Post on 01-May-2015
By NA
Citogenetica II
La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l’analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith
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La CML è stata la prima malattia neoplastica dell’uomo in cui una specifica anomalia del cariotipo, il cromosoma Philadelphia (Ph), sia stata associata alla insorgenza della leucemia.
CML, Leucemia Mieloide Cronica
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cromosoma non normale
chr Philadelphia (1961)
Nel 95% dei casi di CML
Indagini FISH E MOLECOLARI
SI FORMANO DUE GENI DI FUSIONE:- ABL-BCR su DER9 (nessuna proteina prodotta)- BCR-ABL su Ph (proteina di fusione coinvolta nella proliferazone cellulare)
ABL
BCR
ABL/BCR
BCR/ABL
CML, Leucemia Mieloide Cronica
Traslocazione reciproca braccio lungo chr.9 e il braccio lungo chr.22: t(9;22)(q34;q11).
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(Ph)
FISH nella CML 3 spot
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(Ph)
FISH nella CML colocalizzazione
By NA
FISH nella CML 4 spote colocalizzazione
By NA
CML esempi
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CML esempi
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INVERSIONE inv(16)(p13;q22) (CBFB-MYH11)
AML, Leucemia Mieloide Acuta
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AML, Leucemia Mieloide Acuta
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Esempio dell’uso di librerie totali per evidenziare riarrangiamenti
Traslocazioni complesse in AML
t(8;13;14)
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La traslocazione t(15;17)(q22;q21) è associata clinicamente alla leucemia acuta promielocitica (APL)
Leucemia Acuta Promielocitica (APL) geni coinvolti PML-RAR)
In verde chr17In rosso chr15
15 der15 der17 17
By NA
t(15;17)(q22;q21)
La FISH permette di trovare traslocazioni criptiche (quelle che non si vedono dall’analisi del cariotipo)
Leucemia Acuta Promielocitica (APL)
15 der15 der17 17
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t(8;14)
Linfomi Non Hodgkin
by GP&NA
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TRASLOCAZIONE t(14;18)(q32;q21)Linfomi Non Hodgkin
catene pesanti
immunoglobuline
oncogeneBCL2
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Caso I
Paziente 38enne all’inizio della gravidanza decide di ricorrere alla diagnosi prenatale sotto indicazione del consulente genetico che l’ha informata dell’aumentato rischio di aneuploidie cromosomiche fetali nelle madri con età avanzata.
Due precedenti gravidanze dalle quali ha avuto due figli fenotipicamente normali.
Assenza di aborti spontanei.
traslocazione reciproca t (13;19) nel feto
traslocazione reciproca t (13;19) nel padre
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Procedura diagnostica
ANALISI CITOGENETICA:
campione di liquido amniotico aspirato con l’amniocentesi;
allestimento del preparato citogenetico e analisi del cariotipo;
traslocazione reciproca t (13;19) nel feto
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campione di sangue periferico di entrambi i genitori ;
allestimento del preparato citogenetico e analisi del cariotipo;
Procedura diagnostica
traslocazione reciproca t(13;19) nel padre
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Evidenziare i breakpoints mediante la FISH I
13.3
13.2
13.1
12
12
13.1
13.2
13.3
13.4
13
der(19)
19
13
12
11.2
12
13
14
21
22
31
32
33
34
13.3
13.2
13.1
12
12
13.1
13.2
13.3
13.4
19
14
21
22
31
32
33
34
13
12
11.2
12
13
14 13.3
der(13)
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Evidenziare i breakpoints mediante la FISH II
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Evidenziare i breakpoints mediante la FISH III
Dopo aver individuato la regione sul cromosoma 13 e sul 19 presumibilmente coinvolta nella traslocazione, selezionare i corrispondenti BAC da utilizzare per la FISH.
individuare i BAC che vengono tagliati dal breakpoint; in questo caso dovrei avere tre tre segnalisegnali: uno sul cromosoma normale e un segnale su ciascun derivativo.
per abbreviare i tempi si puo’ eseguire una coibridazione marcando contemporaneamente due o tre sonde di DNA con diversi fluorocromi.
Cy3Cy3
Fluor-XFluor-X
Cy5Cy5
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Evidenziare i breakpoints mediante la FISH IV
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Evidenziare i breakpoints mediante la FISH V
RP11-84C17
RP11-298C17
RP11-19I2
chr19:7,777,647-777,8013
chr19:9,998,865-10,195,739
chr19:11,643,368-11,816,255
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Evidenziare i breakpoints mediante la FISH VI
Il breakpoint sul cromosoma 19 è situato tra la sonda prossimale RP11-52O9 e la sonda distale RP11-717H11.
der(13)chr 19
der(19)chr 19
chr19:6,726,912-6,917,544
chr19:7,163,629-7,377,296
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Evidenziare i breakpoints mediante la FISH VII
13.3
13.2
13.1
12
12
13.1
13.2
13.3
13.4
RP-1152O9
RP11-717H11
RP11-717H11
13
12
11.2
12
13
14 13.3
RP-1152O9
der(13)der(19)
19
13.3
13.2
13.1
12
12
13.1
13.2
13.3
13.4
19
14
21
22
31
32
33
34
By NA
Evidenziare i breakpoints mediante la FISH VIII
By NA
Evidenziare i breakpoints mediante la FISH IX
By NA
Evidenziare i breakpoints mediante la FISH X
La sonda RP11-976L2 emette fluorescenza sul cromosoma 13 e sul der(13) (freccia rossa).
La sonda RP11-1140C18 emette invece tre segnali : sul cromosoma 13, sul der(19) (freccia verde) e sul der(13) (freccia verde).
IL BREAKPOINT SUL CROMOSOMA 13 CADE ALL’INTERNO DEL BAC 1140C18
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Evidenziare i breakpoints mediante la FISH XI
13
12
11.2
12
13
14
21
22
31
32
33
34
13.3
13.2
13.1
12
12
13.1
13.2
13.3
13.4
19
14
21
22
31
32
33
34
13
12
11.2
12
13
14 13.3RP11-1140C18
RP11-1140C18RP11-976L2
By NA
Evidenziare i breakpoints mediante la FISH
Dopo aver individuato la regione sul cromosoma 13 e sul 19 presumibilmente coinvolta nella traslocazione, selezionare i corrispondenti BAC da utilizzare per la FISH.
individuare i BAC che vengono tagliati dal breakpoint; in questo caso dovrei avere tre segnalitre segnali: uno sul cromosoma normale e un segnale su ciascun derivativo.
per abbreviare i tempi si puo’ eseguire una coibridazione marcando contemporaneamente due o tre sonde di DNA con diversi fluorocromi.
Cy3Cy3
Fluor-XFluor-X
Cy5Cy5
By NA
Evidenziare i breakpoints mediante la FISH
Dopo aver individuato la regione sul cromosoma 13 e sul 19 presumibilmente coinvolta nella traslocazione, selezionare i corrispondenti BAC da utilizzare per la FISH.
individuare i BAC che vengono tagliati dal breakpoint; in questo caso dovrei avere tre segnalitre segnali: uno sul cromosoma normale e un segnale su ciascun derivativo.
per abbreviare i tempi si puo’ eseguire una coibridazione marcando contemporaneamente due o tre sonde di DNA con diversi fluorocromi.
Cy3Cy3
Fluor-XFluor-X
Cy5Cy5