1

Flusso dell’informazione genetica

2

Trascrizione dell’RNA (1)

La trascrizione è catalizzata dalla “RNA polimerasi diretta dal DNARNA polimerasi diretta dal DNA” con un meccanismo molto simile alla DNA polimerasi Differenze con la DNA polimerasi: non ha bisogno del primer non ha una efficace attività di

proofreading

Topoisomerasi

3

Trascrizione dell’RNA (2)

Per convenzione la sequenza di riferimento utilizzata per indicare una gene è quella non-stampo (detta impropriamente codificante). In realtà la catena che

codifica per l’RNA è quella che va in direzione 5’→3’

In alcuni virus (es: adenovirus) entrambe la catene codificano proteine

4

Trascrizione dell’RNA (3)

Il corretto posizionamento dalla RNA polimerasi sulla catena

stampo è guidato da specifiche “sequenze consensosequenze consenso” denominate “promotoripromotori”

Promotori eucariotici Promotori procariotici

5

Trascrizione dell’RNA nei procarioti (1)

Le fasi della trascrizione (E. coli)

Fase di inizioInizio della trascrizione; dopo 8-9 nucleotidi sintetizzati viene rilasciata la subunità sigma ( .Prosecuzione della sintesi dell’RNA

Il sito di inizio della trascrizione è finemente regolato ( vedi lac operon)

Fase di legameInterazione RNA polimerasi con il promotore

(complesso chiuso)Svolgimento del DNA da -10 a + 3 o +5

(complesso aperto)

6

Fase di terminazione

Trascrizione dell’RNA nei procarioti (2)

indipendente Formazione nella regione terminale

di un ibrido DNA-RNA instabile ibrido DNA-RNA instabile per la presenza di molte coppie A=U

Formazione di una struttura a struttura a “forcina”“forcina” per la presenza di nucleotidi complementari che destabilizzano definitivamente l’ibrido DNA-RNA con conseguente rilascio dell’mRNA trascritto

dipendentePresenza di una proteina proteina con attività elicasica che promuove il distacco dell’ RNA dal DNA

7

Trascrizione dell’RNA negli eucariotiLa trascrizione negli eucarioti è molto complessa e ancora non ben chiarita

Tre RNA polimerasiRNA polimerasi I (Pol I): sintesi pre-rRNARNA polimerasi II (Pol II): sintesi mRNA

12 subunità 6 fattori di inizio 4 fattori di allungamento

RNA polimerasi III (Pol III): sintesi tRNA, rRNA 5S

8

Inibitori della trascrizione

L’actinomicina D e l’acridinasono due antibiotici antibiotici che agiscono sia nei batteri che negli eucarioti. La parte colorata planare si lega tra due successivi appaiamenti G≡C del DNA provocando una deformazione che non permette dalla RNA polimerasi di trascrivere.

L’-amanitina , presente nel fungo Amanita phalloides, inibisce fortemente la Pol II causando la morte degli organismi animali.

La rinfamicina si lega alla RNA polimerasi batterica impedendo la trascrizione(antibatterico)

9

Trascrizione procarioti & eucarioti (1)

10

Trascrizione procarioti & eucarioti (2)

mRNA procariotico

mRNA eucariotico

Prevalentemente policistronico

Prevalentemente monocistronico

11

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (1)

12

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (2)

“Incappucciamento” dell’mRNA

13

Poliadenilazione (inserimento della “coda”)

Formazione del legame tra la sequenza segnale (AAUAAAAAUAAA)e il complesso enzimatico

Scissione in una posizione tra 11 a 30 nucleotidi da AAUAAA

Sintesi della coda poli(A) lunga da 80 a 250 nucleotidi

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (3)

14

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (4)

15

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (5)

16

Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (6)

17

Modificazioni post-trascrizionali del rRNA

18

Modificazioni post-trascrizionali del tRNA

19

Attività catalitica dell’RNA (Ribozimi)

L’esistenza di RNA catalitici e l’interconversione di RNA a DNA

(vedi retrovirus con trascrittasi inversa) hanno portato all’ipotesi che la prima fase

dell’evoluzione biologica sia stata la comparsa dell’RNA (o di un polimero equivalente) in

grado di catalizzare la sua stessa replicazione

Bibliografia:Bittker,J.A., et. al. Curr. Opin.Chem.Biol. 6, 367-374 (2002)

Johston, W.K, et al. Science, 292, 1319-1325 (2001)

Joyce, G. E. Nature, 418,214-221 (2002)

Wilson, D.S. et al. Annu.Rev.Biochem. 68,611-648 (1999)

Yarus, M. Ann. Rev. Genet, 36, 125-151 (2002)

20

Sintesi RNA e DNA, dipendente dall’RNA

Espansione del dogma centrale della biologia

per includere la sintesi RNA-dipendente

di RNA e DNA

21

Retrovirus & trascrittasi inversa (1)

I retrovirus hanno una DNA polimerasi dipendente dall’RNA (“trascrittasi inversa”) che produce DNA a partire dal loro RNA

RNA virale

Ibrido RNA-DNA

cDNA (DNA complementare)

trascrittasi inversa

trascrittasi inversa

Integrazione nel DNA della cellula ospite

integrasi

Le trascrittasi inverse sono diventate importanti nel clonaggio molecolare in quanto rendono possibile la sintesi in

laboratorio a partire dall’RNA (DNA complementare, cDNA)

22

Retrovirus & trascrittasi inversa (2)

Le trascrittasi inverse non hanno attività esonucleasica

3’→5’ con funzione “proofreading”Ciò comporta una frequenza di

errore di 1 ogni 20.000 nucleotidiaggiunti con conseguente continua

mutazione del virus

23

Retrovirus & cancroGenoma del sarcoma di Rous (o aviario)

In seguito a ricombinazione con il genoma di un retrovirus e

successive mutazioni, si possono generare degli oncogenioncogeni (evento raro)

codificanti per proteine che provocano una incontrollata

riproduzione cellulare (tumore)

24

Retrovirus & AIDS

Genoma dell’HIV

“geni sovrapposti”

Piccolo genoma (9,7x10-6 nucleotidi) che grazie a meccanismi di “splicing alternativo” causano la produzione di molte proteine diverse

Analogo

Chemioterapia con analoghi purinici e pirimidinici

L’analogo viene somministrato come

base libera o nucleoside(pro-farmacopro-farmaco) perche il

nucleotide farmacologicamente attivo

essendo carico nonriesce ad attraversare la

membrana biologica

RNA DNA

CTP

dUDP

dCTP

CMP UMP

UDP

UTP

dCMP

dCDP

dUTP

dUMP

dTMP dAZTMP

dTDP dAZTDP

dTTP dAZTTP

CDP

CR UR CdR UdR TdR AZTdR

U T

Membrana cellulare

●

H2O NH3 H2O NH3

de novoAZT3’-azido-2’,3’-dideossi-timidina (AZTAZT)

Azione farmacologica dell’AZT

OHO-CH2

HH

H

HH

Timina

N=N=N⊕ ⊖