TRASCRIZIONE

TESTO: LEWIN’s GENES X, CAPITOLO 19

LEWIN IL GENE VIII, CAPITOLO 9

processo mediante il quale l‟informazione contenuta

nel DNA (geni) viene trasferita all‟RNA

UNIVERSALI

mRNA: codifica le proteine

tRNA: trasporto di aminoacidi per traduzione

rRNA: costituenti del Ribosoma

SPECIFICI DI EUCARIOTI

snRNA: (piccoli RNA nucleari):

assistono durante lo splicing (spliceosoma)

altri snRNA modificano gli rRNA

small RNA: microRNA, piwiRNA, siRNA…

RNA non codificante a funzione regolatoria

(Nobel medicina 2006)

CLASSI DI RNA

la TRASCRIZIONE è operata dalla RNA polimerasi

stessa funzione dai batteri all‟uomo: caratteristiche e logica comune tipicamente

proteine multisubunità

alcune RNA pol. fagiche (T7 e SP6) e mitocondriali sono a singola subunità

batteri: singola RNA pol; RNA è instabile (mRNA degradato rapidamente, rRNA,

tRNA processati

eucarioti: 3 RNA polimerasi Pol I, Pol II e Pol III; RNA viene modificato al 5' e al

3', complessato a proteine, sottoposto a taglio (rRNA, tRNA e SPLICING),

esportato dal nucleo

filamento CODIFICANTE:

-orientamento 5‟-3‟

-stessa sequenza nel TRASCRITTO di RNA (U al posto di T)

filamento STAMPO o TEMPLATE

-costituisce lo STAMPO (viene usato per appaiare le basi)

-è complementare al trascritto

DNA

RNA

Ripasso della chimica degli acidi nucleici…

la trascrizione e‟ unidirezionale: da 5’-->3’ , per aggiunta di nucleosidi 5‟

trifosfati al 3‟OH della catena crescente con formazione di legame

fosfodiesterico

nucleotide +1 del DNA (del gene):

corrisponde al primo ribonucleotide

presente nel trascritto (start point)

porzione a monte (upstream):

contiene, quasi sempre, il

promotore

porzione a valle (downstream):

si trova la regione codificante

(in eucarioti introni ed esoni)

ed il terminatore

osservando la struttura di un GENE:

unità trascrizionale: tratto di DNA compreso tra punto di inizio e

terminatore per la RNA polimerasi (può comprendere più geni)

TR

AS

CR

IZIO

NE

pro

cesso d

ivis

o in p

iù tappe

terminazione

inizio

allungamento

legame

complesso binario chiuso

riconoscimento

polimerizzazione primi nt

complesso ternario

melting del DNA

complesso binario aperto

(isomerizzazione)

50 nt/s, 1 errore/104 nt incorporati

-utilizza ribonucleosidi 5‟-trifosfato (ATP, GTP, UTP e CTP)

richiede Mg++

-inizia da singolo nt (non ha bisogno di innesco)

-(NMP)n+ NTP (NMP)n+1+ PPi; PPi → 2Pi

-ogni nucleotide è selezionato in base alle regole della

complementarietà A:U e G:C e alla geometria della coppia di basi

-usa come stampo il filamento template del DNA

RNA polimerasi

RNA polimerasi battericala macchina molecolare

w

155 kDa

151 kDa

18/70 kDa

37 kDa

10 kDa

enzima dotato di struttura quaternaria (multisubunità)

a2bb‟ws

460 kDa

RNA polimerasi battericastruttura cristallografica (core enzima)

è in grado, in linea di principio, di iniziare la Tx da

qualsiasi punto della molecola di DNA

l‟enzima (basico) ha affinità generale per qualunque

sequenza casuale di DNA (acido), ove si lega con bassa

stabilità (emivita minuti)

il nucleo o core enzima:

in vivo nella cellula batterica:

la polimerasi inizia la tx solo da particolari sequenze

localizzate a monte dello start point dette PROMOTORI.

come si spiega questo paradosso?

