I.T.I.S. “Enrico Fermi” Treviso

ESAME DI STATO 2010/2011

Micropropagazione

Moltiplicazione in vitro delle piante

Enrico Foltran 5° A Chimica

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Indice Indice .................................................................................................................................................... 2

Premessa .............................................................................................................................................. 3

Introduzione ......................................................................................................................................... 4

Cos’è la micropropagazione? ............................................................................................................... 5

La micropropagazione in Italia ............................................................................................................. 6

L’importanza della micropropagazione ............................................................................................... 7

Vantaggi ........................................................................................................................................... 7

Svantaggi .......................................................................................................................................... 7

Le fasi della micropropagazione .......................................................................................................... 8

Reperimento degli espianti .............................................................................................................. 8

Sterilizzazione degli espianti ............................................................................................................ 8

Impianto del materiale vegetale sterilizzato ................................................................................... 9

Proliferazione degli espianti ............................................................................................................. 9

Allungamento dei germogli ............................................................................................................ 10

Radicazione dei germogli ............................................................................................................... 10

Acclimatazione delle piante ........................................................................................................... 10

Esperienza in laboratorio ................................................................................................................... 12

Preparazione del materiale ............................................................................................................ 12

Il terreno colturale ......................................................................................................................... 12

Composizione ............................................................................................................................. 12

Preparazione .............................................................................................................................. 13

Sterilizzazione ............................................................................................................................. 14

Reperimento degli espianti ............................................................................................................ 14

Sterilizzazione degli espianti .......................................................................................................... 15

Coltura in vitro ............................................................................................................................... 16

Conclusioni ..................................................................................................................................... 17

Bibliografia e sito grafia ..................................................................................................................... 18

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Premessa Cosa mi ha fatto scegliere questo argomento.

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Introduzione Spiegare in breve di cosa tratta la tesina facendo un breve riassunto di tutti i punti.

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Cos’è la micropropagazione?

La micropropagazione è una tecnica di moltiplicazione delle piante che permette di ottenere cloni della pianta stessa, ovvero un insieme di individui dotati dello stesso patrimonio genetico, tramite l'utilizzo dei moderni metodi di coltura in vitro di cellule e tessuti vegetali.

La micropropagazione si differenzia dagli altri sistemi di moltiplicazione per la sofisticata tecnica operativa, che permette la produzione di cloni esenti da infezioni batteriche e virali; tale pratica permette inoltre, da esigui materiali di origine, di ottenere un’enorme quantità d’individui clonati.

Sin dal 1940 era nota la possibilità di mantenere vivi, in vitro, tessuti vegetali isolati dalla pianta,

anche per lunghi periodi; il graduale affinamento delle tecniche di laboratorio permise, negli anni

successivi, di ottenere la rigenerazione completa (ovvero la nascita di una nuova pianta) partendo

dalle cellule e dai tessuti in coltura. Tale possibilità è data dalla cosiddetta totipotenza, proprietà

intrinseca delle cellule vegetali, che permette da una singola cellula di sviluppare un intero

organismo.

Attualmente la produzione di piante per micropropagazione rappresenta un settore in costante e

rapidissima evoluzione, al punto che, per un certo numero di specie, essa si è già imposta nella

realtà operativa.

Il sistema è particolarmente vantaggioso per la possibilità di produrre in un minor lasso di tempo e

dallo stesso espianto una grande quantità di piantine rispetto ai sistemi tradizionali.

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La micropropagazione in Italia

La storia della micropropagazione commerciale (o su larga scala) in Italia risale agli anni ’60,

quando in Liguria alcuni laboratori iniziarono un’attività di coltura in vitro basata sulla

proliferazione di garofano e sulla moltiplicazione di orchidee.

Verso la fine degli anni ‘60, il risanamento da batteri e funghi di piante fruttifere arboree fu

praticato dai Vivai Zanzi, con l’assistenza dell’Istituto di Patologia Vegetale di Bologna. Queste

attività, tuttavia, non presero in considerazione la possibilità di compiere una moltiplicazione

clonale su larga scala, quanto quella di ottenere “stock foundations” di materiali risanati da batteri

o da virus.

