PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico.
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Quantitative Real-time PCR
Tecnica che consente la simultanea amplificazione e quantificazione del DNA target
AMPLIFICAZIONE: prevede essenzialmente gli step di una classica PCR
QUANTIFICAZIONE:
effettuata aggiungendo composti la cui fluorescenza
emessa ad ogni ciclo di reazione è proporzionale alla quantità di
amplificato
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Real-Time PCR: la reazione
COMPONENTI DELLA REAZIONE:
1) DNA target
2) DNA polimerasi
3) Due oligonucleotidi
4) dNTPs
5) Fluorocromo
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APPLICAZIONI
Diagnosi malattie infettive
Quantificazione patogeno
RICERCA
Espressione genica
OGM
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Perché Real-Time?
Misura l’amplificazione in tempo reale nella fase
esponenziale
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cycle number
Tar
get
copy
num
ber
Curva di amplificazione PCR
Exponential phase Pateau phase
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RT-PCR quantitativa
La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazione viene rilevata e analizzata tramite computer
Plot lineare
Cicli di PCR
Incr
emen
to d
i fl
uore
scen
za
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Plot di amplificazione
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Curve di amplificazione
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT (=Threshold Cycle) è inversamente
proporzionale alla quantità di templato iniziale
Fluo
resc
enza
Cicli di amplificazione
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96 replicati di uno stesso campione danno quantità finali di c-DNA
molto diverse
Curva di amplificazione PCR
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Differenze quantificazione PCR convenzionale/Real-time PCR
♦ End-point
♦ No monitoraggio
PCR conv.
♦ Fase esponenziale
♦ Monitoraggio
Real-time PCR
♦ < Sensibilità ♦ > Sensibilità
♦ Post-PCR ♦ No post-PCR
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Strumentazione Real-time
♦ Termociclizzatore
♦ Sorgente laser
♦ Detector
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Strumentazione Real-time
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5’ 3’
F Q
Tubulin
5’ 3’
H Q
GapdH
5’ 3’
TX Q
β-actin
5’ 3’
Cy5 Q
Cyclophilin
Strumentazione Real-time
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Dopo ogni rilevamento, i segnali di fluorescenza sono processati da un software e la cinetica di formazione
dell’amplificato è visualizzata graficamente come incremento dei
segnali di fluorescenza in ordinata (ΔRn) per cicli di reazione in ascissa
ANALISI REAL-TIME PCR
ΔRn = Rn + - Rn - Rn + = int. fluor. R/int. fluor. Q al mom. rilev. Rn - = int. fluor. R/int. fluor. Q prima dell’amplif.
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CICLO THRESHOLD
0
0 . 4
0 . 8
1 . 2
1 . 6
2
0 1 0 2 0 2 1 3 0 4 0
Th re s h o l dB a s e l i n eS a m p l e
CT
Il ciclo threshold (CT) è il ciclo della reazione di amplificatione nel quale il segnale di fluorescenza
supera il valore di threshold
Il threshold rappresenta quel valore di fluorescenza pari a 10 volte la ds della fluorescenza registrata nei
primi cicli di amplificazione (background)
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CICLO THRESHOLD Il Ct di 96 replicati dello stesso campione mostra valori di fluorescenza quasi identici
perché è calcolato in fase esponenziale
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CICLO THRESHOLD È strettamente correlato al numero di copie iniziali del target
Un numero iniziale di copie pari al doppio anticipa il Ct di un ciclo Un numero iniziale di copie pari a metà posticipa il Ct di un ciclo Due campioni che possiedono q di target diverse di 1 log hanno un
DCt di 3,3
Si mantiene lineare con log di numero di copie iniziali che superano i 6-8 ordini di grandezza
Which one has the most?
The least?
