PCR - REAZIONE a CATENA della POLIMERASI

E’ “IL” mezzo per produrre in vitro grandi quantità di una specifica sequenza di DNA, partendo da DNA estremamente complesso.

Primer a RNA

Nuovo filamento

DNA polimerasi

DNA stampo

Nuovo filamento

Primers a RNA

Il principio a cui si ispira la PCR è la replicazione del DNA:

REPLICAZIONE

5’3’

5’ 3’DNA stampo

PCR

1

1 x 109

PCR

DNA

3’

Primer oligonucleotidic

o

5’3’

DNA polimerasi termostabile Nuovo filamento

5’

5’3’5’3’

Le FASI della PCR

Allungamento(~ 70°C)

Denaturazione(~ 95°C)

Annealing(~ 60°C)

DENATURAZIONE:

Il DNA viene denaturato mediante riscaldamento in provetta a ~ 92-95°C

ANNEALING:La miscela viene raffreddata fino a raggiungere la temperatura che garantisce la specifica ibridazione dei primers alle regioni dello stampo ad essi complementari

ALLUNGAMENTO:La temperatura della miscela viene portata a 68-72°C consentendo alla DNA polimerasi termostabile di sintetizzare il filamento complementare allo stampo a partire dall’innesco oligonucleotidico

5’3’

primer 1

5’ 3’

3’ 5’

primer 2

i filamenti vengono separati ed i primers si

appaiano

i primers si estendono

3’ 5’

complementarietà al primer 1

5’ 3’

complementarietà al primer 2

i filamenti vengono separati ed i primers si

appaiano5’3’

3’5’

i primers si estendono

3’5’

5’3’

filamenti di lunghezza omogenea

filamenti di lunghezza variabile

5’

3’3’5’

regione di interesse

3’5’

complementarietà al primer 1

complementarietà al primer 2

i filamenti vengono separati ed i primers si

appaiano

i primers si estendono

3’5’

5’3’

3’5’

5’3’

I°step

II°step

III°step

Frammenti desiderati (quelli di lunghezza variabile non sono

mostrati)

E così via

PCR

I primi 4 cicli della PCR in dettaglio

DNA stampo

Frammento desiderato

1° ciclo

2° ciclo3° ciclo 4° ciclo

35° ciclo

Amplificazione esponenziale

21 = 2 22 = 4 23 = 8 24 = 16 235

Numero di copie di DNA contenenti il

frammento desiderato

Numero di copie di DNA della corretta

lunghezza contenenti il frammento desiderato

0 0 2 8

PROGETTAZIONE dei PRIMERS

Caratteristiche di un buon primer:

Una sequenza di 16 bp sarà statisticamente presente solo una volta ogni 416 bp (~ 4 miliardi di basi) corrispondenti circa alla grandezza del genoma umano.

Lunghezza: 16 bp o più

La Tm dipende dalla lunghezza e dalla sequenza del primers

Tm = 4(G+C)+2(A+T)°C

~ 2-5°C al di sotto della più bassa Tm dei due primers usatiT annealing

Tm primer 1 Tm primer 2~

Se la Ta dei due primers è molto diversa si possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento.

Assenza di sequenze ripetute invertite che possano far ripiegare il primers su se stesso o di sequenze complementari fra i primers che causano l’amplificazione di dimeri dei primers

PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS

rev

rev

for

3314

842

425

GTGTGCGTACAGCGCAAC

GGGTGGGACCTGGGCGCCCCCGCCGTGAGCGCCTACTGCTCCACCTGGGACGCCGGCAAGCCGTACTCG

1859 1876

5’- -3’Primer REVPrimability of Match = 71%Stability of Match = 44%

Primer REVPrimability of Match = 100%Stability of Match = 81%

2264 2281

CATGCATGATGCTCAAATGCCGCATTGTTGCGCTGTACGCACACATGTATGAATGCATGGCACGGATCAA

GTTGCGCTGTACGCACAC

-5’3’-

GGACACGTATGCCACAGCCC

TGCTAAATTTTCCAGCTAGGTAGCAGGACACGTATGCCACAGCCCTTAAAAGCATATCTGCACATGTCTT

1442 1461

5’- -3’Primer FORPrimability of Match = 100%Stability of Match = 82%

...PROGETTAZIONE “COMPUTERIZZATA” dei PRIMERS

CTTTTGGCATAGACCACATGCCA5’ TGTTACAAGTGTGGATGGATGCC5’

