ColuzzI_MRD Leucemia e PCR

5/12/2018 ColuzzI_MRD Leucemia e PCR - slidepdf.com

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Leucemie acute e PCR:diagnostica e valutazione dellamalattia residua

D.ssa Sabrina Coluzzi

Dipartimento Clinico Assistenziale

Oncologico

Unità Operativa di EmatologiaCentro Trapianto di Cellule Staminali



L¶ematopoiesi



Leucemie acute

Le leucemiederivano da

alterazionimolecolaripresenti alivello di unprecursoreematopoietico



³Leukemic Stem Cell´

La popolazione leucemica è eterogenea:

solo una piccola percentuale di queste

cellule ha capacità di autorinnovamento emostra una multidrug resistance

Queste caratteristiche spiegano

l¶importanza di tecniche (come la PCR)volte alla individuazione di eventuali cellule

leucemiche residue dopo l¶ottenimento di

una risposta apparentemente completa



Percorso diagnostico

Emocromo Morfologia delle cellule

Esami citochimici Esami citofluorimetrici Indagini citogenetiche

Indagini molecolari



Classificazione leucemie (WHO)1. LMA CON TRASLOCAZIONI GITOGENETICHE RICORRENTI

- LMA con t(8;21)(q22;22), AML1(CBF)/ETO- Leucemia Promielocitica Acuta [LMA con t(15;17)(q22;q11-12) e varianti PML/RAR]- LMA con ipereosinofilia midollare [inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q11), CBF/MYH11X]- LMA con anomalie 11q23

2. LMA CON DISPLASIA MULTILINEARE- Secondaria a sindrome mielodisplastica o sindromi mielodisplastiche/malattie

mieloproliferative

- De novo3. LMA E SINDROMI MIELODISPLASTICHE SECONDARIE A CHEMIOTERAPIA- Secondaria ad agenti alchilanti- Secondaria a epipodofillotossine- Alti tipi

4. LMA NON ALTRIMENTI CLASSIFICATA- LMA con differenziazione minima

- LMA senza maturazione- LMA con maturazione- Leucemia mielomonocitica acuta- Leucemia monocitica acuta- Leucemia eritroide acuta- Leucemia megacariocitica acuta- Leucemia basofila acuta- Panmielosi acuta con mielofibrosi

- Sarcoma mieloide (granulocitico)



Traslocazioni citogenetiche

ricorrenti Rappresentano il 15-20% delle LAM Sono alterazioni del ³core binding factor´,

complesso proteico essenziale per l¶ematopoiesi, che normalmente attiva unaistone acetiltrasfrasi e la trascrizione di fattori didifferenziamento

Il complesso, se mutato, attiva una istonedeacetilasi e quindi si ha blocco trascrizionale e

blocco differenzitivo Hanno prognosi favorevole



Rilevamento trascritti di fusione

EstrazioneRNA

Retrotrascrizio

ne Amplificazione Corsa su gel di

agarosio 2% Osservazoneagli UV



Monitoraggio mediante RQ-PCR

Il livello diespressione deltrascritto èquantizzato in

Real Time Numero Copie

trascritto/NumeroCopie ABL x 104

Una riduzione alfollow-up di trelogaritmi èconsiderata

remissione



Follow up AML1 ETO



Classificazione leucemie (WHO)1. LMA CON TRASLOCAZIONI GITOGENETICHE RICORRENTI

- LMA con t(8;21)(q22;22), AML1(CBF)/ETO- Leucemia Promielocitica Acuta [LMA con t(15;17)(q22;q11-12) e varianti PML/RAR]- LMA con ipereosinofilia midollare [inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q11), CBF/MYH11X]- LMA con anomalie 11q23

2. LMA CON DISPLASIA MULTILINEARE- Secondaria a sindrome mielodisplastica o sindromi mielodisplastiche/malattie

mieloproliferative

- De novo3. LMA E SINDROMI MIELODISPLASTICHE SECONDARIE A CHEMIOTERAPIA- Secondaria ad agenti alchilanti- Secondaria a epipodofillotossine- Alti tipi

4. LMA NON ALTRIMENTI CLASSIFICATA- LMA con differenziazione minima

- LMA senza maturazione- LMA con maturazione- Leucemia mielomonocitica acuta- Leucemia monocitica acuta- Leucemia eritroide acuta- Leucemia megacariocitica acuta- Leucemia basofila acuta- Panmielosi acuta con mielofibrosi

- Sarcoma mieloide (granulocitico)



Difficoltà diagnostiche

Tuttavia, solo nel 50% dei casi siriscontrano alterazioni genetiche, utili per

indirizzare il clinico verso un sottotiponeoplastico piuttosto che un altro

Nei rimanenti casi la diagnosi si deve

attualmente avvalere delle tecnicheprecedentemente accennate



Nuovi marker molecolari Sono in corso studi multicentrici per individuare

nuovi markers molecolari

L¶attenzione si è focalizzata principalmente su:

