1-Amplificazione Di DNA Per PCR
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Amplificazione di DNA mediante PCRArgomenti della lezione
-concetti di base sulla PCR
-ottimizzazione dei protocolli di PCR
-clonaggio di frammenti di DNA ottenuti mediante PCR
-amplificazione di RNA (RT-PCR)
-PCR quantitativa
Concetti di base sulla PCR.
Polymerase Chain Reaction (PCR):tecnologia che consente di amplificare enzimaticamente in vitro in modo specifico sequenze di DNA o di RNA anche rare in una miscela
1
1 x 109PCR
DNA
di DNA o di RNA anche rare in una miscela complessa, quando siano note le estremità 5’ e 3’ della sequenza stessa.
Primer a RNA
Nuovo filamento
DNA polimerasi
Il principio a cui si ispira la PCR è la replicazione del DNA:
REPLICAZIONE
5’3’
5’ 3’DNA stampo
PCR
DNA stampo
Nuovo filamento
Primers a RNA
3’
Primer oligonucleotidico
5’3’
DNA polimerasi termostabile
Nuovo filamento
5’
5’3’5’3’
Questa tecnologia ha permesso di procedere ad esperimenti che prima erano impossibili e ha numerose applicazioni nel campo della ricerca di basee della diagnostica:
-clonaggio DNA e cDNA, librerie-mutagenesi in vitro-ingegnerizzazione DNA-ingegnerizzazione DNA-fingerprinting in scienza forense-test diagnostici per la presenza di agenti infettivi-diagnosi prenatale di malattie genetiche-analisi di predisposizione genetica a patologie -analisi di variazioni di sequenza alleliche-sequenziamento di DNA e cDNA-analisi della struttura dei trascritti a RNAetc………..
Quanto è potente la PCR?
-la PCR può amplificare una quantità di DNA visualizzabile in gel-elettroforesi in circa 2h
-il DNA templato non deve essere necessariamente altamente puro (si può amplificare addirittura da colonie batteriche bollite)
-la PCR può amplificare una singola molecola di DNA
-la lunghezza del frammento di DNA da amplificare può essere in linea teorica ampiamente variabile, fino anche a 25kb. Si ha però un drastico calo di efficienza di amplificazione con target >3kb. Mediamente i frammenti che si amplificano sono nel range di 100-1500bp
Prima dell’avvento della PCR l’analisi genetica si avvaleva di varie tecniche:
-Southern blotting (1975): permise il rudimentale mappaggio di geni
-sequenziamento di DNA (1978): richiedeva il clonaggio di geni in vettori
-la costruzione di library di geni e il loro screening richiedeva molti mesi di lavoro
Le basi teoriche della PCR furono probabilmente descritte già negli anni ’70 (Klippe et al 1971 J Mol Biol 56, 341-346), ma suscitò particolare interesse solo nella metà degli anni ’80 quando Kary Mullisdescrisse una tecnica che consentiva di ottenere descrisse una tecnica che consentiva di ottenere grosse quantità di DNA di geni a copia singola dal DNA genomico.
The article from 1971 in which Kleppe et al. describe Repair replication – basically the same principle as PCR!
J. Mol. Biol. (1971) 56 341-361
L’invenzione della PCR
• Inventata da Kary Mullis nel 1983.
• La prima • La prima pubblicazione appare nel 1985.
• Nobel nel 1993.
PCR
5’3’
primer 1
5’ 3’
3’ 5’
primer 2
i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano
i primers si estendono
complementarietà al primer 1
5’ 3’
complementarietà al
5’
3’3’5’
regione di interesse
3’5’
complementarietà al primer 1
complementarietà al primer 2
i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano
i primers si estendono
I°step III°step
3’ 5’
complementarietà al primer 2
i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano
5’3’
3’5’i primers si estendono
3’5’
5’3’
filamenti di lunghezza omogenea
filamenti di lunghezza variabile
3’5’
5’3’
3’5’
5’3’
II°step
Frammenti desiderati (quelli di lunghezza variabile non sono mostrati)
E così via
Base teorica della PCR.
Nella reazione sono presenti tre segmenti di DNA: un segmento a doppia elica da amplificare (templato) e
5’
3’
3’
5’
regione di interesse
segmento a doppia elica da amplificare (templato) e due oligonucleotidi a singola elica che lo fiancheggiano e che funzionano da primer della reazione.
Inoltre intervengono una componente proteica enzimatica (DNA polimerasi), i trifosfodesossiribonucleotidi (dNTPs), un tampone di reazione, sali.
Protocollo della reazione.
primer 1
5’ 3’
3’ 5’
primer 2
i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano
5’
3’
3’
5’
regione di interesseI°step
La procedura della PCR prevede l’uso di oligonucleotidi sintetici complementari alle regioni 3’ del segmento di DNA target (templato).
Gli oligonucleotidi sono aggiunti in largo eccesso rispetto al segmento di DNA da amplificare.
Ibridizzano sugli strand opposti del templato e sono orientati con le loro estremità di fronte l’una all’altra, così che la sintesi ad opera della DNA polimerasi (che dirige la crescita in direzione 5’ →3’) si estende attraverso il segmento di DNA tra loro.
primer 1
5’ 3’
3’ 5’
primer 2
i filamenti vengono separati ed i primers si appaiano
i primers si estendono
complementarietà al primer 1
5’ 3’
complementarietà al primer 2
5’
3’3’5’
regione di interesseI°step
94-96°C
50-60°C
72°C
I primer vengono aggiunti al DNA e la temperatura viene prima alzata a 94-96°Cper denaturare il templato e separare i due strand complementari e poi abbassata a circa 50-60°C. A tale temperatura il DNA templato rimane denaturato perché gli strands complementari si trovano a concentrazioni troppo basse nella miscela di reazione per incontrarsi durante il breve periodo di incubazione, ma gli oligonucleotidi specifici, che sono a concentrazione molto elevata, possono ibridizzare con le regioni del templato ad essi complementari. Questi oligonucleotidi servono così da primer per la sintesi della catena di DNA, che avviene a temperatura di 60-72°C a seguito dell’aggiunta di una miscela di reazione contenente dNTPs e l’enzima DNA polimerasi.
