Amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain

Reaction) del DNA estratto dalla saliva.

OBIETTIVO DEL LAVORO SPERIMENTALE: OBIETTIVO DEL LAVORO SPERIMENTALE:

TIPIZZAZIONE DEI CROMOSOMI SESSUALI X e YTIPIZZAZIONE DEI CROMOSOMI SESSUALI X e Y

Cromosoma y

Cromosoma X

La tipizzazione dei cromosomi sessuali X ed Y

tramite PCR, spesso utilizzata in medicina forense,

può essere condotta attraverso:

• 1) Amplificazione di una porzione genica

presente nel primo introne del gene codificante

per l’Amelogenina (AMEL)

• 2) Ricerca del DNA α-satellite presente a livello

dei centromeri dei cromosomi X e Y

Amplificazione di una porzione genica presente nel primo

introne del gene codificante per la proteina Amelogenina

(AMEL)

Il locus genico

proteina coinvolta nel processo di produzione dello

smalto dei denti, rappresentando in questa sede il 90%

circa di tutta la componente proteica dello smalto.

Xp22 (AMELX)

Yp11 (AMELY)

Amelogenina

alcune differenze nella

sequenza

Delezione di 6 bp in corrispondenza di una regione del primo introne

del gene AMELX rispetto al gene AMELY

►gli individui di sesso femminile essendo omozigoti per la delezione sul primo

introne del gene AMELX, presenteranno un solo prodotto di amplificazione di

106 bp

►gli individui di sesso maschile essendo eterozigoti per la delezione sul primo

introne, presenteranno due prodotti di amplificazione, uno di 106 bp relativo

al gene AMELX, e uno di 112 bp, relativo al gene AMELY.

introne introneesone esone esone

PCR

Amplificazione di una porzione genica presente nel

primo introne del gene AMEL

106 bp

112 bp106 bp

X XYDNA estratto

da filtro di

sigaretta

M

λϕϕϕϕX174X174X174X174

I prodotti di amplificazione

essendo molto vicini come

numero di paia di basi, vengono

preferenzialmente separati

mediante metodi automatizzati

(es. elettroforesi capillare),

piuttosto che con convenzionali

metodi elettroforetici su gel di

poliacrilamide o agarosio.

La tipizzazione dei cromosomi sessuali X ed Y

tramite PCR, spesso utilizzata in medicina forense,

può essere condotta attraverso:

• 1) Amplificazione di una porzione genica

presente nel primo introne del gene codificante

per l’Amelogenina (AMEL)

• 2) Ricerca del DNA α-satellite presente a livello

dei centromeri dei cromosomi X e Y

UTILIZZEREMO QUESTO SECONDO UTILIZZEREMO QUESTO SECONDO

METODO DI INDAGINEMETODO DI INDAGINE

Il DNA α-SATELLITE o alfoide è

una sequenza monomerica con una

tipica composizione di basi (A+T)

ripetuta in tandem a formare dei

blocchi che rappresentano fino a 3-

5% del DNA totale di ciascun

cromosoma.

- 250 kb nel cromosoma Y

- 5000 kb nel cromosoma 11

- 10000 kb nel cromosoma X

Ricerca del DNA α-satellite presente a livello dei

centromeri dei cromosomi X e Y

OBIETTIVO DEL NOSTRO LAVORO

Ottenere, (utilizzando la tecnica

della PCR in presenza di coppie

di primers specifici in grado di

intercettare le sequenze alfoidi

dei cromosomi X ed Y), prodotti

di amplificazione relativi a

ciascun cromosoma sessuale,

rilevabili mediante elettroforesi

su gel di poliacrilamide.

Simultanea amplificazione del DNA alfoide centromerico

presente nel cromosoma X e regione in quello Y.

PCR(Polymerase Chain Reaction)

La simultanea amplificazione del DNA alfoide centromerico, sarà condotta

utilizzando due coppie di primers in grado di delimitare una regione di ~150 bp

presente nel cromosoma X e una regione di 200 bp in quello Y.