GGCCAGTGAATTCAGCTCACGCCCCAAATATGCAGCTTCCAGTCCAGTTTCATCCGGCGCGCTGAAGATTTTTTAGAGCATGCTCTATTATGCAGCGTCCGTTGGAATGCTCTTTTTAACTCCGCGCGCGCTAAACTTGCGATTTTTTGGGCGCGGCGCTGATATTGGGCGTCTGTTGAAGATGCTCTTAAGTGGCCACAAGGGAGATGGGTCGGGCTAAGGTTTCATATCTTACAATATAAAGTTGAAGACGATTTGTGGCACCCAGGGGCGGGAGACGCATGCATGCAGCTGCATGATTGCACCAAGATCCGAAGAGTGGTTTATGGTTTGAGCTTAATTACTGCATGCATGCAACTTTTTGGTACAACTTTTGGCATAGACCACATGCCATCCCACCTCCCATGCTTTTCATTTTTACTTGTAAATTTGGATCTATTATATCTTTTGAATCAAAAGTTCAATTTATATTTCGTTTGCGTATTCTTGTCCCTTGTGTCGAGAGCTTTGAAACAAGCCCACTTTTGAATACGTTTTGACAAATTCTAAAAACTTAAGTGAGTTTCAACTGCTAAAACTTGATAGAATGAATGAAAAATTTAGCAAGTTTCAAAGACTAAAACTGAAACCCTAAGCCCTTAGCCCTAGATCCTAAGCCCTAAGCCGGAAGTCCTAAACCGTATGCCCCTAACA

Tm = 58.6 Tm = 56.1

Tm = 83.6

? Clear Open file Calculate Minimum stem size:Minimum 3’ overlap:

4

2

Optimal annealing temperature is 56.7. 3’ end of oligo 1 pairs to positions 5 to 10 of itself.

COMPONENTI di una REAZIONE di PCR

Stampo DNA a doppio filamento

Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP, dTTP, dGTP, dCTP

PrimersOligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio

Tampone contenente cloruro di magnesio

Lo ione Mg2+ è essenziale per il funzionamento dell’enzima

EnzimaTradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus

dNTPMg2+

I FATTORI CRITICI della PCR…nella miscela di reazione

Non utilizzare quantità eccessive di stampo, primers e/o dNTP al fine di evitare amplificazioni non specifiche.

Dosare accuratamente la [Mg2+] in funzione della quantità di stampo, primers e dNTP utilizzata

Mg2+ è indispensabile al funzionamento della Taq polimerasi, ma è chelato da stampo, primers e dNTP. Se in eccesso causa una perdita di fedeltà da parte dell’enzima.

Selezionare l’enzima più idoneo alle proprie necessità

Emivita alla temperatura di denaturazioneProcessività Capacità di correzione degli errori

Taq,Pfu...

I FATTORI CRITICI della PCR…nella programmazione

94°C1’

72°C1’

Emivita Taq polimerasi: 30 min a 95°C~30 cicli di denaturazione di 1 min

TDEN › 95°C o N. cicli › 30 Diminuire il tempo di denaturazione/ciclo

TEMPERATURA e TEMPO di DENATURAZIONE

91-97°C a seconda della complessità dello stampo

Quindi, se:

60°C30’’

TEMPERATURA e TEMPO di ANNEALING

TANN troppo bassa amplificazione aspecifica

TANN troppo alta amplificazione con bassa resa

TANN ~ TMELTING

o primers lunghi Allungare il

tempo di annealing

TEMPERATURA e TEMPO di ALLUNGAMENTO

TEMPERATURA: 68-72°C a seconda dell’enzima

TEMPO: 1min / Kb di amplificato

ALLUNGAMENTO FINALE di 7-10 min per completare la sintesi degli eventuali prodotti parziali

NUMERO di CICLI

Dipende da [stampo]iniziale

3x105 molecole iniziali

25-30 cicli

50 molecole iniziali

40-45 cicli

N.B. Dopo 30-35 cicli:

- l’attività dell’enzima si

riduce- primers e dNTP si

esauriscono

STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’