Le 3 fasi di reazione sono quindi:
-denaturazione del templato (94-96°C)
-annealing dei primer al -annealing dei primer al templato (50-60°C)
-sintesi (extension) del DNA (60-72°C)
Un ciclo di sintesi risulta in due nuovi strand complementari, che, come le eliche parentali, possono ibridizzare con i primer a seguito di un successivo ciclo di denaturazione e annealing e funzionare quindi a loro volta da templato.da templato.La quantità del templato si duplica ad ogni successivo ciclo di denaturazione, annealing ed estensione, accumulandosi in maniera esponenziale così che 30 cicli dovrebbero risultare in 2 30
molecole di DNA.
I primi 4 cicli della PCR in dettaglio
DNA stampo
Frammento desiderato
1° ciclo2° ciclo
3° ciclo 4° ciclo
35° ciclo
Amplificazione esponenziale
21 = 2 22 = 4 23 = 8 24 = 16 235Numero di copie di DNA contenenti il frammento
desiderato
Numero di copie di DNA della corretta lunghezza contenenti
il frammento desiderato 0 0 2 8
PCR Cycling
• 30–35 cicli:– denaturazione (95°C), 30 sec.
– annealing (55–60°C), – annealing (55–60°C), 30 sec.
– estensione (72°C),tempo in base alla lunghezza dell’amplicone.
���������������� �� ��� �������� �������� ��
CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY
0 1 1 1 11 2 2 2 22 4 4 3 33 8 7 6 54 16 13 10 85 32 25 19 146 64 47 34 247 128 89 61 418 256 170 110 709 512 323 198 11910 1,024 613 357 20211 2,048 1,165 643 34312 4,096 2,213 1,157 58313 8,192 4,205 2,082 99014 16,384 7,990 3,748 1,68415 32,768 15,181 6,747 2,86216 65,536 28,844 12,144 4,86617 131,072 54,804 21,859 8,27218 262,144 104,127 39,346 14,06319 524,288 197,842 70,824 23,907
Quante copie?-in realtà non si formano prodotti utili fino a circa il terzo ciclo-l’accumulo non è esponenziale nella prima fase-a 30 cicli ci sono circa 1073741764 copie (circa 1x109)
37
���������������������������������������� �
19 524,288 197,842 70,824 23,90720 1,048,576 375,900 127,482 40,64221 2,097,152 714,209 229,468 69,09222 4,194,304 1,356,998 413,043 117,45623 8,388,608 2,578,296 743,477 199,67624 16,777,216 4,898,763 1,338,259 339,44925 33,554,432 9,307,650 2,408,866 577,06326 67,108,864 17,684,534 4,335,959 981,00727 134,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667,71128 268,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835,10929 536,870,912 121,298,220 25,287,311 4,819,68630 1,073,741,824 230,466,618 45,517,160 8,193,466
La procedura iniziale prevedeva l’utilizzo del frammento diKlenow dell’enzima DNA polimerasi di E.Coli che veniva aggiunto fresco ad ogni ciclo di amplificazione: questo enzima essendo termolabile veniva infatti inattivato durante il passaggio di denaturazione del DNA.
L’avvento della Taq DNA polimerasi da Thermophilus L’avvento della Taq DNA polimerasi da Thermophilus aquaticus (Saiki et al 1988) ha notevolmente facilitato l’automazione di tale procedura e ha permesso di lavorare a temperature di annealing e di estensione (72°C) molto più elevate, aumentando così la stringenzastringenza dell’ibridazione fra primer e templato e quindi la specificitàspecificità del prodotto amplificato.
COMPONENTI di una REAZIONE di PCR
Stampo DNA a doppio filamento
Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP
PrimersOligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio
dGTP, dCTP
Tampone contenente cloruro di magnesio
Lo ione Mg2+ è essenziale per il funzionamento dell’enzima
EnzimaTradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus
Ottimizzazione dei protocolli di PCR.
Molte sono le variabili che possono influenzare l’efficienza della PCR. Ogni PCR è una reazione a sé da ottimizzare, nel senso che condizioni che sono funzionali ed efficienti in una certa PCR possono non esserlo in altre PCR.Le principali variabili da tenere in considerazione nel mettere a punto un protocollo di PCR sono:
-concentrazione di MgCl2-purezza dei reagenti -selezione dei primers-purezza e quantità del templato-tipo di enzima utilizzato-hot start PCR-uso di enhancers-parametri del termociclatore
Concentrazione di MgCl2.
Generalmente nella messa a punto di un protocollo di PCR è necessario determinare la concentrazione ottimale di MgCl2, indispensabile per il funzionamento della Taq e dalla cui concentrazione dipende anche la fedeltà della reazione (un eccesso causa una perdita di fedeltà). Il Mg viene anche chelato da stampo, primers e dNTPs.
Gli enzimi e i loro buffer di reazione vengono venduti Gli enzimi e i loro buffer di reazione vengono venduti privi di MgCl2 per permettere appunto all’operatore di settare la concentrazione ottimale per il proprio protocollo e per il proprio set primers/templato. A volte bisogna trovare un compromesso tra resa e specificità.
In genere vengono utilizzate concentrazioni che vanno da 1.5 mM a 5 mM(e oltre in alcuni casi).L’uso di enhancers permette di aumentare la molarità del sale nel tampone di reazione.
Purezza dei reagenti.
La presenza di contaminanti (Dnasi, Rnasi etc) nella miscela di reazione può avere un effetto deleterio sulla reazione stessa.
E’ necessario pertanto utilizzare materiale plastico monouso preferibilmente autoclavato o comunque sterilizzato per evitare la possibile contaminazione con DNAsi e puntali con filtro per evitare possibili aerosol durante il pipettamento.evitare possibili aerosol durante il pipettamento.
E’ inoltre buona regola utilizzare piccole aliquote di ciascuno dei componenti della miscela di reazione per evitare contaminazioni da DNA precedentemente amplificato (carry-over).
Selezione dei primer.
Questo è senz’altro il fattore più critico da considerare e il meno facilmente prevedibile nella messa a punto di un protocollo di PCR.
Primer che in linea teorica dovrebbero funzionare al meglio Primer che in linea teorica dovrebbero funzionare al meglio in determinate condizioni, non necessariamente possono dare i risultati sperati.
Per massimizzare la possibilità che una coppia di primers funzioni al meglio occorre comunque considerare alcuni parametri.
Criteri di scelta dei primer.
1-specificità
I primers sono disegnati in modo da essere esattamente complementari alla sequenza target.
Un buon primer dovrebbe ibridare efficacemente solo con la sequenza di interesse e dare ibridazione non significativa con altre sequenze di DNA contenute nel templato. Esistono al riguardo dei programmi on-line che consentono di verificare questo parametro (es: Blast).
In alcuni casi però si rende necessario l’uso di primers non perfettamente complementari. Nel caso ad esempio che si voglia amplificare un gene di cui è nota solo la sequenza proteica o nel caso in cui si voglia isolare un gene omologo ad un gene di un’altra specie, si rende necessario l’uso di primer degenerati: in tali casi è preferibile avere la regione di mismatch nella zona in 5’ del primer mentre è meglio evitare mismatch e degenerazioni nella regione 3’ altrimenti mismatch e degenerazioni nella regione 3’ altrimenti l’estensione può non avvenire.
R = A, G H = A, C, TY = C, T B = C, G, TW = A,T V = A, C, GM = A,C D = A, G, TK = G, T N o I= A, C, G, TS = C, G
2- lunghezza dei primer
La lunghezza ottimale dei primer è di 20-30 basi (più lunghi quando ricchi di A/T). Primer più lunghi non aumentano la specificità dell’amplificazione.
3-temperatura di annealing
Le temperature di annealing dei due primer dovrebbero essere Le temperature di annealing dei due primer dovrebbero essere simili
La Tm dipende dalla lunghezza e dalla sequenza del primers. Approssimativamente:
Tm = 4(G+C)+2(A+T)°C
~ 2-5°C al di sotto della più bassa Tm dei due primers usatiT annealing
Se la Ta dei due primers è molto diversa si possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento.
4-sequenza
La sequenza dei primer è estremamente importante.
-Essi devono avere un contenuto in GC simile a quello del templato, e comunque attorno al 45-50%.
-E’ meglio evitare stretches di basi uguali, per evitare possibili -E’ meglio evitare stretches di basi uguali, per evitare possibili strutture secondarie, che possono aumentare notevolmente la Tm. Esistono a tale proposito dei programmi che sono in grado di predire possibili strutture secondarie nelle condizioni di PCR scelte per il proprio protocollo.
-L’ultima base in 3’ dovrebbe essere una G o una C
-Assenza di sequenze ripetute e invertite che possano far ripiegare i primer su se stessi formando un hairpin
5´-GTTGACTTGATA||||| T
3´-GAACTCT3´-GAACTCT
In questo caso inoltre la regione 3’ è annealata e si impedisce l’annealing al templato
-Inoltre i primer possono formare dei dimeri (primer-dimers) derivati dall’annealing delle regioni 3’ dei primer stessi, che possono essere estesi dalla polimerasi: questi prodotti spuri competono con il templato target per l’amplificazione diminuendo in questo modo l’efficienza della PCR.
5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´
||||||||||
3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´
Purezza e quantità del templato.
Alcuni contaminanti che si possono trovare nelle preparazioni di DNA possono diminuire l’efficienza della PCR. Tra questi urea, SDS, sodio acetato, e agarosio (derivato dalla purificazione su gel del DNA).L’estrazione con solventi organici e la precipitazione del campione possono minimizzare questi problemi. campione possono minimizzare questi problemi.
Per quanto riguarda la quantità di templato occorre considerare che una quantità eccessiva può naturalmente aumentare la quantità anche di contaminanti, e può anche facilitare la presenza di prodotti aspecifici di amplificazione
Tipo di enzima utilizzato.
Taq DNA polymerase
Thermus aquaticus
Le caratteristiche peculiari della Taq polimerasi sono essenzialmente la capacità di essere sottoposta a continui cicli di riscaldamento e raffreddamento e di sintetizzare DNA a temperature che evitano la formazione di strutture secondarie e l’annealing imperfetto e non specifico dei primers. Questo enzima è molto processivo e rimane stabile per molti cicli di PCR ma poi tende a esaurirsi. L’aggiunta di maggiori quantità di enzima può talvolta aumentare l’efficienza della PCR ma può anche portare alla produzione di prodotti aspecifici.
Una caratteristica molto importante della Taq polimerasi è la sua possibilità di errore (bassa fedeltà) che non è del tutto trascurabile, infatti misincorpora una base ogni 104. Un target di 400 bp conterrà un errore nel 33% delle molecole dopo 20 cicli.
La distribuzione degli errori è random.
L’enzima manca infatti di un’attività proofreading 3’-5’ nucleasica, che L’enzima manca infatti di un’attività proofreading 3’-5’ nucleasica, che diminuisce la possibilità di errore in altre polimerasi. Questo rappresenta un problema in alcune situazioni, ad esempio quando si vuole clonare o sequenziare un frammento di DNA.
Il problema può essere risolto con l’utilizzo di polimerasi termostabili con attività proof-reading (Pfu e Vent polimerasi), che in genere hanno però efficienze inferiori.
