LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI e LE SUE … · 2009. 3. 6. · LA REAZIONE A CATENA DELLA...
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PPolymerase olymerase CChain hain RReactioneaction
LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI e LE SUE
APPLICAZIONI
Prima diagnosi molecolare sul DNA
*Primo ormone umano ricombinante (insulina)*Premio Nobel agli scopritori degli enzimi di restrizione*Identificato l’AIDS*Prodotto il depakene (epilessia)*Prima bambina in provetta (Luise)*Appare sul mercato l’Apple Computer ed i floppy disk
1978
Com’era l’analisi genetica Com’era l’analisi genetica prima della PCR?prima della PCR?
� Il Southern blotting (1975) permetteva un’analisi approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni & delezioni)
� Il sequenziamento del DNA (1978) richiedeva che I geni venissero prima clonati in appositi vettori (plasmidi o fago l)
� La costruzione di genoteche e lo screening potevano richiedere molti mesi e le genoteche dovevano essere preparate per ciascun individuo analizzato
L’invenzione della PCRL’invenzione della PCR
� Ideata da Kary Mullis nel 1983
� La prima pubblicazione è apparsa nel 1985
� Premio Nobel per la chimica nel 1995
Descritta la reazione di PCR
1985Parte il progetto genoma umano
La PCR La PCR rappresentarappresenta la la secondaseconda rivoluzionerivoluzione
nellenelle tecnichetecniche didi manipolazionemanipolazione del DNAdel DNA
E’ E’ essenzialmenteessenzialmente unauna tecnicatecnica didi
amplificazioneamplificazione del DNAdel DNA
LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI
Mullis & Faloona 1988
È possibile generare grandi quantità di DNA target anche se il numero di partenza delle sue copie è molto basso
Attualmente è possibile analizzare praticamente ogni tipo di campione, anche nel caso in cui contenga DNA degradato
La PCR è un procedimento mediante il quale è possibile ottenere molte copie di una determinata regione del DNA (sia nucleare chemitocondriale)
È necessario conoscere la sequenza delle regioni che fiancheggiano il tratto di DNA che si vuole studiare, per disegnare i PRIMERS (tratti di DNA di circa 20-30 nucleotidi complementari alle regioni fiancheggianti, senza i quali non è possibile effettuare una PCR)
Cos’è la PCRCos’è la PCRE’ la sintesi progressiva ed esponenziale di un
definito segmento di DNA targhet in vitro.Più semplicemente da pochi frammenti targhet
di partenza ne ottengo una grande quantità.
Cos’èCos’è la PCR? : la PCR? :
E’ chiamata “Polymerase” perchè l’unicoenzima utilizzato nella reazione è la DNA polimerasi.
E’ chiamata “Chain” a catena perchè ilprodotto della prima reazione diventa ilsubstrato per la seguente e così via.
Cos’èCos’è la PCR? : la PCR? : componenticomponenti
1) Stampo DNA (Target) – contiene la sequenza daamplificare.
2) Coppia di Primers – due oligonucleotidi disegnati sullasequenza da amplificare. Segmenti complementari a due regioni che si trovano su filamenti opposti del dna stampo ai lati della regione targhet.
3) dNTPs – desossinucleotidi trifosfati: I 4 mattoni checostituiscono il DNA.
4) DNA Polimerasi termostabile – enzima che catalizza la reazione (non viene denaturata se portata a 95° c)5) Ioni Mg++ - cofattori dell’enzima
6) Soluzione Buffer – mantiene le condizioni ideali per l’ativitàenzimatica in particolare il pH e la concentrazione ionica.
� Synthesis by DNA polymerase
-A T G C A T G C A T G C * *
T A C G T AA C G-T5’ 3’
Uno Uno specificospecifico DNA a DNA a singolasingola elicaelica (primer o (primer o innescoinnesco) ) ibridaibrida con con l’elical’elica cheche devedeve essereesserecopiatacopiata
Taq polimerasi
DNA
Nucleotidi 4 Primer F+RddH20
BufferMg++
1- DENATURAZIONE (DENATURATION): TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO
2-APPAIAMENTO (ANNEALING) : TEMP. 50-60°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO
3- SINTESI (EXTENSION): TEMP. 72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI
IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN
CERTO NUMERO DI CICLI. CERTO NUMERO DI CICLI.
Ogni ciclo consiste di 3 passaggi condotti ad una specifica Ogni ciclo consiste di 3 passaggi condotti ad una specifica
temperatura:temperatura:
ThermociclatroreThermociclatrore, ,
AppliedBiosystemsAppliedBiosystems
TuboTubo dadaPCRPCR
Come funziona la PCRCome funziona la PCR
� Come fa la polimerasi a sapere quando fermarsi una volta che ha raggiunto l’altro primer?
