AMPLIFICAZIONE IN

VITRO DEL DNA

“REAZIONE A CATENA

DELLA POLIMERASI

(PCR)”

• Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993)

• Serve per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro

• Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte

PCR: reazione polimerasica a

catena

ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:

1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A

DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI

OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA

REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE

2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE

DA AMPLIFICARE

3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE

DENATURATA SE PORTATA A 95° C)

4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO

DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:

1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO

VIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO

2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO

CON IL DNA STAMPO

3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL

FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus)

POLIMERASI

PCR: Reazione a catena della polimerasi

Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi

termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un

eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: amplificazione

n.ro cicli

1

3

10

15

20

25

30

n.ro sequenze bersaglio

0

2

256

8192

262.144

8.388.608

268.435.456

La sequenza bersaglio è la

sequenza di DNA sintetizzata

tra i due primers

Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter

essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA

potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.

In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.

Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in

30 cicli.

PCR VANTAGGI:

• Sensibilita’

• Rapidita’

• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)

• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione

• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato

• SVANTAGGI:

• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)

• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza

• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)

• Può sintetizzare frammenti relativamente corti

• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

Esempi di utilizzo della PCR • Su DNA:

– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR DIAGNOSTICA

– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare”

• Su RNA messaggero (RT-PCR):

– segnalare la presenza di specifiche molecole di

RNA (espressione genica, presenza di RNA di

micro-organismi infettivi)

– Amplificare frammenti specifici da usare in

seguito come sonde oppure da “clonare” -

isolare cDNA specifici per determinati geni.

PCR in genetica forense

Quale delle persone sospette può avere

commesso il crimine?

La tecnica PCR è utile, spesso

necessaria, per amplificare il DNA

estratto dai reperti trovati sulla scena del

delitto. Si usano sonde multi-locus con

molti alleli.

Diagnosi genetica pre-impianto

PCR utilizzata per rivelare uno

specifico mRNA:

PCR in seguito a trascrittasi inversa

(RT-PCR)

• Estrazione dell’RNA

• Purificazione dell’RNA poliadenilato (mRNA)

• Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa

AAAAAAAA 3’ 5’

TTTTTTTT 5’ 3’

mRNA

cDNA

PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:

PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)

AAAAAAAA 3’ 5’

TTTTTTTT 5’ 3’

mRNA

cDNA

• Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di

innesco specifici

5’ 3’

• Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi)

TTTTTTTT 5’ 3’ 5’ 3’

AAAAAAAA 3’ 5’

La PCR non e’ una tecnica

quantitativa

Nu

mb

er

of

mo

lec

ule

s

Number of cycles

PCR quantitativa: RT-PCR in

tempo reale

• Utilizza particolari sostanze la cui fluorescenza si

rivela quando intercalano la catena di DNA

sintetizzata durante la reazione di amplificazione.

• L’utilizzo di appositi apparecchi permette la

misurazione della fluorescenza accumulata in

tempo reale, proporzionale al numero di molecole

amplificate e quindi al numero di molecole

presenti in partenza

Polymerase Chain Reaction: resa

• Resa teorica: 2n

P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente

con il numero di cicli di PCR (n)

Il prodotto di PCR dipende da T,numero di

copie di template di partenza

Lo

g[D

NA

]

N° cicli termici

Esponenziale

Lineare

Plateau

Prodotto

variabile

Polymerase Chain Reaction: plateau

Resa effettiva: effetto plateau

Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da:

Quantità dei primers

Attività della Taq polimerasi

Reannealing dei filamenti

Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

Soluzioni

• U t i l i z z a r e i d a t i o t t e n u t i d u r a n t e l a f a s e e s p o n e n z i a l e

I l prodotto di PCR è proporzionale al template in iz iale

• Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è

p r o p o r z i o n a l e a l p r o d o t t o d i P C R

• La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata

utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti

il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR

RT-PCR convenzionale

Manual or

automated

analysis

Reverse

transcription

PCR

reaction

Nested

PCR reaction

Gel

electrophoresis

DNA

sequencing

Southern

blot

Real-time RT-PCR

Reverse

transcription

PCR reaction

Quantitative

result

Perché Real-Time?

Misura l'amplificazione in tempo reale

durante la fase esponenziale della PCR,

quando cioè l'efficienza di amplificazione è

influenzata minimamente dalle variabili di

reazione, permettendo di ottenere risultati

molto più accurati rispetto alla PCR

t r a d i z i o n a l e " e n d p o i n t "

RT-PCR quantitativa

Plot lineare

Incremento di

fluorescenza

Cicli di PCR

•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione

•Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio

•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

Analisi tramite software

•La fluorescenza si genera durante la PCR per

effetto di diverse possibili reazioni chimiche

•Le chimiche principali sono basate sia sul

legame di coloranti fluorescenti che si intercalano

nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,

sia sul l ' ibr idazione di sonde specif iche.

Chimiche fluorescenti

per PCR Real-Time

SYBR Green

SYBR Green: principio Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si

lega al solco minore del DNA

All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di

reazione contiene DNA denaturato, primers e la

molecola fluorescente

SYBR Green

SYBR Green

Dopo l’annealing dei primers, si legano

poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

SYBR Green Durante l’elongazione si verifica un aumento di

fluorescenza che corrisponde all’ aumento del

numero di copie dell’amplicone

SYBR green

• Metodica semplice

Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa

• Non costosa

• Non-specifica

– La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche,

includendo i dimeri di primers

– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di

prodotti aspecifici

TaqMan

TaqMan

La Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:

coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano

i n m a n i e r a a s p e c i f i c a a t u t t o i l D N A

sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse,

m a r c a t e c o n m o l e c o l e f l u o r e s c e n t i

Esistono diversi tipi di sonde:

Dual-labeled (come le sonde TaqMan)

Molecular beacons

Scorpion

Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Sonde TaqMan

La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i

primers della PCR, viene disegnato per essere complementare

a l l a s e q u e n z a b e r s a g l i o d a a m p l i f i c a r e

La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno

del frammento amplificato nella reazione di PCR

Primer

Primer

3’ 3’

3’ 3’

5’

5’ 5’

5’

R Q

5’ 3’

Sonda TaqMan

5’ 3’

Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” ed

a l l ’ e s t r e m i t à 3 ’ u n a m o l e c o l a “ Q u e n c h e r ”

Reporter-Quencher

Dye Quencher

5,6 FAM BHQ-1/TAMRA

HEX/JOE BHQ-2

Texas Red/ROX BHQ-2

Cy5/Quasar670 BHQ-2 ( or-3)

6-carbossifluoresceina

6-carbossitetrametilrodamina

Reporter-Quencher

5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette

fluorescenza

3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che

spegne la fluorescenza del reporter

5’ 3’

R Q

Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè

i fotoni di R vengono assorbiti da Q

R Q

3’ 3’

5’ 5’

R

Q

3’ 5’ 5’

R Q

3’ 5’ 5’

Real-Time PCR:

attività 5’>3’ esonucleasica

Forward primer

Reverse primer

Probe

L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente

proporzionale al numero di ampliconi generati

Real-Time PCR: applicazioni • Quantificazione virale

• Quantificazione dell’espressione genica

• Efficacia della terapia farmacologica

• Misura dei danni al DNA

• Controllo di qualità e validazione dei saggi

• Detenzione dei patogeni

• Controllo degli OGM

• Genotyping