Un’altra importante caratteristica di Taq pol è la tendenza ad addizionare in 3’ dei nucleotidi in più, in particolare A.
Questo può essere un problema quando si vuole fare un clonaggio blunt-end in quanto le estremità dei prodotti di PCR devono essere bluntate per avere ligazione con un vettore blunt-ended. Viceversa questa proprietà può essere sfruttato nel clonaggio in vettori appositamente costruiti (TA cloning vectors).
Altri enzimi termostabili possono essere utilizzati in alternativa alla Taq polimerasi
Uso di enhancers.
-Alcune sostanze possono aumentare la stabilità e la processivitàdell’enzima o aumentare la stringenza dell’annealing.
-L’effetto di queste sostanze non può però essere facilmente predetto (ciò che migliora l’efficienza di una coppia di primer può diminuire quella di un’altra coppia).diminuire quella di un’altra coppia).
-Detergenti non ionici (Triton X100,Tween20, Nonidet P40): neutralizzano le cariche di detergenti usati nella preparazione del templato. Alcune sostanze stabilizzano e aumentano l’attività della polimerasi (BSA, gelatina , glicerolo), altre aumentano la solubilità (DMSO), l’ammonio-solfato è richiesto da alcune polimerasi, la formamide può diminuire la Tm di dsDNA.
Parametri del termociclatore.
Ogni step della PCR richiede un certo tempo per essere efficace e al contempo un tempo eccessivo può essere deleterio per la polimerasi.
I parametri da impostare sul termociclatore dipendono essenzialmente dalla sequenza e dalla lunghezza del templato e dalla sequenza e dalla complementarietà dei primer.e dalla sequenza e dalla complementarietà dei primer.
94°C 5 min30 cicli 94°C 30 sec50-60 °C 30 sec72°C 60 sec/kb
-La fase di denaturazione è in genere molto rapida (94°C 30 sec)(94°C 30 sec)
-Per certi templati ricchi in GC può essere necessario usare temperature più alte.
-La fase di annealing è critica per l’appaiamento dei primer .
-Primer con un contenuto in GC<50% richiedono basse T (<55°C), mentre primer ricchi in GC richiedono temperature
TANN troppo bassa amplificazione aspecifica
�TANN troppo alta amplificazione con bassa resa�
(<55°C), mentre primer ricchi in GC richiedono temperature più alte.
-Temperature troppo basse possono però facilitare la formazione di prodotti spuri.
-E’ buona regola quindi ottimizzare la temperatura di annealing di ciascuna coppia di primer.
Ottimizzazione della temperatura di annealing
E’ possibile usare un termociclatore a gradiente
La fase di estensione avviene a temperatura di 72°C che è ottimale per la Taq polimerasi.
-La durata di questa fase dipende dalla lunghezza del frammento da amplificare: la processività dell’enzima frammento da amplificare: la processività dell’enzima è infatti di circa 1000b al minuto.
Importante è anche la scelta del numero di cicli che dipende dall’efficienza della PCR e dalla quantità di templato.
- Mediamente vengono fatti circa 30 cicli.
- Un numero eccessivo di cicli può ridurre la specificità - Un numero eccessivo di cicli può ridurre la specificità dell’enzima.
-Spesso al termine della PCR può essere utile aggiungere un ciclo a 72°C più lungo per permettere all’enzima di completare tutti gli strand (estensione finale).
Quanti cicli effettuare?
-Aumentare il numero di cicli oltre 35-40 ha effetti molto piccoli
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR CYCLE NUMBER
AMOUNT OF DNA
effetti molto piccoli
-il plateau si raggiunge quando i reagenti sono consumati e la DNA polimerasi danneggiata
10
Hot start PCR.
Poichè la Taq polimerasi ha una certa attività anche a temperatura ambiente, possono generarsi dimeri di primer e prodotti aspecifici derivati dall’annealing dei primer in regioni a bassa complementarietà, che riducono l’efficienza di amplificazione dei prodotti specifici.
STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’
Per evitare questo problema si può seguire un protocollo detto hot-start, in cui viene omesso uno specifico reagente essenziale nella reazione (in particolare il MgCl2 o l’enzima) prima di iniziare lo step di denaturazione oppure mantenendo la miscela di reazione in ghiaccio. L’uso di questi accorgimenti aumenta notevolmente la specificità, la sensibilità e la resa del processo.
Sono in vendità polimerasi Hot start e vari sistemi hot start (Amplitaq gold, palline di cera etc)
STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’
TOUCHDOWN PCR
Den. 30 sec 94°C
Ann. 30 sec Tm(+5°C) -1°C/ciclo
All. 1 min/Kb 72°C
10 cicli
Den. iniziale 3-5 min 94°C 1
ciclo
ò
Den. 30 sec 94°C
Ann. 30 sec Tm(-5°C)30cicli
Den. iniziale 3-5 min 94°C 1
ciclo
ò
PCR CLASSICA
Den. 30 sec 94°C
Ann. 30 sec Tm(-5°C)
All. 1 min/Kb 72°C
20cicli
ò
òAll.finale 7 min 72°C
1 ciclo
Manteni-mento 4°C
Ann. 30 sec Tm(-5°C)
All. 1 min/Kb 72°C cicli
òAll.finale 7 min 72°C
1 ciclo
Manteni-mento 4°C
STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’
NESTED PRIMER PCR
Procedura:
L’amplificazione è realizzata con un set di primers
ü
ü Il prodotto è riamplificato con un set di primers interni ai precedenti
5’ 3’Ia PCR
I prodotti non specifici amplificati nella Ia PCR non saranno amplificati nella IIa
5’3’
3’5’
3’ 5’
IIa PCR5’3’
3’5’
5’
3’5’
3’
primer. nested Primernested
Clonaggio di frammenti di DNA ottenuti mediante PCR.
→ La PCR è un mezzo estremamente potente per l’amplificazione di molecole di DNA anche estremamente rare.
