Strategie di mutagenesiSELEZIONE GENETICA…

seleziono FENOTIPO – determino GENOTIPO

GENETICA INVERSA…creo GENOTIPO – determino FENOTIPO

i.e., traduco una sequenza in una funzione

Mutagenesi in vivoPhage display

Mutagenesi in vitro

Mutagenesi In Vitro

• La mutagenesi in vitro permette di cambiare la sequenzanucleotidica di un frammento di DNA

• Le mutazioni possono essere localizzate o generali, casuali omirate;• Analisi di regioni regolative: metodi meno specifici• Ingegneria proteica: Analisi del contributo di singoli aminoacidi

(o gruppi di aminoacidi), alla struttura e funzione della proteinatarget-->metodi specifici

• Con entrambi i metodi si ottengono mutanti in vitro, senzaselezione fenotipica

Mutagenesi di Sequenze codificanti

Principali metodi di mutagenesi

• MUTAGENESI SITO-DIRETTA

• SCANNING MUTAGENESIS

• MUTAGENESI A SATURAZIONE/CASUALE

• MUTAGENESI PER RICOMBINAZIONE

Mutagenesi Sito-Diretta

• Ruolo di particulari residui nella struttura, attività catalitica o legame

• Centinaia di metodi – basati su un principio comune

• Oligo sintetico con la mutazione appaiato alla regione bersaglio gene wt – primer per

sintesi di DNA in vitro

• Estensione da parte della DNA polimerasi produce dsDNA mutato

• Il DNA mutato viene inserito nel gene e si esprime la proteina mutante

Progettazione degli Oligonucleotidi Mutagenici

• Passaggio critico.

• La sequenza contiene (almeno) 1 mutazione

• Può contenere inserzioni, delezioni e sostituzioni con nucleotidialterati

• Lunghezza minima dell’oligo: dipende dai casi

• Mutazioni semplici di una base ~25 nt

• Mutazioni complesse possono richiedere oligo >80 nts

Si possono progettare varie caratteristiche per ottimizzare la mutazione:

•Sequenza e composizione in basi

Basi appaiate/non appaiate

Percentuale in GC in varie zone (estremità)

•Temperatura di fusione

•Propensità a formare strutture secondarie

•Specificità di appaiamento

Nel templato

Tra primer (diminuisce la concentrazione critica)

Mutagenesi sito-diretta classica

•Protocollo comprende:

•Progettazione e sintesi degli oligo mutagenici

•Ibridazione degli oligo mutagenici a ssDNA bersaglio (M13) –eliminacompetizione tra oligo mutagenico e filamento di DNA complementare

•Estensione dalla DNA polimerasi in presenza di 4 dNTPs

•Formazione di DNA circolare con DNA ligasi

•Trasformazione di batteri

•Screening dei cloni mutati per ibridazione (e.g., oligo) – sequenza

•Recupero del frammento di DNA mutato

•Sostituzione del frammento mutato nel gene wt

1. Clonaggio dell’ inserto nel vettore

2. Denaturazione ed appaiamento

3. Estensione con T4 DNA polimerasi;Ligazione con T4 DNA ligasi

4. Selezione filamento mutanteTrasformazione

wild-type sequence Ile

CAA GCG CCC ATT GGC AAA CAAGTT CGC GGG GAA CCG TTT GTT

mutant oligo Leu

Mutagenesi sito-diretta classica

Percentuale di cloni mutati 0.1% - 50% a seconda della efficienza

dell’oligo mutagenico

Sviluppo di metodi di selezione negativa del DNA wt;

– KUNKEL: Digestione selettiva del filamento stampo con enzimi di restrizione

o esonucleasi

– USE (Unique Site Elimination) Eliminazione di un sito unico di restrizione

– Associazione con recupero di resistenza o capacità di replicazione

Mutagenesi con Metodo Kunkel

•• Selezione negativa Selezione negativa di DNA con di DNA con uracile uracile in in ceppi ceppi di di E. coliE. coli cheche

esprimono esprimono la la uraciluracil-DNA -DNA glicosidasiglicosidasi

•• Stampo ssDNA ottenuto preparando Stampo ssDNA ottenuto preparando M13 in M13 in dutdut-- ung ung- - FF’’ E. coliE. coli

dutdut- =- =difettivi dUTPasi difettivi dUTPasi ;;

ungung- =- = difettividifettivi

uraciluracil-N--N-glicosidasiglicosidasi

••LaLa mutagenesi mutagenesi genera ungenera un

heteroduplex heteroduplex in cui in cui stampostampo

concon uracile uracile ma ma filamentofilamento

neosintetizzato neosintetizzato concon timidina timidina

Questo heteroduplex Questo heteroduplex DNADNA si si

trasforma trasforma in in ceppo ceppo ungung+ E.+ E.

