PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico.
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Transcript of PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico.
PCR
•Scelta dello stampo
•Scelta dei primer
PCR da DNA genomico
PCR da mRNA (RT-PCR)
Uso dei “linkers”
Vettori dA:dT
3’3’5’5’
3’5’3’
5’
PCR da DNA genomico
EcoRIBamHI
BamHI EcoRI
prom Tag o rep. cDNA term
trascrizionetraduzione
Proteine di fusione
Elettroforesi di acidi nucleici
•Gel di agarosio
•Gel di acrilammide
Elettroforesi su gel di agarosio
Tamponi di elettroforesi
Soluzioni di caricamento
Soluzioni di caricamento
•Aumentano la densità del campione
•Colorano il campione
•Rendono visibile la corsa elettroforetica
Migrazione del DNA su gel
Fattori che influenzano la migrazione
•Peso molecolare
•Concentrazione di agarosio
•Conformazione DNA
•Voltaggio applicato
•Intercalanti
•Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
Marcatori di peso molecolare
HindIII
Fotodocumentazione
Recupero DNA da gel
•Elettroeluizione
•Agarosio “low melting”
•Solubilizzazione agarosio
Gel di acrilammide
Apparato per gel di acrilammide
Metodi di sequenziamento
•Sanger (enzimatico)
•Maxam e Gilbert
(chimico)
Metodo di Sanger
primer
primernuovo DNA
dideossinucleotideterminatore
quattro dNTP (incluso 32PdNTP)DNA polimerasi
La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP
Denaturare e separare su gel di poliacrilammide
ddTTP ddCTP ddGTP ddATP
Metodo di Maxam e GilbertDNA singolo filamento marcato ad una estremità
4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche
Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina
Es. metilazione delle G con dimetilsolfato
Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide
32P
Gel di poliacrilammide di sequenza
Fasi di un progetto di sequenziamento
•clonaggio e preparazione del DNA
•reazioni di sequenza
•elettroforesi su gel di
poliacrilammide
•interpretazione e raccolta dati
Vettori a singolo filamento
Fagemidi
Strategie di sequenziamento
•Primer specifici consecutivi
•Delezioni progressive
•Frammenti casuali (shotgun)
Reazioni base-specifiche
Confronto metodi di sequenziamento
Sanger
rapida e semplice attuazione
disponibilità di kit
necessità di primer
sensibile a strutture secondarie
Maxam e Gilbert
lunga preparazione del DNA
reazioni da mettere a punto
relativamente economico
strutture non influenti
utilizzabile per oligonucleotidi
Sequenziamento automatico
Sequenziamento con Taq polimerasi