→La PCR può essere quindi utilizzata per il clonaggio di una sequenza di interesse in un opportuno vettore.sequenza di interesse in un opportuno vettore.
→ La Taq polimerasi ha una certa possibilità di errore, per cui i frammenti clonati in vettori mediante PCR vanno sempre sequenziati per verificare che si tratti dell’amplificato corretto.
→L’efficienza del clonaggio può essere aumentata aggiungendo estremità adatte ai frammenti amplificati.
TA overhang cloning.
Un protocollo molto semplice di clonaggio sfrutta la capacità della Taq polimerasi di aggiungere dei residui A in coda ai prodotti di amplificazione.
5’ A-3’
5’3’-A
Siti di clonaggio multiplo
� �
Si generano quindi delle estremità overhanging in 3’che possono essere facilmente ligate in vettori che a loro volta contengono delle estremità T overhanging artificialmente prodotte.
TA Cloning® Kit - One-Step PCR CloningDescription
Blunt-end cloning
Viceversa queste estremità aggiunte dalla polimerasi Taq impediscono il clonaggio blunt-end in vettori blunt-ended.
Queste extra A possono essere però rimosse con il frammento Queste extra A possono essere però rimosse con il frammento Klenow della DNA polimerasi di E Coli o con la T4 DNA polimerasi. Si generano così dei frammenti di PCR blunt-ended.
Clonaggio direzionale
Frammenti di DNA possono essere amplificati per PCR facendo in modo che contengano alle loro estremità 5’ delle sequenze riconosciute da enzimi di restrizione compatibili con siti di restrizione che si trovano nel sito di restrizione che si trovano nel sito di clonaggio del vettore utilizzato.
A tale scopo il frammento di DNA amplificato viene digerito con gli opportuni enzimi di restrizione, purificato e ligato nel vettore opportuno.
Amplificazione di RNA (RT-PCR).
La quantità di RNA per studi di vario tipo è spesso ridotta.
La PCR può essere utilizzata per preparare grandi quantità di cDNA da utilizzare in applicazioni successive quali il clonaggio.
Questa tecnica utilizza l’attività enzimatica della trascrittasi Questa tecnica utilizza l’attività enzimatica della trascrittasi inversa, enzima che è in grado di copiare una molecola di RNA in DNA complementare utilizzando come primer un oligonucleotide.
Il prodotto della reazione è un prodotto ibrido RNA/DNA.
Dopo allontanamento dell’RNA, il cDNA può essere utilizzato come templato per l’amplificazione enzimatica (PCR).
La trascrittasi inversa è una DNA polimerasi RNA dipendente, codificata da retrovirus.
Esistono diversi enzimi utilizzati in biologia molecolare
-Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV-RT)-Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV-RT)-Avian Myleoblastosis Virus AMV-Tth DNA polimerasietc
Ha essenzialmente due attività:
DNA polimerasi, che viene sfruttata in laboratorio per retrotrascrivere molecole di RNA (essenzialmente mRNA) in DNA complementare.
2-RNAse H, che degrada gli ibridi DNA-RNA che si formano durante la retrotrascrizione.
Viene quindi utilizzata per clonaggio di cDNA e per RT-PCR.
Nel pianificare un protocollo per l’amplificazione di un RNA occorre considerare alcuni punti:
-metodo di preparazione dell’ RNA
-disegno dei primer-disegno dei primer
-sintesi del primo strand del cDNA con il primer più adatto
-amplificazione enzimatica
Metodo di preparazione dell’ RNA
contaminazione del campione di RNA con DNA genomico
La PCR non è in grado di discriminare fra cDNA e DNA genomico.
E’ opportuno trattare il campione con DNasi (da inattivare dopo 30 min!!) prima di utilizzarlo in RT-PCR.
Un ulteriore controllo consiste nell’effettuare un’amplificazione del campione senza retrotrascriverlo.retrotrascriverlo.
L’uso di RNA arricchito in mRNA utilizzando colonne oligodT migliora la purezza del campione.
Un ulteriore accorgimento è quello di scegliere come primer per la retrotrascrizione l’oligodT e come primer per l’amplificazione oligo posizionati su due esoni diversi (pseudogeni spesso intronless e con code di poliA possono comunque essere amplificati).
problema della degradazione dell’RNA
Usare materiale decontaminato da RNAsi!!
Preparazioni da materiale fresco, uso di sostanze stabilizzanti (tipo RNAlater).
Per ottenere full lenght cDNA il problema della degradazione è molto
Metodo di preparazione dell’ RNA
Per ottenere full lenght cDNA il problema della degradazione è molto importante, mentre per amplificare ampliconi piccoli si può tollerare un certo grado di degradazione.
metodo di purificazione
Si può utilizzare RNA totale o RNA citoplasmatico o poly(A)+RNA a seconda del target
Disegno dei primer specifici
-Secondo le regole di PCR
Sintesi del primo strand del cDNA con il primer più adatto
-Possono essere usati a tale scopo primer diversi in funzione di ciò che si vuole ottenere
-oligodT
-primer specifici
-esanucleotidi random
Amplifica a partire dal poliAcDNA completo
Amplifica a partire dal sito del primer reverseFrammento desiderato/CDS completa
Amplifica un po’ tutto il mRNA ma a pezzicDNA non completo/utile nella RT-PCRquantitativa
Amplificazione enzimatica
Utilizza l’enzima trascrittasi inversa per trasformare la sequenza di RNA in cDNA e questa reazione è seguita da PCR per amplificare il cDNA. per amplificare il cDNA.
Occorre quindi valutare la scelta dell’enzima retrotrascrittasi e disegnare un protocollo di amplificazione adatti ai propri scopi.
PCR QUANTITATIVAPCR QUANTITATIVA
PCR quantitativa.