è l‟aggiunta del fattore di inizio, detto SIGMA, che

converte il core enzima nella forma, OLOENZIMA, in

grado di iniziare SOLO DAI PROMOTORI.

sigma destabilizza i legami

aspecifici del core enzima e

conferisce specificità per i

promotori

l‟oloenzima ha una affinità

per i promotori 1000 volte

superiore a quella del core (emivita 30-60 ore)

1/3 delle RNA polimerasi sono

sotto forma di oloenzima

in parte legati a siti aspecifici in

parte ai promotori

1/2 dei core enzima sono impegnati

nella trascrizione

in una cellula di E.coli

circa 7000 molecole di

RNA polimerasi

sigma è in eccesso rispetto ai core enzima

come studiare le sequenze di DNA

coinvolte nel legame con la polimerasi

DNA footprinting

allineamento sequenze a monte start point

(sequenza consenso)

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

DNA DNA

**

**

*

tagli in tutte le

possibili posizioni

impronta

DNA footprinting

+ DNAsi + proteina+ DNAsi

tagli solo dove

non è legata la

proteina

*

**

**

come sono i promotori?

l‟allineamento delle sequenze geniche a monte dello

start point hanno permesso di evidenziare delle corte

regioni conservate (circa 6 bp)

SEQUENZA CONSENSO

sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per

ciascuna posizione è indicato il nucleotide/aa che si

trova con maggior frequenza (più spesso) quando

vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali

SEQUENZA CONSENSO

sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per

ciascuna posizione è indicato il nucleotide/aa che si

trova con maggior frequenza (più spesso) quando

vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali

T77A100 T77A61A84T100 Pur

struttura di un promotore batterico ideale/forza del promotore

SEQUENZA CONSENSO

sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per

ciascuna posizione è indicato il nucleotide/aa che si

trova con maggior frequenza (più spesso) quando

vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali

T77A100 T77A61A84T100T82T84 G78A65C54A45 T80A95 T45A60A50T96 Pur

Mutare a -35 o a -10 ha la stesse consequenze?

Risposta: NO, perchè

a) Esistono sia mutazioni favorenti (UP) che inibenti (DOWN

b) Sperimentalmente, si e' visto che le mutazioni in -35 influenzano

l'attacco iniziale della RNA polimerasi (formazione complesso

chiuso). Mentre le mutazioni a -10 non hanno alcuna

conseguenza per la formazione complesso chiuso ma rallentano

la conversione a complesso aperto

IL PROMOTORE E‟ LA SEQUENZA DI DNA GENOMICO

RICHIESTA PER IL CORRETTO AGGANCIO DELLA

RNA POLIMERASI E PER IL COMPIMENTO DELLA

REAZIONE DI INIZIO

cosa sono i promotori?

MANCANZA di una ESTESA conservazione di sequenza

PRESENZA di BREVI TRATTI CONSERVATI CRITICI PER LA FUNZIONE

(sequenza -35, sequenza -10 e lo spacing tra esse nei batteri)

CARATTERISTICHE GENERALI DELLE SEQUENZE

REGOLATORIE IN PROCARIOTI ED EUCARIOTI

promotore procariotico esteso

elemento UP (aumento della trascrizione):

-non presente in tutti i promotori

-aumenta l‟efficienza di trascrizione di circa 30 volte

-è importante la posizione (-40 -60 dal sito di inizio)

rRNA

TRASCRIZIONE

INIZIO

come avviene il contatto tra RNA

polimerasi oloenzima e DNA

è mediato dal

fattore sigma

ALLINEAMENTO DI SEQUENZA TRA DIVERSI FATTORI SIGMA…

…RIVELA REGIONI CODIFICANTI MOTIVI PROTEICI CONSERVATI

la struttura di sigma nel contesto dell‟oloenzima

motivi helix turn helix

motivi helix turn helix (elica giro elica)

il DNA ha una scanalatura principale e una

secondaria. Le proteine che interagiscono con

esso devono riconoscere sequenze specifiche.

il "bordo" di ciascuna coppia di basi è esposto in

superficie, con un suo preciso pattern di

accettori/donatori di ponti H e di zone

idrofobiche riconoscibile da proteine.

particolarmente vero per scanalatura principale,

che non a caso è il sito di legame generalmente

più usato dalle proteine che interagiscono con il

DNA come i fattori di trascrizione.