Fu solo nel 1976 che si realizzò il primo grande laboratorio di micropropagazione italiano. Esso

nacque dall’esigenza di eliminare virus, batteri che infestavano i vivai e le coltivazioni di fragole

della Romagna. Il Consorzio del Fragolone di Cesena si fece carico dell’allestimento del Laboratorio

(con il sostegno della Regione Emilia Romagna e con l’assistenza tecnica dell’Istituto Sperimentale

per la Frutticoltura di Roma). Durante i primi otto mesi furono prodotte circa un milione di

plantule.

Con la costruzione di altri laboratori, in Romagna e in altre Regioni, si assisteva nel 1991 alla

produzione di circa quindici milioni di piante micro propagate, ottenute da una ventina di

laboratori commerciali.

Nella ricognizione effettuata nel 1999, i fruttiferi erano largamente dominanti, ma con un’offerta

crescente di ortaggi, piante ornamentali da fiore, da fronda o da interno, si fece uno sforzo

considerevole per incrementare e migliorare i protocolli di moltiplicazione in vitro di numerose

altre specie.

Gli ultimi dati produttivi si riferiscono a un’indagine del 2006 che stimava la produzione italiana di

piante radicate micro propagate in circa trenta milioni, comprendente ventuno tipologie di

raggruppamenti vegetali.

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L’importanza della micropropagazione Rispetto ad altre tecniche di propagazione convenzionali, la micropropagazione riesce a produrre in breve tempo un maggior numero di piante, geneticamente uniformi ed esenti da virus. La vera limitazione della micropropagazione per molte piante è l’alto costo di produzione, infatti, per molte specie l’utilizzo dei semi, naturalmente esenti da malattie e prodotti in grandi quantità, permette di produrre facilmente un adeguato numero di piante in tempi relativamente brevi e a costi molto inferiori. In seguito sono riassunti i principali vantaggi e svantaggi di tale tecnica.

Vantaggi

1. Produzione, in tempi brevi, di un grande numero di piante da un’unica pianta madre;

2. Uniformità genetiche delle piante ottenute con la pianta madre (si evitano in questo modo

mutazioni indesiderate della specie);

3. Produzione di piante virus-esenti;

4. Grande numero di piantine in uno spazio ristretto;

5. Svincolamento dai cicli stagionali;

6. Produzione di piante più robuste con una conseguente crescita accelerata rispetto alle piante tradizionali;

7. Produzione di piantine pronte per la crescita con conseguente risparmio di tempo per il coltivatore quando la specie produce semi lenti a germogliare;

8. È utile a moltiplicare le piante che producono semi in quantità antieconomica, o quando le piante sono sterili e non producono semi vitali.

Svantaggi

1. Alti costi iniziali per le attrezzature richieste;

2. Necessità di personale qualificato;

3. Le piante prodotte sono geneticamente identiche e quindi vulnerabili alle stesse infezioni.

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Le fasi della micropropagazione La tecnica della micropropagazione è effettuata attraverso diversi passaggi consecutivi, con i quali, dal singolo espianto di partenza, sono prodotte diverse nuove piante. La fase della micropropagazione hanno tutte un’importanza fondamentale per l’ottenimento di piantine adatte allo stadio finale di acclimatazione, ovvero, il trasferimento delle piante prodotte dall’ambiente in vitro all’ambiente in vivo (nelle serre). Tutte le fasi sono tra loro collegate ed eventuali errori operativi commessi si ripercuoto nelle fasi successive. Le fasi in cui si articola la micropropagazione sono:

1. Reperimento degli espianti; 2. Sterilizzazione degli espianti; 3. Impianto del materiale vegetativo sterilizzato; 4. Proliferazione degli espianti; 5. Allungamento dei germogli; 6. Radicazione degli espianti; 7. Acclimatazione.

Tutte le fasi, tranne l’ultima di acclimatazione, sono effettuate in laboratorio sotto cappa a flusso laminare per mantenere l’ambiente sterile.

Reperimento degli espianti

La base di partenza del processo di micropropagazione è l’espianto, rappresentato preferibilmente da un germoglio o una gemma ma che in linea teorica può essere una qualsiasi porzione di tessuto vegetale. Gli espianti sono prelevati dalle cosiddette “piante madri”, piante allevate in ambiente controllato dal punto di vista igienico-sanitario esenti da virus e malattie e con un buon vigore vegetativo. In genere si preferiscono tessuti giovani che hanno una capacità di accrescimento maggiore dei tessuti più maturi. Più piccolo sarà l’espianto più la tecnica e la strumentazione con cui si opera, sarà accurata (se si opera con porzioni vegetali di poche decine di millimetro, si dovrà ricorrere al microscopio e a personale qualificato) con conseguente aumento dei costi.