L’applicazione di test basati sull’analisi degli acidi nucleici per, ad esempio, la diagnosi di alterazioni genetiche (duplicazioni geniche) o di infezioni virali o per lo studio dell’espressione genica senza amplificazione ha generalmente lo svantaggio della bassa sensibilità delle tecniche usate:della bassa sensibilità delle tecniche usate:
-southern blotting-northern blotting-RNAse protection assay-dot blot-in situ hybridization
La tecnologia della PCR ha aumentato enormemente la sensibilità di queste tecniche mantenendo una elevata specificità.
Nonostante ciò le caratteristiche intrinseche della Nonostante ciò le caratteristiche intrinseche della reazione di PCR non permettono il suo utilizzo nel formato convenzionale per quantificare gli acidi nucleici.
I fattori che contribuiscono alla elevata variabilità nell’efficienza della reazione di PCR agiscono a 3 livelli:
1-preparazione del campione1-preparazione del campione
2-amplificazione
3-detezione del prodotto
1-preparazione del campione
. estrazione dell’ RNA o del DNA e recupero (qualità del templato)
. reazione di retrotrascrizione (se RNA)
. manipolazione e stockaggio dei campioni da analizzare
2-amplificazione
La reazione di PCR ha una cinetica esponenziale fino al punto in cui viene raggiunta la fase di plateau, che gioca un ruolo fondamentale nel determinare la quantità del prodotto finale.
AMOUNT OF DNA
10
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR CYCLE NUMBER
AMOUNT OF DNA
La quantità finale di prodotto dipende da vari fattori quali:
-cinetica di annealing dei primer-concentrazione dei diversi reagenti-numero di cicli-incompleta denaturazione del DNA-reannealing dei prodotti di PCR soprattutto negli ultimi cicli-reannealing dei prodotti di PCR soprattutto negli ultimi cicli-temperature di cycling-lunghezza dei cicli-tempi di ramping-formazione di dimeri di primer-contaminanti/inibitori
3-detezione del prodotto
L’ analisi quantitativa della PCR può essere fatta
-in fase logaritmica
-in end-point
AMOUNT OF DNA-in end-point
10
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR CYCLE NUMBER
AMOUNT OF DNA
All’inizio di una reazione di amplificazione, i reagenti sono in eccesso, templato e prodotto sono a concentrazioni talmente basse che la rinaturazione del prodotto non compete con il legame dei primer. In questo modo l’amplificazione procede ad una velocità esponenzialeesponenziale costante.
Il momento in cui la velocità di reazione cessa di essere esponenziale ed entra nella fase linearelineare di amplificazione è estremamente variabile, anche fra replicati dello stesso campione. Sembra essere dovuto principalmente al fatto che la rinaturazione dei prodotti compete con il legame dei primer, poiché l’aggiunta di reagenti o enzima non ha effetto.
Successivamente la velocità dell’amplificazione si avvicina allo zero (plateauplateau) e viene ottenuto pochissimo prodotto.
Per avere accurateza e precisione ottimalioccorrerebbe considerare una quantificazione nel punto in cui ciascun campione si trova nella fase esponenzialefase esponenzialedi amplificazione.
End-point (RT)-PCR
E’ tuttora una tecnica ancora molto usata.
Richiede però una messa a punto molto lunga e laboriosa relativamente alla determinazione del range di amplificazione esponenziale per ogni mRNA in studio, alla scelta del controllo interno e/o competitore, alla preparazione degli standard interni etc. interni etc.
3 replicati dello stesso campione
Svantaggi della END-Point PCR:
Bassa precisioneBassa sensibilitàRange dinamico limitato (<2 log)Non automatizzataEtidio bromuro poco quantitativo, poco sensibile e poco risolutivoProcessamento post-PCR
Nei 96 replicati il plateau si ottiene nello stesso punto, ma questo è solo dovuto al fatto che il plot è in scala logaritmica
Gli stessi replicati visti in plot lineare evidenziano invece un netta separazione dei campioni in fase di plateau.
Quindi se la quantificazione fosse fatta a plateau non sarebbe corretta!!!
Le diluizioni seriali sembrano arrivare a plateau nello stesso punto anche se la fase esponenziale mostra chiaramente una differenza tra i vari punti della diluizione.
Quindi se la quantificazione fosse fatta a plateau non sarebbe corretta!!!
Real-time quantitative PCR
Teoricamente esiste una relazione quantitativa tra la quantità di campione iniziale e quantità di prodotto di PCR ad ogni dato ciclo.
La real-time PCR rileva la quantità di amplicone durante tutta la reazione.I dati vengono misurati durante la fase esponenziale, momento ottimale per analizzarli.La real-time PCR automatizza il laborioso processo di quantificazione e permette un range dinamico molto più ampio (107)
Esistono numerosi protocolli e chimichechimiche diverse per Real-time PCR.
Sono tutti basati sulla detezione di prodotti di PCR attraverso la generazione di segnali fluorescenti-
Quelli usati più frequentemente sono:
TAQMAN PROBESTAQMAN PROBES
BEACONSBEACONSBEACONSBEACONS
SYBR GREENSYBR GREEN
I primi due dipendono dalla Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per generare il segnale fluorescente attraverso l’accoppiamento di una molecola fluorescente e di un quencher.
Il SybrGreen è invece un colorante fluorescente che ha bassa fluorescenza in soluzione ma emette un forte segnale fluorescente legandosi a DNA a doppia elica.
FRET= fluorescence resonance energy transfer(TaqMan probes, Molecular Beacons)
TaqMan Probes
Basata sull’uso di sonde fluorogeniche disegnate per ibridare con una sequenza target e di generare un segnale che si accumula durante i cicli di PCR in maniera proporzionale alla concentrazione dei prodotti di amplificazione.
Questa tecnica permette quindi di misurare il segnale durante la fase esponenziale di amplificazione.
Maggiore è il numero di copie di DNA iniziali, prima si ha emissione di segnale fluorescente.
PRINCIPIO DELLA TaqMan REALPRINCIPIO DELLA TaqMan REAL--TIME RTTIME RT--PCRPCR
Il test è basato sull’uso del 5’nuclease5’nuclease--assayassay: : utilizza l’attività 5’esonucleasica della Taq polimerasi per tagliare una sonda non estendibile durante la fase di estensione della PCR
La sonda è marcata con due coloranti fluorescenti covalentemente legati alle due estremità:
-R in 5’ (REPORTER)
-Q in 3’ (QUENCHER)
Quando viene eccitato il colorante R trasferisce energia alla molecola Q adiacente invece che emettere fluorescenza (FRET = Förster or fluorescence resonance energy transfer). Quindi la stretta vicinanza di R e Q previene l’emissione della fluorescenza quando la probe è intatta
Le sonde Taqman sono disegnate in modo tale che si appaiano ad una regione interna del prodotto di PCR.
Real Time PCR
TaqMan™
A causa della vicinanza dei due coloranti la fluorescenza emessa da R è soppressa dalla presenza di Q.Durante la fase di annealing dei cicli di PCR, la probe si ibridizza specificamente al corrispondente templato. Quando la polimerasi replica il templato a cui è legata la sonda Taqman, la sua attività
Real Time PCR
TaqMan™
sonda Taqman, la sua attività 5’-3’ esonucleasica taglia la sonda. Questa degradazione separa fisicamente R da Q e risulta in un aumento di emissione di R senza modificare l’emissione di QL’emissione di fluorescenza aumenta ad ogni ciclo in maniera proporzionale al taglio della sonda.
Il segnale viene monitorato in real-time usando un sequence detector collegato ad un thermal cycler. La misurazione della fluorescenza viene fatta continuamente durante l’amplificazione.
���
������������
����������� ����
����������� ����
����������������������
��������������
������� ��
���������������������������
Il software del computer calcola il termine ∆∆∆∆∆∆∆∆RnRn che riflette la quantità di probe degradata e segue una funzione esponenziale che genera un amplification plotamplification plot per ciascun campione usando l’equazione:
∆Rn = (Rn+) – (Rn-)
con
Rn+ = intensità di emissione del reporter/intensità di emissione del quencermisurate in ogni istante e per ogni tubo di reazione.
Rn- = intensità di emissione del reporter/intensità di emissione del quencermisurate all’inizio della reazione di amplificazione e per ogni tubo di reazione.
AMPLIFICATION PLOTAMPLIFICATION PLOT
Durante i primi cicli, il valore ∆∆∆∆Rn rimane alla baseline.
Quando una quantità sufficiente di probe è stata degradata, l’intensità di fluorescenza emessa da R aumenta.
L’ amplification plot viene esaminato durante la fase log assegnando un’arbitraria threshold basata sulla variabilità dei assegnando un’arbitraria threshold basata sulla variabilità dei dati della baseline (generalmente viene scelta una threshold a 10 deviazioni standard sopra la baseline).Una volta fissata la threshold, il punto in cui l’amplification plot la attraversa è definito come Ct (threshold cycle)che è inversamente proporzionale al numero di copie del target presenti inizialmente.
Threshold line = è il livello di detezione o il punto nel quale la reazione raggiunge un livello di intensità di fluorescenza superiore al background.Viene definita nella fase esponenziale di amplificazione.
baseline
Threshold cycle (Ct) = è il ciclo al quale ciascun campione raggiunge la threshold line
Scelta dei primer per real-time RT-PCR
������ ������������ ���
70
������ ������������ ���
������ ������ ���
MULTIPLEX PCR
Fluorecseina LC Red 640 Fluorecseina LC Red 705
Consente l’analisi simultanea di due campioni nella stessa reazione
Due coppie di Sonde di Ibridazione, ciascuna specifica per un prodotto di amplificazione, vengono marcate con un diverso colorante accettore che emette la fluorescenza a differenti lunghezze d’onda.
STRATEGIA:
Il segnale emesso viene letto simultaneamente attraverso due canali di rilevamento
fluorimetrico.
Canale 3705 nm
Canale 2640 nm
Eccitazione
Trasferimento
Emissione
Molecular BeaconsAnche i Molecular Beacons utilizzano la FRET per la detezione e la quantificazione del prodotto di PCR attraverso l’uso di un fluoroforo in 5’ e di un quencher in 3’ dell’oligonucleotide substrato.
A differenza delle TaqMan probes, i Beacons sono disegnati per rimanere intatti durante la reazione di amplificazione.
I Molecular Beacons formano uno stemstem--looploop quando sono liberi in soluzione. In questo modo la stretta vicinanza di fluoroforo e quencher previene la fluorescenza.
Quando un Molecular Beacon ibridizza al target, il fluoroforo e il quenche vengono separati e il fluoroforo emette fluorescenza se irradiato.
• Single-stranded oligonucleotide hybridization probe
• Formano uno stem-loop: stretta vicinanza di R e Q in soluzione, no fluorescenza (FRET)
• Quando la probe incontra la molecola target forma un ibrido stabile
• R e Q sono separati:emissione di fluorescenza
Molecular beacons• Buona DNA specificità e basso background • Difficili da disegnare• Molecular beacon probes devono essere preservate durante tutti i cicli di PCR
Sybr Green
E’ il metodo più semplice ed economico per fare Real-Time
SybrGreen si lega a dsDNA e sotto eccitazione emette luce, quindi a mano a mano che i prodotti di PCR si accumulano, la fluorescenza aumenta.
I vantaggi sono che costa poco, è facile da usare e sensibile.
Gli svantaggi sono relativi al fatto che SybrGreen si lega a qualsiasi dsDNA presente nella reazione, compresi i dimeri di primers e i prodotti aspecifici, il che può indurre una sovrastima della concentrazione del target.
E’ necessaria quindi una lunga e laboriosa ottimizzazione della reazione per evitare primer dimers e prodotti spuri.
nSYBR Green lega la minor groove di double stranded DNA
E’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.