interazioni DNA – proteine

solco maggiore e solco

minore dell‟elica del DNA

interazioni DNA - proteina

codice di riconoscimento sul DNA

dalla scanalatura principale

ciascuna delle 4 configurazione

proietta uno schema unico

dalla scanalatura secondaria

il quadro è più monotono

interazioni DNA - proteina

codice di riconoscimento sul DNA

dalla scanalatura principale

ciascuna delle 4 configurazione

proietta uno schema unico

dalla scanalatura secondaria

il quadro è più monotono

una proteina si lega al DNA perché RICONOSCE UNA SEQUENZA:

la SUPERFICIE DELLA PROTEINA E„ COMPLEMENTARE ALLE

CARATTERISTICHE DI SUPERFICIE DELLA DOPPIA ELICA

NB: ci sono tanti contatti, ognuno debole per se, ma, sommati

assicurano una interazione specifica e stabile

regione 2.4 di sigma

interagisce con regione -10

regione 4.2 di sigma

interagisce con regione -35

sigma solo (separato dal core) è incapace di legare il DNA,

questa sua proprietà è inibita (autoinibita-frenata)

il fattore sigma (in rosa) nella struttura tridimensionale

della RNA polimerasi di T.aquaticus

strutturalmente SIGMA si estende oltre il sito attivo, quasi come

un'"antenna" che "cattura" il DNA e lo sistema "in fondo" al core

enzyme nella tasca catalitica

complesso binario

chiuso

complesso binario

aperto

SIGMA

CORE

RNA polimerasi incontra un dilemma nel conciliare

inizio e allungamento.

inizio richiede un legame FORTE e SPECIFICO

esclusivamente ai PROMOTORI;

allungamento un legame STABILE A TUTTE le

SEQUENZE incontrate dall‟enzima durante la Tx.

SOLUZIONE:

SIGMA che garantisce il riconoscimento

promotoriale serve SOLO all‟INIZIO;

dopo aver passato la fase di inizio abortiva, si

stacca e viene riciclato

l‟avidità per il DNA/RNA nascente

(indipendentemente dalla sequenza) da parte

della core Pol è sufficiente a mantenere il

legame durante l‟allungamento

come funziona sigma?

Sigma accelera questo

passaggio

la polimerasi è ferma sul promotore

sigma legato ostruisce il canale di uscita dell‟RNA

il DNA viene “tirato” dentro la polimerasi, vengono polimerizzati alcuni nt (2-9)

e poi rilasciati DNA e RNA (nuovo ciclo)

solo quando sigma viene rilasciato la polimerasi lascia il promotore

complesso terziario inizi abortivi:

è la RNA pol (sigma) che crea la

bolla di Tx quando si lega ad un

promotore.

il duplex di DNA e‟ parzialmente

(14 nt) e transitoriamente

denaturato

la bolla è sempre racchiusa nella

RNA polimerasi

la sintesi di RNA avviene

nella bolla di trascrizione

l‟RNA polimerasi cambia dimensione

durante le fasi di inizio e protegge

porzioni più o meno ampie della

regione intorno allo start point

TRASCRIZIONE

ALLUNGAMENTO

complesso di elengazione:

macchina enzimatica complessa:

svolge (DNA da tx)

riavvolge (DNA già tx)

stampa RNA

funziona da correttore di bozze

stacca l‟ibrido DNA/RNA

Le subunita' beta sono il cuore catalitico della RNA pol procariotica

alcuni farmaci, per es. Rifampicina, si attaccano a b in una posizione che

impedisce l'allungamento perché impedisce la fuoriuscita dell‟RNA.

quando viene incorporato un nucleotide sbagliato, viene sentito il

mismatch e l‟RNA polimerasi corregge l‟errore mediante:

editing pirofosfolitico

reazione inversa della formazione legame fosfodiestereo

il pirofosfato viene rilegato al nucleotide appena incorporato

editing idrolitico

RNA-pol torna indietro di 1 o più nucleotidi e taglia

l‟RNA prodotto rimuovendo la sequenza errata

è stimolato da fattori proteici (Gre)

correzione RNA neosintetizzato(errore: 1 ogni 10 000)

quando il DNA è danneggiato

quando mancano i nucleotidi

l‟enzima (la bolla tx) fa “retromarcia”

e rimane bloccata fino alla

“risoluzione del problema”

