AMPLIFICAZIONE IN AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNAVITRO DEL DNA

““REAZIONE A CATENA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASIDELLA POLIMERASI

(PCR)”(PCR)”

• Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993)

• Serve per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro

• Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte

PCR: reazione polimerasica a catena

ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:

1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE

2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE

3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C)

4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:

1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPOVIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO

2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANOCON IL DNA STAMPO

3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

PCR: Reazione a catena della polimerasi

Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: amplificazionePCR: amplificazione

n.ro cicli

1

3

10

15

20

25

30

n.ro sequenze bersaglio

0

2

256

8192

262.144

8.388.608

268.435.456

La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers

Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10 -12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.

In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.

Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli.

PCRVANTAGGI:• Sensibilita’• Rapidita’• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso

campione• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o

fissato• SVANTAGGI:• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa

a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)• Può sintetizzare frammenti relativamente corti• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol

non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

Esempi di utilizzo della PCR

• Su DNA:– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche

(mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR DIAGNOSTICA

– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare”

• Su RNA messaggero (RT-PCR):– segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione

genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi)

– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare” - isolare cDNA specifici per determinati geni.

PCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciformePCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciforme

PCR/VNTR/STR in genetica forensePCR/VNTR/STR in genetica forense

Quale delle persone sospette può avere commesso il crimine?

La tecnica PCR è utile, spesso necessaria, per amplificare il DNA estratto dai reperti trovati sulla scena del delitto. Si usano sonde multi-locus con molti alleli.

Diagnosi di mutazioni mediante amplificazione allele-specifica

Diagnosi genetica pre-impianto

PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:

PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)

• Estrazione dell’RNA• Purificazione dell’RNA poliadenilato (mRNA)• Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa

AAAAAAAA 3’5’

TTTTTTTT 5’3’

mRNA

cDNA

PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:

PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)

AAAAAAAA 3’5’

TTTTTTTT 5’3’

mRNA

cDNA

• Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di innesco specifici

5’3’

• Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi)

TTTTTTTT 5’3’5’ 3’

AAAAAAAA 3’5’

La PCR non e’ una tecnica quantitativa

Nu

mb

er

of

mo

lec

ule

s

Number of cycles

PCR quantitativa: RT-PCR in tempo reale

• Utilizza particolari sostanze la cui fluorescenza si rivela quando intercalano la catena di DNA sintetizzata durante la reazione di amplificazione.

• L’utilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole presenti in partenza

Polymerase Chain Reaction: resa• Resa teorica: 2n

P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n)

Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza

Lo

g[D

NA

]

N° ciclitermici

EsponenzialeEsponenziale

LineareLinearePlateauPlateau

Prodotto Prodotto variabilevariabile

Polymerase Chain Reaction: plateau

Resa effettiva: effetto plateau

Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da:

Quantità dei primers

Attività della Taq polimerasi

Reannealing dei filamenti

Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

Soluzioni• Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale

Il prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale

• Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR

• La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR

RT-PCR convenzionaleRT-PCR convenzionale

Manual or Manual or automated automated

analysisanalysis

ReverseReverse transcriptiontranscription

PCRPCR reactionreaction

NestedNestedPCR reactionPCR reaction

GelGelelectrophoresiselectrophoresis

DNADNAsequencingsequencing

Southern Southern blotblot

Real-time RT-PCRReal-time RT-PCR

ReverseReversetranscriptiontranscription

PCR reaction PCR reaction Quantitative Quantitative

resultresult

Perché Real-Time?

Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"

RT-PCR quantitativa

PlotPlot linearelineare

Incremento diIncremento difluorescenzafluorescenza

Cicli di PCR Cicli di PCR

•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazioneRilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione •Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosioIl prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio

•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computerAnalisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

Analisi tramite software

•La fluorescenza si genera durante la PCR per

effetto di diverse possibili reazioni chimiche

•Le chimiche principali sono basate sia sul

legame di coloranti fluorescenti che si intercalano

nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,

sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

Chimiche fluorescenti Chimiche fluorescenti per PCR Real-Timeper PCR Real-Time

SYBR Green

SYBR Green ISYBR Green: principioUtilizza una molecolaUtilizza una molecola fluorescente non specifica che si fluorescente non specifica che si

lega al solco minore del DNAlega al solco minore del DNA

All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la

molecola fluorescente

SYBR GreenSYBR Green

SYBR GreenSYBR GreenDopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

SYBR GreenSYBR GreenDurante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone

SYBR green

• Metodica semplice

Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa

• Non costosa

• Non-specifica

– La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers

– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici