bertini, D. Diodato (Osp. Pediatrico Bambin Gesù, Roma), A. Burlina (Università di

Padova), M.A. Donati (Osp. Meyer, Firenze), R. Parini (Osp. San Gerardo, Monza)M. Van der Knaap (University Medical Center, Amsterdam), R. Taylor (University of Newcastle, UK)

www.mitopedia.org

Grazie! Ministero della Salute

Exome seq

Lievito

Clinici

Drosophila

Vantaggi:- Sistema molto flessibile

- Dinamico (implementabile con nuovi geni)

- basso costo per paziente (200-300 €)

- high troughput: possibilità di screening di molti geni

Svantaggi:- ottimizzazione manuale del disegno

- non copre al 100% tutti i geni

- elevato investimento iniziale (x 96 campioni 10.000-25.000 €)

- necessità di interpretazione e validazione di molte varianti nuove di significato incerto

TruSeq Custom Amplicon (Illumina)

vs. Sanger

Sonde Nextera (Illumina)

Vantaggi:- no limiti geni analizzabili

- costo competitivo (250-400 €)

- maggior copertura

Svantaggi:- analizzati anche geni non «appropriati»

- investimento iniziale

- copertura non uniforme

vs. TSCA

https://www.google.it/url?q=http://www.translucenza.it/translucenza-nucale-nt/vantaggi-e-svantaggi-screening/&sa=U&ei=SRR7U-ncLI_Q4QTogYHoBg&ved=0CDYQ9QEwBA&usg=AFQjCNEAbFapZ2StNvs11xoafCCQRn7-9Q

https://www.google.it/url?q=http://www.translucenza.it/translucenza-nucale-nt/vantaggi-e-svantaggi-screening/&sa=U&ei=SRR7U-ncLI_Q4QTogYHoBg&ved=0CDYQ9QEwBA&usg=AFQjCNEAbFapZ2StNvs11xoafCCQRn7-9Q

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