X3 5' – TATTTGGACTCTCTCTGAGGAX4 5' - TTCTACTACAAGGGTGTTGCA

Y3 5' - GTGTATRCACCTCCGGGAGY4 5' - ACAAAAGGTTCAATTCTGTGAG

Cromosoma X

Cromosoma Y

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Amplificazione del DNA alfoide (Kit sigma JumpStart

Taq DNA Polymerase)

MISCELA DI REAZIONE

volume finale di 25 µl:

- 12 µl di DNA (1 ng)

- 2,5 µl Buffer 10x (10mM Tris-HCl pH 8,5)

- 0,7 µl Formamide

- 1,5 µl MgCl2 25 mM

- 0,5 µl dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

- X3 for 0,5 µl

- X4 rev0,5 µl

- Y3 for 0,5 µl

- Y4 rev 0,5 µl

- 0,35 µl di Taq Polimerasi (1U )

primers

- 5,45 µl di H2O sterile

// 10’ → 72°C

45 cicli

6’ → 95°C // 1’→ 95°C - 1’ → 50°C - 1’30’’ → 72°C

FILE DI AMPLIFICAZIONE

ELETTROFORESI SU GEL DI

POLIACRILAMIDE

I prodotti di amplificazione saranno separati tramite

elettroforesi su gel di poliacrilamide e visualizzati mediante

colorazione con nitrato d’argento.

200 bp

150 bp

RISULTATIRISULTATI Amplificazione del DNA Amplificazione del DNA alfoidealfoide

prodotto di amplificazione di 150 bp relativo al cromosoma X

RISULTATI ATTESI

prodotto di amplificazione 200 bp relativo al cromosoma Y

ESERCITAZIONE DEL 22 MAGGIO 2008

Elettroforesi su gel di poliacrilammide (1 gel per ogni

gruppo)

Colorazione del gel con il nitrato d’argento

4 GRUPPI DI LAVORO

PREPARARE LE SOLUZIONI (ciascun gruppo preparerà le proprie soluzioni)

SOLUZIONI PER IL GEL DI POLIACRILAMIDE

Sol Acrilamide Bis - acrilamide 40%

Ammonio Persolfato 10% (APS)

TEMED = si usa concentrato

PREPARAZIONE DEL GEL

H2O = 17 ml

TBE 10 x = 4 ml

Sol. Acrilamide / bis-acrilamide =9 ml

APS = 300 µl

TEMED = 30 µl

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

10 µl prodotto di PCR

2 µl loading buffer

MARCATORE DEI FRAMMENTI DI GRANDEZZA DEL DNA (uno per ogni gel)3 µl prodotto di marcatore

2 µl loading buffer

PREPARAZIONE DEI VETRI

Pulire accuratamente i vetri con etanolo 70%

Assemblare i vetri

CONDIZIONI ELETTROFORETICHE = 200 Volt costanti

TAMPONE DI CORSA = Buffer TBE 1x

DURATA DELLA CORSA = fermare la corsa quando il blu di

bromofenolo raggiunge il bordo del gel

COLORAZIONE CON NITRATO D’ARGENTO

PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI (usare acqua distillata)

500 ml di Etanolo 10%

500 ml HNO3 1% (attenzione: preparare sotto cappa)

500 ml AgNO3 12 mM

500 ml soluzione di Na2CO3 anidro 0,28 M + formalina tale da avere una

concentrazione finale pari allo 0,019%

500 ml Acido acetico 10% (attenzione: preparare sotto

cappa)

500 ml di Glicerolo al 5%

Indossare 2 paia di guanti e mettere gli occhiali protettivi

COLORAZIONE

Etanolo 10% =agitare per 5 min.

HNO3 1% = agitare per 2 min.

H2O distillata = agitare per 1 min.

AgNO3 12 mM = agitare per 20 min.

H2O distillata = agitare per 3 min.

Na2CO3 anidro 0,28 M + 0,019% formalina = lasciare in agitazione sino alla

comparsa delle bande.

Acido acetico 10% = agitare per 3 min.

Glicerolo 5% = agitare per 3 min.

Al termine della colorazione trasferire il gel su un foglio di carta" Whatman"

3MM e ricoprirlo con un foglio di cellophane

Il gel è ora pronto per essere essicato

COLORAZIONE DEL GEL CON NITRATO DI ARGENTO

Un modo più sensibile ma anche più laborioso e dispendioso di

visualizzare bande di DNA in gel di poliacrilamide, comporta la

colorazione del DNA con argento. Questo metodo si basa sulla

chimica usata nello sviluppo fotografico. Il gel è immerso in una

soluzione diluita di etanolo per fissare il DNA al gel. Quindi il gel viene

incubato con una soluzione acida di nitrato di argento, che reagisce

con i nucleotidi delle singole eliche di DNA: si forma un precipitato in

corrispondenza del DNA in seguito alla riduzione dell'argento ionico

alla forma metallica, per opera della formaldeide a pH alcalino (sodio

carbonato). Lo sviluppo viene fermato acidificando la soluzione con

acido acetico. In media il metodo è da 10 a 100 volte più sensibile

della colorazione con bromuro d'etidio