TOUCHDOWN PCR

Den. 30 sec 94°C

Ann. 30 sec Tm(+5°C) -1°C/ciclo

All. 1 min/Kb 72°C

10 cicli

Den. 30 sec 94°C

Ann. 30 sec Tm(-5°C)

All. 1 min/Kb 72°C

20cicli

Den. iniziale

3-5 min 94°C 1 ciclo

All.finale 7 min 72°C

1 ciclo

Manteni-mento

4°C

Den. 30 sec 94°C

Ann. 30 sec Tm(-5°C)

All. 1 min/Kb 72°C

30cicli

Den. iniziale

3-5 min 94°C 1 ciclo

All.

finale 7 min 72°C1

ciclo

Manteni-mento 4°C

PCR CLASSICA

...STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’

HOT START NESTED PRIMER PCR

La PCR “hot start” previene la formazione di questi prodotti non specifici in quanto un componente chiave della miscela di reazione (enzima o MgCl2) viene aggiunto dopo lo step di denaturazione iniziale.

Durante l’allestimento della reazione di PCR o durante il riscaldamento iniziale del campione si possono verificare situazioni di appaiamento non specifico fra primers e stampo.

Fra 40 e 50°C la Taq polimerasi ha un’efficiente attività polimerasica e può estendere i primers non correttamente appaiati.

Perché realizzare una PCR “hot start”?

NOVITA’: Enzimi “Hot start”

Gocce di cera

Procedura:

L’amplificazione è realizzata con un set di primers

Il prodotto è riamplificato con un set di primers interni ai precedenti

I prodotti non specifici amplificati nella Ia PCR non saranno amplificati nella IIa

5’3’

3’5’

5’ 3’

3’ 5’

Ia PCR

IIa PCR

5’3’

3’5’

5’

3’5’

3’

pr. nestedpr. nested

TT

r

CLONAGGIO dei PRODOTTI di PCR

La Taq e altre polimerasi hanno un’attività trasferasi-terminale che conduce all’aggiunta di un singolo nucleotide all’estremità 3’ dei prodotti di PCR.

In presenza dei 4 dNTPs è preferenzialmente aggiunto dA.

5’ A-3’

5’3’-A

I prodotti di PCR possono quindi essere agevolmente clonati in plasmidi aperti che contengono un deossitimidin nucleoside (dT) alle estremità 5’.

Siti di clonaggio multiplo

APPLICAZIONI della PCR

Produzione di sonde oligonucleotidichePCR

Clonaggio e manipolazione dei geniPCRPC

R

Tipizzazione dei geni e del DNA:

-caratterizzazione di ricombinanti batterici

-diagnosi cliniche

-analisi di campioni biologici in medicina legale

PCRPC

R

PCRPC

R

Mutagenesi casuale o sito-specificaPCR

PCRPC

R

CLONAGGIO e MANIPOLAZIONE di GENI

STRATEGIA

Presentano varie opzioni a certe posizioni della sequenza rendendo possibile l’annealing e l’amplificazione di sequenze omologhe da organismi differenti

Primers degenerati

R = A, G H = A, C, TY = C, T B = C, G, TW = A,T V = A, C, GM = A,C D = A, G, TK = G, T N o I= A, C, G, TS = C, G

Sequenza genica nota

Caso 1: Caso 2:

Sequenza genica omologa notao

sequenza proteica nota

Si amplifica il gene desiderato direttamente dal DNA genomico o

dall’’RNA

Si disegna un primer specifico Si disegna un primer degenerato

N.B.I primers possono essere disegnati in maniera tale da contenere al 5’ la sequenza di specifici siti di restrizione che possono essere sfruttati per l’inserimento dei prodotti di PCR nei vettori di clonaggio.