DENATURAZIONENon viene rilevata fluorescenza
L’intensità della fluorescenza comincia ad aumentare
ANNEALING
SYBR Green
Primer Luce emessa
ALLUNGAMENTO
L’intensità della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine della
fase di allungamento
L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 530nm
Polimerasi
Real-time PCR
Quantificazione
-Assoluta
-Relativa
Quantificazione assoluta (metodo della curva standard)
Si basa sull’utilizzo di uno standard esterno a quantità nota (DNA plasmidico o cDNA plasmidico o RNA trascritto in vitro), la cui concentrazione viene determinata allo spettrofotometro (260 nm) e viene convertita nel numero assoluto di copie in base al peso molecolare dello standard.
Diluizioni seriali dello standard vengono amplificate simultaneamente ai campioni e viene creata in questo modo una curva standard.
Il Ct dei campioni viene così confrontato con la curva standard per determinare il numero iniziale di copie.
Diluizioni seriali
QUANTIFICAZIONE del PRODOTTO di PCR
Identificando il primo ciclo della PCR in corrispondenza del quale inizia l’amplificazione esponenziale del prodotto è possibile quantificare la concentrazione iniziale del DNA bersaglio.
104 copie105106
Fluorescenza
Curva di fluorescenza di campioni a concentrazione nota
Estrapolazione della curva standard
104 copie105106
Numero cicli
Fluorescenza
N. cicli
Log concentrazione
linea di base
La linea di base identifica il ciclo in corrispondenza del quale inizia l’aumento esponenziale della fluorescenza per ciascun campione.
Riportando in grafico il valore di intersezione con la linea di base in funzione del Log della concentrazione iniziale di ciascun campione si ottiene la curva standard da cui si può estrapolare il valore della concentrazione di campioni a titolo ignoto.
Quantificazione assoluta��������� ��� ��Amplification plot
22
������ �� ������� ��������� ��24
Curva standard
Quantificazione relativa
Questo tipo di approccio viene usato soprattutto in studi di gene-expression.
L’approccio si basa sull’uso di uno standard interno che in genere è un househouse--keeping genekeeping gene (gene che non “dovrebbe” variare nell’espressione) (reference gene).
Housekeeping genes o reference genesStesso numero di copie in tutte le cellule
Espresso in tutte le cellule
Numero medio di copie simile al target gene
I più usati sonoI più usati sonoGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)Beta-actin mRNAMHC I (major histocompatability complex I) mRNACyclophilin mRNAmRNAs per alcune proteine ribosomiali
28S or 18S rRNA
Metodo comparativo del Ct
La quantità del target viene normalizzata rispetto al controllo endogeno (house-keeping gene) ed espressa relativamente ad un campione basale (calibratore) che diventa il campione 1x, mentre tutte le altre quantità vengono espresse come n volte relativamente a quel campione.
Metodo della curva standard
Diluizioni seriali di DNA o cDNA vengono testate per il gene target e per lo standard interno, vengono costruite le due rispettive curve standard ed estrapolati i valori dei campioni sulle due curve; quindi la quantità del target viene normalizzata dividendola per la quantità di house-keeping gene
Il metodo comparativo è detto anche metodo del 2metodo del 2--∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆CtCt, dove
∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆Ct = Ct = ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct campione Ct campione –– ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct referenceCt reference
Il ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct campioneCt campione è il Ct per ogni campione normalizzato relativamente all’ housekeeping gene.
Il ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct referenceCt reference è il Ct per il calibratore normalizzato relativamente all’ housekeeping gene.
EFFICIENZA RELATIVA DEI GENI TARGET E REFERENCEEFFICIENZA RELATIVA DEI GENI TARGET E REFERENCE
Perché questo metodo sia applicabile, occorre che l’efficienza di amplificazione del target gene e del gene endogeno housekeeping siano approssimativamente uguali.Ciò può essere stabilito verificando quanto i ∆Ct dei due geni variano con la diluizione del templato.Se il plot della diluizione del DNA versus ∆Ct è vicino allo zero, allora l’efficienza di amplificazione del target gene e dell’housekeeping gene sono molto simili.
FTX
Sample Gene X Gene X Ct medio GAPDH GAPDHCt
medio ∆∆∆∆Ct ∆∆∆∆∆∆∆∆Ct 2-∆∆∆∆∆∆∆∆Ct
Gene X GAPDH
calibratore 21.7 22.01 21.855 16.29 15.99 16.14 5.715
CN 21.7 22.01 21.855 16.29 15.99 16.14 5.715 0 1
Metodo del 2Metodo del 2--∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆∆CtCt
CN 21.7 22.01 21.855 16.29 15.99 16.14 5.715 0 1
A 27.76 27.23 27.495 20.39 20.51 20.45 7.045 1.33 0.397768
B 23.89 24.07 23.98 22.34 22.27 22.305 1.675 -4.04 16.44982
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Applicazioni
ANALISI di MUTAZIONI PUNTIFORMI
Sfrutta differenze nella Tm di Sonde di Ibridazione perfettamente legate al DNAbersaglio o il cui legame è destabilizzato dalla presenza di basi non appaiate.
gene selvatico
Sonda 1marcata con Fluoresceina
Sonda 2marcata con LC Red 640
omozigote wildtypeomozigote mutanteeterozigote
3.0
2.5
2.0
Fluo
rescenza
gene mutato
La Sonda 1 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio mutata
La Sonda 2 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio non mutata
Al termine della PCR si analizza la curva di melting: se è presente una mutazione, la Tm dell’ibrido sarà più bassa che in assenza di mutazione.
Temperatura50 55 60 65 70 75 80
1.5
50 55 60 65 70 75 80 Temperatura
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
-0.05
-dF/dT
Referenze
• Applied Biosystems • http://www.rt-pcr.com• www.molecular-beacons.org• http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/• http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/