Sterilizzazione degli espianti

Una delle caratteristiche principali della micropropagazione è rappresentata dalla condizione di sterilità in quasi tutte le fasi in cui si opera. A tale scopo prima di procedere alla coltura dell’espianto è necessario sottoporre il materiale vegetale a un’accurata fase di sterilizzazione volta a debellare batteri e virus naturalmente presenti nelle piante che troverebbero nel terreno colturale di crescita un ottimo ambiente per lo sviluppo e la moltiplicazione.

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La sterilizzazione è compiuta con diversi principi attivi, tra i principali troviamo l’ipoclorito di sodio (NaClO, in soluzione acquosa al 5% è comunemente chiamato varecchina) e l’etanolo (C2H5OH, il comune alcol etilico). La sterilizzazione è eseguita immergendo il materiale vegetale nelle diverse soluzioni sterilizzanti in successione e terminando con un accurato risciacquo con acqua deionizzata sterile per evitare che i principi attivi, rimanendo per lungo tempo sulla superficie vegetale, la intacchino.

Impianto del materiale vegetale sterilizzato

L’impianto del materiale vegetale sterile è eseguito sotto cappa a flusso laminare, per ridurre al minimo l’apporto ambientale di batteri, e utilizzando strumenti di lavoro sterilizzati. Gli espianti sono collocati in contenitori di vetro, in precedenza sterilizzati, che contengono il terreno di coltura (Figura 1) e vi rimangono per 15-30 giorni, in seguito le colture che non presentano contaminazione sono trasferite in terreno colturale fresco e poste in una camera di crescita con buona intensità luminosa, fotoperiodo di sedici ore su ventiquattro e una temperatura costante di 21-25° C.

Proliferazione degli espianti

Lo scopo di questa fase è aumentare considerevolmente il numero dei germogli attraverso diverse sub-culture che prevedono il trasferimento degli espianti in terreni colturali freschi ogni 15-30 giorni. In questo stadio si utilizzano contenitori da 500 ml di volume (vasi di coltura) nei quali sono collocati un numero variabile (dipende dalla specie) di germogli provenienti dalla fase precedente. In genere, per favorire la moltiplicazione dei germogli, nel terreno è aumentata la concentrazione di citochinina, un ormone che favorisce la divisione cellulare.

Figura 1

Figura 2 - Fase di proliferazione degli espianti. (immagine da http://www.clonal-solutions.com.au/)

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Allungamento dei germogli

L’allungamento è la fase di preparazione dei germogli alla radicazione. In questa fase è abbassata notevolmente la quantità di citochinina nel terreno colturale per favorire la distensione cellulare e il conseguente allungamento dei germogli formati durante la fase di proliferazione. L’allungamento non è indispensabile ma trova una costante applicazione per molte specie perché permette di ottenere materiale omogeneo e facile da maneggiare.

Radicazione dei germogli La radicazione è l’ultima fase che precede l’acclimatazione delle plantule in vivo, lo scopo di tale stadio è favorire la formazione di radici; a tal proposito i germogli sono spostati in un substrato di crescita in cui si elimina gran parte o tutta la citochinina in favore dell’auxina, un ormone che favorisce la radicazione. Le nuove radici formate non hanno capacità di assorbimento attivo, ma da queste, in fase di acclimatazione, si formeranno nuove radici funzionali. Dopo un tempo variabile di 2-4 settimane di coltura nel substrato di radicazione, i germogli saranno trasferiti alla fase di acclimatazione.

Acclimatazione delle piante

La fase di acclimatazione è la fase più delicata della micropropagazione, le condizioni ambientali durante la coltura in vitro (umidità relativa elevata, temperatura costante, bassa intensità luminosa ecc.) determinano, infatti, delle alterazioni anatomiche e funzionali nella pianta neo formata che possono compromettere la sua sopravvivenza in condizioni naturali. In particolare le radici formate nella fase di radicazione non hanno ancora sufficiente capacità di assorbimento per soddisfare in fabbisogno d’acqua della pianta, in alcuni casi avviene una repentina disidratazione delle piante al momento del trasferimento dal vaso di coltura all’ambiente esterno. Le fasi più critiche dell’acclimatazione sono essenzialmente due:

a) fase di attecchimento al nuovo substrato; b) fase di ambientamento alle condizioni ambientali esterne.