5’-TCGAATTCNCCYAAYTGNCC-3’ EcoRI

Sintesi primo filamento cDNA

AAAAA-3’7-mG

Aggiunta coda omopolimera al primo filamento cDNA

Trasferasi terminale+ dATP

Trascrittasi inversa+ GSP1

GSP1

5’3’-AAAAAAAAA

Sintesi secondo filamento cDNA

AAAAA-3’7-mGmRNA

GSP1

5’3’-AAAAAAAAA GSP1

TTTTTP

GSP1

complementarietà al primerGSP1

complementarietà al primerP(dT)

TTTTP

TTTTTP GSP1’

I° gruppo di amplificazioni

5’

5’3’

3’

5’AAAAAP’ GSP1

3’

TTTTTP GSP1’

5’ 3’

II° gruppo di amplificazioni

TTTTTP GSP1’

5’ 3’

GSP2

5’AAAAAP’ GSP1

3’

TTTTTP

5’AAAAAP’3’ GSP2

TTTTTP5’ 3’GSP2’

Prodotto PCR finale

5’ - RACE Rapid Amplification Complementary Ends

3’ - RACE Rapid Amplification Complementary Ends

Sintesi primo filamento cDNA

AAAAAAAA-3’7-mG

Trascrittasi inversa+ P(dT)

AAAAAAAA-3’7-mGmRNA

TTTTTP

Sintesi secondo filamento cDNA

GSP1

GSP1 complementarie

tà al primerP(dT)

I° gruppo di amplificazioni

TTTTT P 5’3’

complementarietà al primerGSP1

5’ GSP1

AAAAA P’ 3’

TTTTT PGSP1’

5’3’

TTTTT PGSP1’

5’3’GSP2

5’ GSP1

AAAAA P’ 3’

TTTTT P

GSP2

5’ AAAAA P’ 3’

5’3’ GSP2’

TTTTT P

II° gruppo di amplificazioni

Prodotto PCR finale

MUTAGENESI CASUALE

In che modo delle mutazioni nel gene influenzano la funzione del prodotto??

ER OR PRONE PCRR

PREMESSA:

La frequenza di errore delle DNA polimerasi è ~allo 0,001 ‰ (una base ogni 106 nucleotidi)

grazie ad un’attività corretrice 3’ 5’ che rimuove i nucleotidi male incorporati.

E’ possibile indurre l’aumento di errori nella PCR utilizzando:

Taq polimerasi prive di attività correttriceBasse temperature di annealing che diminuiscono la fedeltàIneguali concentrazioni dei dNTPElevate concentrazioni di MgCl2Alto numero di cicli (60-80)Amplificazioni successive del prodotto di PCR

primer con differenza di un solo nucleotide

sequenza bersaglio

nucleotide originale

nucleotide cambiato

LEGENDA

DNA lineare amplificato

DNA plasmidico circolare con

incisure e nucleotide cambiato

3

4

2

1

PCR PCR

Filamento 1

Filamento 2 Filamento 3

Filamento 4

Filamento 1

Filamento 3 Filamento 2

Filamento 4

Denaturazione, rinaturazione

Trasformazione di E. coli

MUTAGENESI SITO-SPECIFICA

Amplificazione sequenza bersaglio

+quantificazione dell’espressione genica

identificazione del prodotto di amplificazione specifico rispetto a prodotti aspecifici

analisi simultanea di due campioni nella stessa reazione

individuazione di mutazioni puntiformi

… on-line e in tempo reale!

REAL-TIME PCR

LigthCycler SYSTEM

Caratteristiche:

Come mezzo di trasmissione della temperatura dalla resistenza ai campioni viene utilizzata l’aria che, essendo virtualmente senza massa, rende questo processo molto veloce.

Le reazioni vengono preparate in capillari di vetro borosilicato che, avendo un alto rapporto superficie:volume, assicurano una rapida equilibrazione fra l’aria ed i componenti della reazione.

Una reazione di PCR di 30-40 cilci può essere completata in 20-30 min.

Rapide variazioni di temperatura durante i cicli termici

Monitoraggio on-line e simultaneo dell’amplificazione dei vari campioni mediante sistemi di rilevamento della fluorescenza

Roche

...LigthCycler SYSTEM

resistenza

capillari(max 32)

camera termica

filtriLED

ventilatore

canali di rilevamento fluorimetrico

L’unità ottica è dotata di un LED come sorgente di luce e di tre canali di rilevamento che misurano la luce emessa a tre differenti lunghezze d’onda:

530nm 640nm 710nm

I valori di fluorescenza rilevati vengono visualizzati sullo schermo del computer consentendo il monitoraggio on-line della reazione di PCR.

L’intensità del segnale prodotto dal fluoroforo è proporzionale alla quantità del prodotto di PCR.