� PCR animation
Quanto è potente la PCR?Quanto è potente la PCR?
� La PCR può amplificare fino ad ottenere una quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in meno di 2 ore
� Lo stampo di DNA non necessita di particolarepurificazione se il frammento da amplificare è di dimensioni ridotte (fino a 1000bp)
� Il prodotto della PCR può essere digerito con enzimi di restrizione, sequenziato o clonato
� La PCR può amplificare una singola molecola di DNA (es. uno spermatozoo)
Quante copie?Quante copie?
� Nessun prodotto fino al 3° ciclo
� L’accumulazione non è un raddoppiamento completo dopo ciascun ciclo
� Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere max 1,073,741,764 copie di lunghezza
definita (~1×109)
PROBLEMI
POSSIBILITA’ DI CONTAMINAZIONEFRA CAMPIONI
POSSIBILI SOLUZIONI:- utilizzo di particolari procedure e precauzioni
AMPLIFICAZIONE DI ZONE NON SPECIFICHE: i primers si legano anche a sequenze lontane dal DNA stampo.
POSSIBILI SOLUZIONI:- variazione della concentrazione di MgCl2;- variazione della temperatura di annealing
AMPLIFICAZIONE PREFERENZIALE DI UN ALLELE (drop out) IN UN ETEROZIGOTE
POSSIBILI SOLUZIONI:- ripetizione della reazione di amplificazione
?
?
?
?
PCR PCR problematicheproblematiche
� Contaminazioni– In fase di campionamento– Durante il trasporto– In laboratorio in fase d’analisi da altri
campioni� Il controllo negativo è utilizzato per
identificarle� I Primers non sono abbastanza specifici
– Fare ulteriori prove– Ottimizzare le condizioni
PCRPCRVANTAGGI:� Sensibilita’
� Rapidita’
� Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)
� Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stessocampione
� Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani
SVANTAGGI:� Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)
� Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza
� Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messaa punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)
� Può sintetizzare frammenti relativamente corti
� La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq polnon possiede attività 3’->5’ esonucleasica)
EsempiEsempi di di utilizzoutilizzo delladella PCRPCR� Su DNA:
– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche(mutazioni, inserzioni) -> DIAGNOSTICA
– Amplificare frammenti specifici da usare in seguitocome sonde oppure da “clonare”
� Su RNA messaggero (RT-PCR):– segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA
(espressione genica)
– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito
come sonde oppure da “clonare” - isolare cDNA
specifici per determinati geni.
Grazie alla presenza dei gruppi fosfato
(PO43-) il DNA è carico
negativamente e migrerà quindi verso il
polo positivo
Come Come verificareverificare se la PCRse la PCR
ha ha funzionatofunzionato??
ElettroforesiElettroforesi susu gel: gel: visualizzazionevisualizzazione direttadiretta delledelle molecolemolecoleseparazioneseparazione orizzontaleorizzontale ----> > AgarosioAgarosio = DNA ed RNA= DNA ed RNA
Il DNA Il DNA coloratocolorato con con bromurobromuro didi etidioetidioemetteemette unauna fluorescenzafluorescenza didi colorecolore rossorosso--arancioarancio se se sottopostosottoposto a a luceluce UVUV
VERIFICA SU GEL DI AGAROSIO
DNA
2000
1500
1000
500
200
LA PCR HA DATO
IL RISULTATO
SPERATO:
E’ stata amplificata
solo la sequenza target
LA PCR NON E’ VENUTA
BENE, BISOGNA
METTERLA A PUNTO:
Oltre alla sequenza target
sono stati amplificati anche
altri frammenti (aspecifici)
2000
1500
1000
500
200
� Marcatore genetico è una qualsiasi
caratteristica degli organismi che è’
variabile nelle popolazioni e che è
ereditabile, cioè determinata dai geni e non
dall'ambiente (Es: colore degli occhi,
gruppo sanguigno, bande su un gel).
I marcatori molecolariI marcatori molecolari
Caratteristiche ideali di un marcatore genetico:Caratteristiche ideali di un marcatore genetico:
� Polimorfico
� Avere un'espressione stabile (non influenzata dall'ambiente, da altri geni, ecc.)
