Post on 01-May-2015
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Flusso dell’informazione genetica
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Trascrizione dell’RNA (1)
La trascrizione è catalizzata dalla “RNA polimerasi diretta dal DNARNA polimerasi diretta dal DNA” con un meccanismo molto simile alla DNA polimerasi Differenze con la DNA polimerasi: non ha bisogno del primer non ha una efficace attività di
proofreading
Topoisomerasi
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Trascrizione dell’RNA (2)
Per convenzione la sequenza di riferimento utilizzata per indicare una gene è quella non-stampo (detta impropriamente codificante). In realtà la catena che
codifica per l’RNA è quella che va in direzione 5’→3’
In alcuni virus (es: adenovirus) entrambe la catene codificano proteine
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Trascrizione dell’RNA (3)
Il corretto posizionamento dalla RNA polimerasi sulla catena
stampo è guidato da specifiche “sequenze consensosequenze consenso” denominate “promotoripromotori”
Promotori eucariotici Promotori procariotici
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Trascrizione dell’RNA nei procarioti (1)
Le fasi della trascrizione (E. coli)
Fase di inizioInizio della trascrizione; dopo 8-9 nucleotidi sintetizzati viene rilasciata la subunità sigma ( .Prosecuzione della sintesi dell’RNA
Il sito di inizio della trascrizione è finemente regolato ( vedi lac operon)
Fase di legameInterazione RNA polimerasi con il promotore
(complesso chiuso)Svolgimento del DNA da -10 a + 3 o +5
(complesso aperto)
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Fase di terminazione
Trascrizione dell’RNA nei procarioti (2)
indipendente Formazione nella regione terminale
di un ibrido DNA-RNA instabile ibrido DNA-RNA instabile per la presenza di molte coppie A=U
Formazione di una struttura a struttura a “forcina”“forcina” per la presenza di nucleotidi complementari che destabilizzano definitivamente l’ibrido DNA-RNA con conseguente rilascio dell’mRNA trascritto
dipendentePresenza di una proteina proteina con attività elicasica che promuove il distacco dell’ RNA dal DNA
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Trascrizione dell’RNA negli eucariotiLa trascrizione negli eucarioti è molto complessa e ancora non ben chiarita
Tre RNA polimerasiRNA polimerasi I (Pol I): sintesi pre-rRNARNA polimerasi II (Pol II): sintesi mRNA
12 subunità 6 fattori di inizio 4 fattori di allungamento
RNA polimerasi III (Pol III): sintesi tRNA, rRNA 5S
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Inibitori della trascrizione
L’actinomicina D e l’acridinasono due antibiotici antibiotici che agiscono sia nei batteri che negli eucarioti. La parte colorata planare si lega tra due successivi appaiamenti G≡C del DNA provocando una deformazione che non permette dalla RNA polimerasi di trascrivere.
L’-amanitina , presente nel fungo Amanita phalloides, inibisce fortemente la Pol II causando la morte degli organismi animali.
La rinfamicina si lega alla RNA polimerasi batterica impedendo la trascrizione(antibatterico)
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Trascrizione procarioti & eucarioti (1)
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Trascrizione procarioti & eucarioti (2)
mRNA procariotico
mRNA eucariotico
Prevalentemente policistronico
Prevalentemente monocistronico
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Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (1)
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Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (2)
“Incappucciamento” dell’mRNA
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Poliadenilazione (inserimento della “coda”)
Formazione del legame tra la sequenza segnale (AAUAAAAAUAAA)e il complesso enzimatico
Scissione in una posizione tra 11 a 30 nucleotidi da AAUAAA
Sintesi della coda poli(A) lunga da 80 a 250 nucleotidi
Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (3)
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Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (4)
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Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (5)
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Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (6)
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Modificazioni post-trascrizionali del rRNA
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Modificazioni post-trascrizionali del tRNA
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Attività catalitica dell’RNA (Ribozimi)
L’esistenza di RNA catalitici e l’interconversione di RNA a DNA
(vedi retrovirus con trascrittasi inversa) hanno portato all’ipotesi che la prima fase
dell’evoluzione biologica sia stata la comparsa dell’RNA (o di un polimero equivalente) in
grado di catalizzare la sua stessa replicazione
Bibliografia:Bittker,J.A., et. al. Curr. Opin.Chem.Biol. 6, 367-374 (2002)
Johston, W.K, et al. Science, 292, 1319-1325 (2001)
Joyce, G. E. Nature, 418,214-221 (2002)
Wilson, D.S. et al. Annu.Rev.Biochem. 68,611-648 (1999)
Yarus, M. Ann. Rev. Genet, 36, 125-151 (2002)
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Sintesi RNA e DNA, dipendente dall’RNA
Espansione del dogma centrale della biologia
per includere la sintesi RNA-dipendente
di RNA e DNA
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Retrovirus & trascrittasi inversa (1)
I retrovirus hanno una DNA polimerasi dipendente dall’RNA (“trascrittasi inversa”) che produce DNA a partire dal loro RNA
RNA virale
Ibrido RNA-DNA
cDNA (DNA complementare)
trascrittasi inversa
trascrittasi inversa
Integrazione nel DNA della cellula ospite
integrasi
Le trascrittasi inverse sono diventate importanti nel clonaggio molecolare in quanto rendono possibile la sintesi in
laboratorio a partire dall’RNA (DNA complementare, cDNA)
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Retrovirus & trascrittasi inversa (2)
Le trascrittasi inverse non hanno attività esonucleasica
3’→5’ con funzione “proofreading”Ciò comporta una frequenza di
errore di 1 ogni 20.000 nucleotidiaggiunti con conseguente continua
mutazione del virus
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Retrovirus & cancroGenoma del sarcoma di Rous (o aviario)
In seguito a ricombinazione con il genoma di un retrovirus e
successive mutazioni, si possono generare degli oncogenioncogeni (evento raro)
codificanti per proteine che provocano una incontrollata
riproduzione cellulare (tumore)
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Retrovirus & AIDS
Genoma dell’HIV
“geni sovrapposti”
Piccolo genoma (9,7x10-6 nucleotidi) che grazie a meccanismi di “splicing alternativo” causano la produzione di molte proteine diverse
Analogo
Chemioterapia con analoghi purinici e pirimidinici
L’analogo viene somministrato come
base libera o nucleoside(pro-farmacopro-farmaco) perche il
nucleotide farmacologicamente attivo
essendo carico nonriesce ad attraversare la
membrana biologica
RNA DNA
CTP
dUDP
dCTP
CMP UMP
UDP
UTP
dCMP
dCDP
dUTP
dUMP
dTMP dAZTMP
dTDP dAZTDP
dTTP dAZTTP
CDP
CR UR CdR UdR TdR AZTdR
U T
Membrana cellulare
●
H2O NH3 H2O NH3
de novoAZT3’-azido-2’,3’-dideossi-timidina (AZTAZT)
Azione farmacologica dell’AZT
OHO-CH2
HH
H
HH
Timina
N=N=N⊕ ⊖