Numero di cicli

Flu

ore

scen

za

L’aumento dell’intensità del segnale inizia a cicli differenti a seconda della concentrazione iniziale del DNA bersaglio.

SYBR Green

E’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.

DENATURAZIONENon viene rilevata fluorescenza

L’intensità della fluorescenza comincia ad aumentare

ANNEALING

ALLUNGAMENTO

L’intensità della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine della fase di

allungamento

L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 530nm

SYBR Green

Primer Luce emessa

Polimerasi

SONDE di IBRIDAZIONE

Due sonde oligonucleotidiche sequenza-specifiche, marcate con coloranti diversi, ibridizzano con la sequenza bersaglio sul

filamento di DNA amplificato in un arrangiamento testa-coda che consente

l’emissione della fluorescenza.

DENATURAZIONENon viene rilevata fluorescenza:

il colorante donatore è eccitato dalla sorgente ed emette energia in grado di eccitare

l’accettore solo se la distanza fra i due è pari a 1-5 nucleotidi

Colorante donatore

Colorante accettore

ANNEALINGViene registrata la massima fluorescenza

L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 640nm

Oligo 1Fluoresceina Oligo 2

LC Red 640

Prodotto di amplificazione

EccitazioneEmissione

Trasferimento

1-5 nucleotidi

ANALISI della CURVA di MELTING

Consente di identificare il prodotto di amplificazione specifico rispetto a prodotti aspecifici.

Al termine della PCR la temperatura viene lentamente aumentata inducendo un decremento della fluorescenza.La temperatura in corrispondenza della quale si ha un repentino decremento della fluorescenza corrisponde alla Tm del prodotto.

Curva di fluorescenza

0 10 20 30 40 50

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0

0 copie

10 copie

104 copie

Flu

ore

scen

za

Cicli di amplificazione

65 70 75 80 85 90 95

104 copie10 copie 0 copie

Temperatura (°C)

Flu

ore

scen

za

100

80

60

40

20

0

Curva di melting

Derivata negativa della curva di melting

65 70 75 80 85 90 95

Temperatura (°C)

-dF/

dT

TM

104 copie10 copie 0 copie

100

80

60

40

20

0

prodotti non

specifici

QUANTIFICAZIONE del PRODOTTO di PCR

Identificando il primo ciclo della PCR in corrispondenza del quale inizia l’amplificazione esponenziale del prodotto è possibile quantificare la concentrazione iniziale del DNA bersaglio.

104 copie105106

Numero cicli

Flu

ore

scen

za

Curva di fluorescenza di campioni a concentrazione nota

Estrapolazione della curva standard

N.

cic

liLog concentrazione

104 copie105106

linea di base

La linea di base identifica il ciclo in corrispondenza del quale inizia l’aumento esponenziale della fluorescenza per ciascun campione.

Riportando in grafico il valore di intersezione con la linea di base in funzione del Log della concentrazione iniziale di ciascun campione si ottiene la curva standard da cui si può estrapolare il valore della concentrazione di campioni a titolo ignoto.

MULTIPLEX PCR

Fluorecseina LC Red 640 Fluorecseina LC Red 705

Consente l’analisi simultanea di due campioni nella stessa reazione

Due coppie di Sonde di Ibridazione, ciascuna specifica per un prodotto di amplificazione, vengono marcate con un diverso colorante accettore che emette la fluorescenza a differenti lunghezze d’onda.

STRATEGIA:

Il segnale emesso viene letto simultaneamente attraverso due

canali di rilevamento fluorimetrico.

Canale 3 705 nm

Canale 2640 nm

Eccitazione

Trasferimento

Emissione

ANALISI di MUTAZIONI PUNTIFORMI

Sfrutta differenze nella Tm di Sonde di Ibridazione perfettamente legate al DNA bersaglio o il cui legame è destabilizzato dalla presenza di basi non appaiate.

gene mutato

La Sonda 1 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio

mutata

La Sonda 2 si ibridizza alla parte della sequenza bersaglio non

mutata

gene selvatico

Sonda 1marcata con Fluoresceina

Sonda 2marcata con LC Red 640

Al termine della PCR si analizza la curva di melting: se è presente una mutazione, la Tm dell’ibrido sarà più bassa che in assenza di mutazione.