colicoli –– selezione contro il selezione contro il

filamento filamento wtwt

••Fino Fino ad 80%ad 80% sono mutanti sono mutanti

Mutagenesi con metodo USE•• Elimina sito Elimina sito di di restrizione unicorestrizione unico

•• Usa Usa 2 primers 2 primers –– un primer ( un primer (primer primer mutagenicomutagenico) introduce la) introduce lamutazionemutazione, , il secondo elimina il sito unico nel plasmideil secondo elimina il sito unico nel plasmide

•• HeteroduplexHeteroduplex: lo: lo stampo stampo ha ha il sito il sito didi restrizione restrizione , , mentre ilmentre ilfilamento nuovo filamento nuovo ha la ha la mutazionemutazione, ma non , ma non il sito il sito di di restrizionerestrizione

•• Incubazione Incubazione con con enzima enzima –– si linearizza si linearizza wt ma non wt ma non heteroduplexheteroduplex

•• Transformazione Transformazione in in ceppo ceppo di di E. coliE. coli che che non non ripara ripara (BMH71-18(BMH71-18mutSmutS)) (DNA (DNA lineare transforma lineare transforma 10-1000 10-1000 volte meno volte meno del del circolarecircolare))si si replica replica heteroduplexheteroduplex

•• Seconda digestione Seconda digestione e e transformazione transformazione inin ceppo ceppo di di E. coliE. coli normalenormale––(5-50% (5-50% mutantimutanti))

Mutagenesi a cassetta•• Sostituzione Sostituzione di un di un frammento frammento di DNA di DNA tra tra due due siti siti di di restrizionerestrizione

•• PossibilitPossibilitàà di di ottenere mutanti multipliottenere mutanti multipli

•• Semplice Semplice ed ed efficienteefficiente

•• ProblemaProblema: : necessitnecessitàà di di siti unici siti unici ((geni sintetici geni sintetici OK)OK)

PCR…

Mutagenesi per PCRVantaggi rispetto ai metodi classici;• Alta percentuale mutanti – selezione non richiesta

• Stampi a dsDNA, mutazioni quasi ovunque

• Alta temperatura--> meno strutture secondarie

• veloce -non richiede clonaggio in vettori particolari

• Svantaggi potenziali:• Frequenza di errori elevata– si usa polimerasi alta fedeltà (e.g., VENT or

PFU)

• Ridotta efficienza di applicazione per frammenti > 2-3 kb

Possibilità con la mutagenesi per PCR

• Sostituzione di base• Overlap extension• Megaprimer extension• Quik change

• Delezioni• Mismatched primers• PCR-fusion• Inverted PCR

• Inserzioni• Overlap extension

DNA

stampo

PCR con primers mutagenici

Purifica ed unisci

PCR con primersterminali

DNA mutato

Overlap Extension PCR Mutagenesis

DNA

stampoPCR con primer mutagenico

Mutated DNA

Megaprimer Extension PCR Mutagenesis

PCR con megaprimer+primer terminale

Purifica megaprimer

QuikChange® (80%)

• PCR• Proofreading Polymerase• Amplifica tutto il

plasmide• DpnI degrada templato

wt metilato• Non usare con DNA da

ceppi dam-

• Rapido

Deletion PCR Mutagenesis

Deletion PCR Mutagenesis

Insertion PCR Mutagenesis

Principali metodi di mutagenesi

• MUTAGENESI SITO-DIRETTA

• SCANNING MUTAGENESIS

• MUTAGENESI A SATURAZIONE/CASUALE

• MUTAGENESI PER RICOMBINAZIONE

Scanning Mutagenesis (1)• Cambia residui di superficie, conservando la struttura 3D

• I residui carichi di superficie non sono di solito cruciali per la integritàstrutturale: importanti per legame, oligomeri e catalisi

• ALANINE SCANNING MUTAGENESIS

• Sostituzione sistematica di residui carichi con alanina:

• Elimina la catena laterale dopo il carbonio beta

• Elimina interazioni funzionali tra aminoacidi

• Non altera la conformazione della proteina

• Molto efficace per assegnare funzioni di superficie

HFKRVVSPWNACSPCYYTQDEEDgggcccttttaaagggaattaattcccccaaatttggggggtttaaatttgggcccccacacatacatatctaccta

AFKRVVSPWNACSPCYYTQDEEDHAKRVVSPWNACSPCYYTQDEEDHFARVVSPWNACSPCYYTQDEEDHFKAVVSPWNACSPCYYTQDEEDHFKRAVSPWNACSPCYYTQDEEDHFKRVASPWNACSPCYYTQDEEDHFKRVVAPWNACSPCYYTQDEEDHFKRVVSAWNACSPCYYTQDEEDHFKRVVSPANACSPCYYTQDEED

DNA

Protein

Alanine scanning mutagenesis

Scanning Mutagenesis (2)