assistita da alcuni fattori proteici

(GreA e GreB) taglia la regione 3‟

dell‟RNA

il filamento stampo si trova quindi in

posizione corretta e l‟allungamento

può riprendere

una RNA polimerasi bloccata può riprendere la trascrizione

la polimerasi svolgendo il DNA introduce superavvolgimenti

positivi nella regione a valle (da trascrivere) che se non corretti,

intralcerebbero la Tx

il DNA che si riappaia a monte presenta dei

superavvolgimenti negativi

girasi = enzimi che tolgono i

superavvolgimenti positivi

topoisomerasi = enzimi che

introducono superavvolgimenti

positivi

due enzimi: girasi e topoisomerasi

intervengono per ripristinare il normale stato di

avvolgimento nel DNA

topoisomerasi I

taglia un filamento e fa passare filamento complementare,

ligazione

girasi (topoisomerasi II)

taglia entrambi i filamenti incrocia il DNA e ricuce usa

ATP per energia

riassumendo…..

3 fasi della tx

inizio: 3 passaggi.

A) formazione complesso chiuso legame della polimerasi ad

una speciale sequenza di dsDNA, cioe‟ al promotore.

B) fase di complesso APERTO, in cui il duplex si separa per

circa 14 basi= si libera il filamento stampo; i primi 2

nucleotidi vengono allineati nel sito attivo con il filamento

stampo e polimerizzati; la polimerasi comincia

polimerizzare in direzione 3‟, fino a fare un frammento di

10 basi; in questa fase la polimerasi va avanti ed indietro =

inizi abortivi (rilasciando i piccoli frammenti trascritti e

ripartendo dal +1)

C) formazione di un complesso ternario (DNA RNA e

Polimerasi) stabile. Fino a questo stadio la polimerasi

non ha lasciato il promotore

Allungamento la polimerasi volge e svolge il DNA e sintetizza il

trascritto (problema topologico, next slide). C‟e‟ un cambio

conformazionale che ancora stabilmente la pol al DNA.

Terminazione. Fine della Tx e rilascio del trascritto primario

In batteri, esistono ben precise sequenze di terminazione

(terminatore)

In eucarioti non c‟e‟ un vero e proprio terminatore. Vedremo più

avanti…

espressione genica

la trascrizione copia selettivamente

discrete porzioni di genoma, e ne fa

anche migliaia di copie

non tutti i geni vengono utilizzati nello

stesso momento e non tutti con la

stessa intensità

ma

controllo dell‟espressione genica

1) l'espressione genica è energicamente costosa (fare

RNA e proteine richiede molto dispendio energetico

per la cellula)

2) l‟espressione contemporanea di tutti i geni

causerebbe una tale cacofonia regolatoria e

strutturale da risultare incompatibile con la vita (per

es. differenziamento, sporulazione etc)

CONTROLLO DELL'ESPRESSIONE GENICA E'

CENTRALE ALLA VITA (e quindi anche nella malattia)

la regolazione è dettata dal contesto cellulare, da

molteplici stimoli, dalle necessità

la regolazione è qualitativa (questo gene SI‟ e l‟altro NO)

ma è anche profondamente quantitativa

(accendo un gene e lo trascrivo 10-100 oppure milioni di

volte... e come dove e quando mi fermo ???)

l‟espressione genica è differenziale

cosa significa espressione genica differenziale?

capacità di esprimere una parte del proprio

repertorio genico nella giusta combinazione, in

momenti diversi ed in siti diversi.

lo sviluppo embrionale e la omeostasi (capacità

di mantenere un equilibrio) dei tessuti degli

organismi pluricellulari, o la capacità di

rispondere alle variazioni ambientali e la capacità

di differenziare (sporulazione) nei batteri sono

straordinari esempi di differential gene

expression

controllo dell‟espressione genica

controllo dell‟espressione genica

l‟espressione può essere regolata a vari livelli

pre trascrizionale (negli eucarioti)

trascrizionale (il più importante e diffuso)

post-trascrizionale (soprattutto negli eucarioti)

traduzionale

co e post-traduzionale (il più veloce e dispendioso)

elementi trans attivi - elementi cis attivi

un regolatore è elemento trans attivo (diffusibile): RNA pol,

fattori di trascrizione, miRNA ecc.

agisce su qualunque copia del suo bersaglio

il sito di legame (bersaglio) sul DNA/RNA è elemento cis attivo

(promotore, operatore, enhancer ecc.)

ha effetto solo sul DNA adiacente