Temperatura50 55 60 65 70 75 80

omozigote wildtypeomozigote mutanteeterozigote

3.0

2.5

2.0

1.5

Flu

ore

scen

za

50 55 60 65 70 75 80 Temperatura

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

-0.05

-dF/

dT

L’ETICHETTATURA nei REGOLAMENTI C.E.E.

Disciplina la vendita di prodotti contenenti OGM destinati al consumo umano ed introduce la nozione di sostanziale equivalenza : due alimenti sono considerati sostanzialmente equivalenti quando non presentano alcuna differenza dal punto di vista nutrizionale, organolettico e della sicurezza.

Rende inoltre obbligatoria l’etichettatura degli alimenti transgenici che non siano sostanzialmente equivalenti ai prodotti convenzionali.

REGOLAMENTO 258/97 sui Novel Food

REGOLAMENTI COMUNITARI 49 E 50/2000

Prevedono l’obbligo di etichettatura per tutti gli alimenti che contengano ingredienti (49/2000), additivi e aromi (50/2000) derivanti da organismi geneticamente modificati. L’obbligo non vale se il prodotto risulti accidentalmente contaminato da derivati di organismi geneticamente modificati in una percentuale non superiore all’1%.

DIAGNOSTICA degli OGM negli ALIMENTI

TEST sulle PROTEINE

Rilevazione immunologica della

proteina codificata dal transgene (ELISA)

- Quali- / quantitativo

- Rapido

- Test da campo

Richiede materie prime non lavorateL’espressione delle proteine è spesso tessuto-specifica e sviluppo-dipendente

-

-

TEST sul DNARicerca del transgene e di sequenze ad esso correlate

(Real-time PCR)

- Quali- / quantitativo

- Rapido

- Sensibile (limite = 0.0001%)

- Degradazione del DNA

- Presenza di inibitori della polimerasi

Possibili contaminazioni con DNA estraneo

Non tutti i derivati alimentari contengono DNA (es. olio di semi di mais)

-

-

Analisi qualitativa (screening)

I° STEP

Rivela la presenza/assenza dell’OGM nel campione

Si ricerca la presenza di sequenze regolatrici comuni alla maggior parte degli OGM

risultatopositivo

Si identifica il transgene presente, verificando se è uno di quelli autorizzati in

commercio

risultatonegativo

L’analisi si arresta

Nessun transgene autorizzato

Alimento illegale

Transgene autorizzato

II° STEP

Analisi quantitativa

Se i singoli ingredienti superano la percentuale dell’1% scatta l’obbligo di riportarne la presenza in etichetta

ITER per il RILEVAMENTO di OGM negli alimenti mediante TEST sul DNA

GENI BERSAGLIO nell’analisi qualitativa degli alimenti

Individuazione del transgene

Elementi caratteristici dei costrutti ricombinanti

Promotore CaMV 35S

Transgene tNOSGene

marcatore

Promotore CaMV 35S

tNOS

Gene marcator

ePCR QUALITATIVA

Amplificazione di una delle seguenti sequenze:

Amplificazione di geni sicuramente presenti nel campione (es. lectina della soia, zeina del mais)

PCR QUANTITATIVA

(è disponibile una banca dati che contiene tutte le sequenze di DNA depositate nei brevetti a livello mondiale)

2 ESEMPI di QUANTIFICAZIONE...

La soia Roundup Ready (Monsanto) è stata modoficata geneticamente per resistere alla somministrazione del glifosato, un diserbante ad ampio spettro.

Soia Roundup Ready

Per quantificare mais e soia transgenici negli alimenti sono state opportunamente disegnate combinazioni di Sonde di Ibridazione che riconoscono tanto il transgene quanto un gene endogeno, rendendo possibile quantificare simultaneamente sia il contenuto di mais/soia GM che di mais/soia totale nel campione in analisi.

Sonda 1 specifica per il transgene cryIA(b), codificante per la tossina

Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per l’enzima invertasi

Sonda 1 specifica per il transgene CP4-EPSPS

Sonda 2 specifica per il gene endogeno codificante per la lectina

Mais Bt

di un gene che codifica per una tossina insetticida

Il mais-BT è stato reso resistente alla piralide mediante l’inserimento

derivata dal batterio Bacillus turingiensis la cui ingestione provoca la morte delle larve paralizzandone l’intestino.