� Disperso nel genoma
� Di facile determinazione o facile osservazione (basso costo in termini di denaro, tempo ed energie)
� Ereditabile in modo semplice (mendeliano o uniparentale)
� Codominante
� Riproducibile entro e fra diversi laboratori
� Determinabile con metodologia applicabile a molte specie diverse
Il SEQUENZIAMENTO del DNA MITOCONDRIALE (mtDNA)
Svantaggi. Si ottengono informazioni solo sulla linea materna, è
possibile amplificare copie nucleari che portano a risultati errati
Vantaggi. Metodo veloce, preciso, relativamente economico, necessita
di piccole quantità di DNA, solitamente il DNA target è conosciuto (già
depositato nella banca dati genetica) e mediamente polimorfico
Ereditarietà
Ibridazione
Riconoscimento dei singoli individui
Parentele
Variabilità
Uniparentale (per via materna)
Parziale NO
NO
Bassa-Alta
Caratteristiche
Tassonomia Sì
Quantità Elevato numero di copie per cellula
Utilizzo
Filogenesi Sì
MICROSATELLITI (Short Tandem Repeats)Tautz 1989
Svantaggi. L’isolamento di microsatelliti specie specifici può richiedere
un lavoro di laboratorio di molti mesi, primers cross-specifici spesso non
sono disponibili. Sono necessarie le frequenze alleliche delle popolazioni di
riferimento per utilizzare test statistici di assegnamento individuale
Vantaggi. Metodo veloce, preciso, relativamente economico, necessita
di piccole quantità di DNA, il DNA target è altamente polimorfico
Caratteristiche
Variabilità Alta
Utilizzo
Ereditarietà
Quantità
Biparentale (per via materna e paterna)
Due sole copie per cellula
Ibridazione Riconoscimento dei singoli individui
Parentele
Sì
Sì
Sì
Tassonomia Sì
Gli SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)
Svantaggi. Possono essere sottoposti a selezione, se si trovano in
regioni codificanti del DNA, nel qual caso hanno un’evoluzione molto lenta
Vantaggi. Metodo molto veloce, preciso, relativamente economico,
necessita di piccole quantità di DNA, può studiare gli adattamenti delle
specie nei confronti dell’ambiente
Ereditarietà
Ibridazione
Riconoscimento dei singoli individui
Parentele
Variabilità
Uniparentale o Biparentale
Sì Parziale
Parziale
Bassa-Alta
Caratteristiche
Tassonomia Sì
Quantità Dipende se mitocondriali o nucleari
Utilizzo
Filogenesi Sì
GRAZIE PER GRAZIE PER
L’ATTENZIONEL’ATTENZIONE
E’ E’ tuttotutto chiarochiaro ??????
AlcuniAlcuni materialimateriali integrativiintegrativi
Schema della PCRSchema della PCR
DNA
RNA
DNA
EstrazioneEstrazione deldelDNA o DNA o
RNA RNA daldal campionecampione
Rivelazione
Amplificazione
Reverse transcription
COMPONENTE VOLUME Concentrazionefinale
10 X PCR Buffer 5µµµµl 1X1X
10 X dNTPs (2mM) 55µµµµµµµµll 200200µµMM
Forward primer (5 pmols/µµµµl) 55µµµµµµµµll 0.50.5µµMM
Reverse primer (5 pmols/µµµµl) 55µµµµµµµµll 0.50.5µµM M (25pmols/50(25pmols/50µµl)l)
DNA genomico stampo 22µµµµµµµµll 11µµgg
polimerasi termostabile(5U/µµµµl)
0.20.2µµµµµµµµll 1 1 unitunitàà
H2O (a 50µµµµl di volume finale) 27.827.8µµµµµµµµll
TIPICA MISCELA DI REAZIONE
25 o 5025 o 50µµµµµµµµl in l in unauna provettaprovetta micro micro EppendorfEppendorf (0.2 o 0.5 ml)(0.2 o 0.5 ml)
How Big A Target?How Big A Target?
� Amplification products are typically in the
size range 100-1500 bp.
� Longer targets are amplifiable — >25 kb.
� Requires modified reaction buffer, cocktails
of polymerases, and longer extension times.
� Limited by the integrity of the starting
target DNA — > 50 kb.
Designing PCR PrimersDesigning PCR Primers
� Primers should be ~20 bases long.
� The G/C content should be 45–55%.
� The annealing temperatures should be within
1°C of one another.
� The 3´-most base should be a G or C.
� The primers must not base pair with each
other or with themselves or form hairpins.
� Primers must avoid repetitive DNA regions.
Optimising the PCR ReactionOptimising the PCR Reaction
� Annealing temperature of the primers.
� The concentration of Mg2+ in the reaction.
� The extension time.
� (The denaturing and annealing times.)
� (The extension temperature.)
� (The amount of template and polymerase
— “more is less”.)
Automated DNA sequencing