- FLT3 (fms-like tyrosine kinase)

- WT1 (Wilms tumor 1)



FLT3 Recettore

tirosin-chinasipresente sulla

superficie deiprogenitoriematopoietici

Fondamentale

per sopravvivenza edifferenziazionedelle cellule



Pathway di FLT3



Genetica di FLT3 Nel 30% dei casi di

LAM si osservamutazione di FLT3 ITD,associata a leucocitosi

ed alto numero di blasti. Tale mutazione

consiste in una

ripetizione da 3 a 400nucleotidi nel dominioiuxtamembrana di FLT3

Exon 14

Exon 14

Exon 15

Exon 15Intron

Intron

Abnormal

Normal

ITD



Rilevamento FLT3-ITD Estrazione di DNA Amplificazione con primers specifici sugli esoni

14 e 15 Corsa elettroforetica su gel 2% agarosio

Visualizzazione agli UV



FLT3-ITD

32%

34%

31%



Impatto di FLT3-ITD

RISCHIO DI RICADUTA

ITD + ITD -

Citogeneticafavorevole

37% 29%

Citogeneticaintermedia

67% 43%

Citogeneticasfavorevole

75% 76%



Rilevamento FLT3 D835 mut Estrazione di DNA Amplificazione con primers specifici sulla regione TK Digestione con Eco RV Corsa elettroforetica su gel 2% agarosio

Visualizzazione agli UV Le bande non digerite (mutate) sono sequenziate



FLT3 D835 mut Presente nel 5-10% dei casi di LAM CN Ha un minore impatto sulla prognosi rispetto a FLT3-ITD



FLT3: considerazioni

Attualmente FLT3 è un ottimo marker prognostico in pazienti a citogeneticanegativa

Nei pazienti a citogenetica nota deveessere correlato con la specificaalterazione



FLT3: livelli di espressione

I livelli di espressione

di FLT3 correlano conla conta dei blasti nelmidollo

Sono più alti in M5,

bassi in M3



FLT3: livelli di espressione

Ancorapochi studi

tendono aconsiderare ilivelli di

espressione

di FLT3 wtun utilemarker

prognostico



WT1:nuovo marker molecolare

WT1 è una proteina con probabilefunzione di oncosoppressore cherecentemente è stato correlato a molte

forme leucemiche Presenta tre domini zinc-finger codificati

dagli esoni 7 e 9 in grado di legare il DNA

Il suo mRNA è espresso a bassi livelli nelpaziente sano, invece nel pazienteleucemico è iper-espresso



WT1: PCR Real Time

Estrazione RNA dal campioni

Retrotrascrizione a cDNA Amplificazione del cDNA di WT1 e di Abl

(gene housekeeping)

N° copie WT1/N° copie Abl x 104



Range di riferimento in campionenormale



Range di riferimento in campionepatologico



WT1

Diventa fondamentale la quantizzazionedell¶mRNA di WT1 per:

Diagnosi di leucemia acuta Follow up del paziente nel tempo. Èevidente che mediante WT1 possanoessere seguiti anche pazienti privi dialterazioni citogenetiche e molecolarievidenti



WT 1 e inv16 (CBF-MYH11)



WT1 e inv16 post allotrapianto



Casi Clinici

T h r e s h o l d c

y c l e

Log starting quantity, copy number

Leucemia acutaT(8;21): NCN 369

AREB in evoluzione: NCN 1794

AREB stazionaria: NCN 137



WT1:vantaggi

WT1 appare più sensibile degli altrimarkers genetici precedentementeutilizzati

WT1 rappresenta un marker prognosticodi altissima importanza nel prevederel¶andamento di una terapia o la ricaduta

del paziente



WT1: aggiornamenti

Recentemente, si è osservata anche unacorrelazione tra il grado mutazionale diWT1 e la prognosi

Sono state riscontrate mutazioni negliesoni 7 e 9 che determinano una perditadei domini zinc-finger

Ciò non comporta una diversa risposta allaterapia, bensì una maggiore possibilità diricaduta



Mutazioni di WT1 e prognosi



Correlazione tra WT1 mutato edalterazioni molecolari classiche



WT1: considerazioni

Al momento, WT1 rappresenta il marker prognostico più importante per il follow updelle leucemie

Ha infatti valore prognostico in tutti i tipi dileucemia

È utile però valutare ogni singolo casoindipendentemente



Conclusioni

Con il termine LAM si intende un insiemeeterogeneo di patologie ematologiche

La individuazione di marker molecolari è

fondamentale per inquadrare le LAM insottogruppi distinti per prognosi e scelteterapeutiche

Le recenti scoperte, principalmente diWT1 e FLT3, sono di notevole supportoalla diagnosi e al follow up



Grazie per l¶attenzione!

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