Nella prima fase gioca un ruolo molto importante la formazione di nuove radici funzionali in grado di sostenere la domanda d’acqua e di nutrimento della pianta. Nella seconda fase, attraverso una graduale diminuzione dell’umidità relativa e della temperatura si cerca di favorire una modificazione anatomica e fisiologica della pianta per riportarne all’origine le funzioni vitali che la coltura in vitro ha modificato. L’esecuzione di un’efficace fase di acclimatazione richiede perciò serre in cui sia possibile controllare fattori come umidità, temperatura e intensità luminosa.

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Figura 3 - Piantine in fase di acclimatazione in serra. (immagine da http://shaheeriyyad.blogspot.com/)

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Esperienza in laboratorio L’esperienza copre le prime tre fasi della micropropagazione poiché l’attrezzatura e i reagenti richiesti per le fasi successive non sono presenti nei laboratori scolastici.

Preparazione del materiale

Tutto il materiale utilizzato per il trattamento e l’incubazione degli espianti è stato sterilizzato in autoclave a 121°C per 20 minuti al fine di eliminare virus e batteri. Gli strumenti di lavoro come pinze e forbici sono state sterilizzate tramite flambaggio con becco bunsen. Si è proceduto anche alla pulizia della cappa a flusso laminare lavando accuratamente tutte le pareti con NaClO all’8% e lasciandola accesa per consentire il riflusso dell’aria. È stata controllata l’integrità e la chiusura ermetica dei tappi di tutti i provettoni che serviranno in seguito per l’inoculo degli espianti.

Il terreno colturale Il terreno colturale scelto per la coltura è l’M&S (inventato nel 1962 dagli scienziati Toshio Murashige e Folke K. Skoog) il substrato più comunemente usato nel campo delle colture in vitro di cellule vegetali.

Composizione

Costituenti Formula chimica Quantità Macronutrienti inorganici

Nitrato d’ammonio NH4NO3 1.650 mg/l

Figura 4 - Provettoni per l'inoculo degli espianti

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Cloruro di calcio CaCl2 * 2H2O 440 mg/l

Solfato di magnesio MgSO4 * 7H2O 370 mg/l

Fosfato di potassio KH2PO4 170 mg/l

Nitrato di potassio KNO3 1.900 mg/l

Micronutrienti inorganici

Acido borico H3BO3 6,2 mg/l

Cloruro di cobalto CoCl2 * 6H2O 0,025 mg/l

Solfato di rame CuSO4 * 5H2O 0,025 mg/l

Solfato ferroso FeSO4 * 7H2O 27,8 mg/l

Solfato di manganese MnSO4 * 4H2O 22,3 mg/l

Ioduro di potassio KI 0,83 mg/l

Molibdato di sodio Na2MoO4 * 2 H2O 0,25 mg/l

Solfato di zinco ZnSO4 * 7H2O 8,6 mg/l

Fonti di carbonio organico

Saccarosio C12H22O11 20 g/l

Ormoni

IAA 1-30 mg/l

Chinetina 0,004-10 mg/l

Vitamine

Mio-inositolo 100 mg/l

Niacina 0,5 mg/l

Piridossina 0,5 mg/l

Tiamina 0.1 mg/l

Altri additivi

EDTA Na2EDTA * 2H2O 37,2 mg/l

Glicina 2,0 g/l

Etilendiammina 1,0 g/l

Agar 10 g/l

Preparazione

La preparazione di 1 litro di terreno si svolge secondo i seguenti punti:

1. si pesano tutti i componenti che fanno parte del substrato; 2. si riempie una beuta da 1 litro con l’80% del volume finale di acqua (in questo caso 800 ml

di acqua); 3. si aggiungono nella beuta tutti i componenti solidi del terreno e si agita fino a completa

dissoluzione; 4. si aggiungono tutti i componenti liquidi (vitamine, ormoni ecc.); 5. si porta il tutto alla temperatura di circa 50°C con una piastra riscaldante mantenendo

l’agitazione; 6. in una seconda beuta più piccola si aggiunge il restante 20% di acqua e 10 grammi di agar; 7. si porta la seconda beuta alla temperatura di circa 80°C in modo da solubilizzare l’agar; 8. si incorpora la seconda beuta nella prima, in questo modo si evita di scaldare i componenti

termolabili del terreno colturale a 80°C; 9. mantenendo il terreno colturale a circa 50°C si procede alla semina, cioè si riempiono i

provettoni con il terreno, che, raffreddandosi, gelifica grazie all’agar che a temperature inferiori a 50°C è solida.

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Figura 5 - Beuta da 1 litro contenente i componenti del terreno colturale.

Figura 6 - Beuta da 500 ml contenente l’agar.

Sterilizzazione

La sterilizzazione è stata compiuta trattando i provettoni con dentro il terreno colturale in autoclave a 121°C per 20 minuti. Da questo momento l’ambiente di crescita è sterile e tutte le fase successive saranno effettuate sotto cappa a flusso laminare.

Reperimento degli espianti

Per questo esperimento tutti i campioni di materiale vegetale non provengono da “piante madri” ma da comuni piante da giardino. Sono state raccolte 9 specie di piante diverse preferendo gli alberi da frutto perché hanno una percentuale di attecchimento al substrato maggiore.

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Figura 7 - More

Figura 8 - Rose rampicanti

Figura 9 - Limone

Figura 10 - Melograno

Figura 11 - Caco

Figura 12 - Vite

Figura 13 - Gocce d'oro (prugne)

Figura 14 - Pesco

Figura 15 - Albicocco

Sterilizzazione degli espianti

La sterilizzazione del materiale vegetale è stata eseguita immergendolo in etanolo al 70% per pochi secondi (l’etanolo disidrata le cellule batteriche uccidendole) e in seguito in NaClO all’8% per 15 minuti (l’ipoclorito di sodio uccide i virus).

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Successivamente il materiale vegetale è stato accuratamente lavato con acqua sterilizzata in modo da eliminare in principi attivi dell’etanolo e dell’ipoclorito di sodio che danneggerebbero i tessuti.

Coltura in vitro Dal materiale vegetale sterilizzato sono stati isolati 7 espianti per ogni specie, comprendenti gemme, parti legnose o semi-legnose come gambi e frammenti di foglie per un totale di 63 provettoni riempiti.

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Mora Gemma Gemma Gemma Gambo Gambo Foglia Gambo

Rose rampicante Gemma Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia

Limone Gemma Gambo Gambo Gemma Foglia Foglia Foglia

Melograno Gemma Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia

Caco Gemma Gemma Gambo Gambo Foglia Foglia Foglia

Vite Gemma Gambo Gambo Foglia Gambo Foglia Gambo

Gocce d’oro Gemma Gambo Foglia Foglia Foglia Foglia Foglia

Pesco Gemma Gemma Gambo Foglia Foglia Foglia Foglia

Albicocco Gemma Gambo Gambo Gambo Gambo Foglia Foglia

Operando sotto cappa a flusso laminare gli espianti sono stati “piantati” nel substrato dentro i provettoni con l’utilizzo di pinzette sterilizzate. I campioni sono stati trasferiti in una stanza con temperatura e umidità ambiente e una luminosità elevata, impedendo però che gli espianti ricevessero direttamente i raggi del sole.

Figura 16 - Fase di sterilizzazione degli espianti in NaClO

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Conclusioni

Figura 17 - Espianti di vite in vitro.

Figura 17 - Espianti di limone in vitro.

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Bibliografia e sito grafia

Micropropagazione (http://micropropagazione.blogspot.com)

Wikipedia Italia – L’enciclopedia libera (http://it.wikipedia.org/wiki/Pagina_principale)

Wikipedia – The free encyclopedia (http://en.wikipedia.org/wiki/Main_Page)

Clonal Solutions Australia (http://www.clonal-solutions.com.au)

Video - Plant Tissue Culture Media Preparation

(http://www.youtube.com/watch?v=ltbdM3boWmU)

Video - Aseptic Transfer Techniques (http://www.youtube.com/watch?v=zd0iVJrQwyY)