CYSTEINE SCANNING MUTAGENESIS

• Residui di cisteina non appaiati sostituiscono specifici aminoacidi

• Residui di cisteina: dimensioni medie, non carichi e idrofobici

• Reagiscono bene con agenti chimici modificanti tipo N-ethylmaleimide

• Si usa per;

• Marcare la proteina per studi di topologia

• Misurare la sensibilità a reagenti in acqua o lipidi

Principali metodi di mutagenesi

• MUTAGENESI SITO-DIRETTA

• SCANNING MUTAGENESIS

• MUTAGENESI A SATURAZIONE/CASUALE

• MUTAGENESI PER RICOMBINAZIONE

STRATEGIA GENERALE DI EVOLUZIONE DIRETTA

Complessità

Espressione

Identificazione

Fitness landscape (scenario delsuccesso evolutivo): possibilitàche si presentano ad una dataproteina in termini di fitness.Per esplorare queste possibilitàla sequenza della proteina devevariare all’interno di uno spaziodi sequenza (complessità delladiversità dei sistemiproteici=20n )

Mutagenesi a Saturazione/Casuale

• GENERA MUTAZIONI SU TUTTA LA SEQUENZA

• Casuale: trascura le informazioni sul ruolo dei singoli aminoacidi

• Fornisce informazioni su tutto lo “sequence space” – i.e., relazionitra sequenza aa, struttura 3D e funzione

• Se utilizzata su piccoli frammenti della proteina

• Si può costruire un catalogo di aminocidi permessi o deleteri

•MUTAGENESI CHIMICA/RADIAZIONI

•MUTAGENESI A CASSETTA

•MUTAGENESI PER INCORPORAZIONE ERRATA

•MUTAGENESI CON SET DI OLIGONUCLEOTIDI PARTICOLARI

MUTAGENESI CASUALECON OLIGO DEGENERATI

OLIGO CON ANALOGHIDI BASI

5-BROMOURIDINA2-AMINOPURINA

Error-prone PCR con Taq-polimerasi

• Nella PCR aumento– concentrazione MgCl2– # cicli

- concentrazione polimerasi• Oppure uso:

- MnCl2-dNTP sbilanciati-dITP

• DNA shuffling: frammentazione + PCR

• StEP (Staggered Extension Process): estensione corta + PCR

• Random-priming: primers casuali + PCR

UTILIZZA LA VARIABILITA’ GIA’ PRESENTE IN REGIONI SEPARATEDI UNA SEQUENZA O PIU’ SEQUENZE

Mutagenesi per ricombinazione

DNA SHUFFLING SU GENI DA FAMIGLIE PROTEICHE

Incroci di molecole

DNA SHUFFLING.DNAsi e PCR senza primers

Denature & anneal

5’5’* *

*

5’5’*

*

5’5’

**

5’ 3’3’ 5’

**

fill in & amplify

**

DNAse I

DNAse I

DNA shuffling(= Molecular Breeding)

Homo-duplex formation

5’ 3’3’ 5’

5’ 3’3’ 5’

5’ 3’3’ 5’

Hetero-duplex formation

5’ 3’3’ 5’

PCR PCR

Resembles synthesis of synthetic gene

(Directed Mutagenesis)

Resembles synthesis of gene fusions

(Directed Mutagenesis)

StEP recombination

Staggered Extension ProcessStEP recombination. Only oneprimer and single strands from twoparent genes (templates) areshown. (A) Denatured templategenes are primed with one definedprimer. (B) Short fragments areproduced by brief Polymerase-catalyzed primer extension. (C)Through another cycle of StEP,fragments randomly prime thetemplates (template switching)and extend further. (D) Thisprocess is repeated until full-lengthgenes are produced resulting in agenepool of recombined parentgenes (E).

NB I geni devono presentare un gradodi omologia di sequenza elevato

Staggered Extension Process (StEP)

Denaturation Annealing, Extension

Denaturation Annealing, Extension

SCOPE (Structure based Protein engineering)

SCHEMA (algoritmo per predire quali frammenti possono essere ricombinati senza disturbare la struttura)

Beta-lattamasi

www.che.caltech.edu/groups/fha/code.html

ALCUNI KIT DI MUTAGENESI COMMERCIALI

Amersham-Pharmacia www.apbiotech.com Sculptor IVM mutagenesis kit BiotechUSE mutagenesis kit

Bio-Rad www.bio-rad.com Muta-gene in vitro mutagenesis kit

Clontech www.clontech.com Transformer site-directed mutagenesis kit

Life Technologies www.lifetech.com CFLP Powerscan mutation detection system

PanVera www.panvera.com Mutan-Express Km kit

Promega www.promega.com Altered Sites II in vitro mutagenesis systems

Gene Editor System

Interchange in vitro mutagenesis system

Stratagene www.stratagene.com Quik-change site-directed mutagenesis kit

ExSite PCR-based mutagenesis kit

Chameleon ds site-directed mutagenesis kit

NEB www.neb.com Code20 kit