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QUANTIFICAZIONE
ASSOLUTA: i campioni sono quantificati in modo assoluto
Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una curva standard)
Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni
RELATIVA: la quantificazione viene effettuata paragonando i Ct
Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una curva standard)
Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro ΔCT con quello del controllo endogeno
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QUANTITATIVA ASSOLUTA
Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente (b-actina, GAPDH,
ATPs, b2 etc)
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CICLO THRESHOLD Il Ct è un indicatore del numero di copie iniziali
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CURVA STANDARD
Amplificando in parallelo ai campioni a conc. non nota (unknown) degli standard esterni (a conc. nota) a
diverse diluizioni, è possibile costruire una retta di regressione (curva di taratura o curva standard)
Conoscendo il valore di Ct, la conc. degli UKN si può ricavare per interpolazione ponendo il Ct in ordinata
e la conc. iniziale in ascissa
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CURVA STANDARD
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CURVA STANDARD
Il sistema consente di valutare l’efficienza di amplificazione mediante l’analisi di tre parametri:
1.Slope (s): indica il n° di cicli che intercorrono tra due diluizioni dello standard che differiscono di 1 log (teorico -3,3)
2.Coeff. correlazione (R): esprime le correlazioni esistenti tra i diversi segmenti che compongono la
retta di regressione (teorico 1)
3. Intercetta nell’asse (y): definisce il n° di cicli necessari per rilevare 1 copia di DNA target
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STANDARD
ac. nucleico estratto da diluizioni log di sosp. virale titolata su cellule (TCID50/50ml, PFU)
Virus:
Per DNA: plasmide contenente il target, la cui conc. è stata
determinata allo spettrofotometro (ng/ml) ed eventualmente trasformata in numero di copie
Per RNA: plasmide trascritto in vitro; la conc. di RNA standard è determinata allo SF (ng/ml) ed
eventualmente trasformata in numero di copie
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QUANTITATIVA RELATIVA
Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il cambiamento di espressione di un gene target in un campione
rispetto ad un altro campione scelto come calibratore
ΔCT
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QUANTITATIVA RELATIVA
Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario:
• TARGET – La sequenza di DNA da analizzare.
• CALIBRATORE – Il campione da usare come riferimento per l’analisi comparativa
• CONTROLLO ENDOGENO – Un gene espresso costitutivamente in tutti i campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione
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Quantitativa relativa: analisi dei dati
Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente (ΔCT)
Comparare ciascun ΔCT così ottenuto con il ΔCT di un
calibratore (cb) (ΔΔCT) 2 -(ΔCT,r- ΔCT,cb) = 2 –ΔΔCT
Il valore così ottenuto permette di determinare la Concentrazione relativa del target
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Step per il calcolo del 2- DDCT
1. Normalizzazione con un controllo endogeno (HK)
Ct gene interesse – Ct HK = ΔCt
2. Normalizzazione con il calibratore
ΔCt Campione – ΔCt Calibratore = ΔΔCt
3. Applicare la formula 2 -ΔΔCt
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ESEMPIO
Di quanto varia l’espressione dell’ IL-10 tra Liver e Brain?
1. ΔCt Brain = 18 ΔCt Liver = 12
2. ΔCt campione – ΔCt calibratore = 12-18 = -6
3. 2 -ΔΔCT = 26 = 64
L’IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain!
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Chimiche Real-time PCR
Coloranti intercalanti
Sonde specifiche ad ibridizzazione
Tutte le chimiche fanno uso di fluorocromi che emettono fluorescenza se eccitati da una luce a determinata λ
" SYBR green
" Etido bromuro
" TaqMan (sonde di ibridazione con idrolisi)
" FRET " Molecular beacons
" Scorpion (sonde incorporate nei primers)
(sonde di ibridazione senza idrolisi)
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COLORANTI INTERCALANTI
EtBr emette fluorescenza 25 volte più intensa se legato a dsDNA
SYBR Green emette fluorescenza 200 volte più intensa se legato a
dsDNA
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SYBR GREEN: principio
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si
lega al solco minore del DNA
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SYBR GREEN
L’intercalante emette una bassa fluorescenza quando non è legato a dsDNA Durante l’estensione SYBR Green si lega a dsDNA: il segnale aumenta Durante la denaturazione SYBR Green torna in soluzione: il segnale dimunisce
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SYBR Green E’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed
emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.
DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza
L’intensità della fluorescenza comincia ad aumentare
ANNEALING
ALLUNGAMENTO L’intensità della fluorescenza continua
ad aumentare e diventa massima al termine della fase di allungamento
L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 530nm
SYBR Green Primer Luce emessa
Polimerasi
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5’
5’
3’ 3’
d.NTPs
Thermal Stable DNA Polymerase
Primers 5’
3’ Add Master Mix and Sample
Denaturation
5’
3’
5’
3’
Annealing
Reaction Tube
Intercalation Dyes
Taq ID λ
SYBR GREEN
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Extension
5’ 3’
5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’
Extension Continued Apply Excitation
Wavelength
5’ 3’
5’ 3’ 5’
5’
Taq
Taq
3’
5’ 3’
Taq
Taq 5’
5’
Repeat
ID ID
ID ID ID
ID ID ID
ID ID
λ λ λ
λ λ
SYBR GREEN
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♦ Specificità è data solo dai primers
♦ La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers
SVANTAGGI
♦ È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici
VANTAGGI
Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa
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Misurazione della fluorescenza durante il progressivo aumento T > Tm target Alla T alla quale i filamenti di DNA si separano, il segnale precipita
Curva di melting alla fine della reazione
Il modo più semplice di programmare una curva di melting consiste nell’aumentare gradatamente la
temperatura (0.5°C per ciclo)
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Due modi per analizzare la curva di melting
la diminuzione della fluorescenza con l’aumentare della temperatura
il tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo
SYBR GREEN
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SYBR GREEN
Diminuzione della fluorescenza con l’aumentare della temperatura
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SYBR GREEN
Tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo
specifico
aspecifico
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SONDE DI IBRIDAZIONE
• Sonde di ibridazione con idrolisi – TaqMan
• Sonde di ibridazione senza idrolisi
– Molecular Beacons – Dual oligo FRET probes
• Sonde incorporate nei primers
– Amplifluor – Scorpions
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TAQMAN PROBES
Sfrutta l’attività 5’-3’ esonucleasica di alcune polimerasi (Taq, Tth, Tfl)
Il probe è costituito da un oligonucleotide marcato con fluorocromi alle estremità 5’ e 3’
• Fluorocromo 5’ REPORTER
• Fluorocromo 3’ QUENCHER Quando la sonda non è ibridata, Q assorbe la fluorescenza di R ed il sistema è silente
Il sistema TaqMan è costituito da 2 primers + 1 sonda (probe)
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TAQMAN PROBES
R Q
R
Q
Principio di Forster del trasferimento dell’energia
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TAQMAN PROBES
5’
5’
3’ 3’
d.NTPs
Thermal Stable DNA Polymerase
Primers 5’
3’ Add Master Mix and Sample
Denaturation
5’
3’
5’
3’
Annealing
Reaction Tube
Taq
λ
5’ 3’
R Q Probe
5’ 3’
R Q
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TAQMAN PROBES
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
R Q
Extension Step
5’ 3’ 1. Strand Displacement Taq
3’
Q
R
5’
5’ 3’ 3’
Q Taq
R
5’ 2. Cleavage
3. Polymerization Complete 5’ 3’
Taq R
3’ 5’
4. Detection 5’ 3’ 3’
Taq R
5’
λ
R
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TAQMAN PROBES
Vantaggi • Il sistema TaqMan produce un robusto segnale cumulativo • Chimica più utilizzata in real-time • Mix precostituite per molti saggi TaqMan
Svantaggi • Il quencher emette fluorescenza • Elevato background • Specificità alta, ma inferiore rispetto a
beacon
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TAQMAN PROBES
Disegno di primers e probe
º Amplicone di 70-150 bp (+ facile denaturazione)
º Tm probe = 68-70°C (10°C > Tm primers) º Tm primers = 58-60 °C º No G all’estremità 5’ del probe
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TAQMAN PROBES
Effetto della lunghezza dell’amplicone sull’efficienza di reazione
Primers studiati per RealTime PCR: I primers amplificano un segmento di 79 basi del transgene TSWV-N
Primers utilizzati in PCR tradizionale: I primers amplificano un segmento di 273 basi del transgene TSWV-N
Stessa sonda, stesso DNA-target, stessa [ ] di DNA
TC = 19.4
TC = 20.9
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File termico
• Poiché l’idrolisi della sonda avviene solo se questa è ibridata al target, l’estensione dovrebbe avvenire a T compatibili con la Tm della sonda
• Molti sistemi TaqMan utilizzano due soli
step: 1. denaturazione a 94°C 2. annealing/extension a 60°C
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SONDE MINOR GROOVE BINDER (MGB)
• Aumento della stabilita’ termodinamica • Riduzione della lunghezza della sonda
(12-18 basi) • Incremento della specificita’ snps
diidrociclopirroloindolocarbossilato tripeptide, CDPI3
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VARIAZIONE NEL GENE DELLA PROTEINA DEL CAPSIDE
PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2)
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DISEGNO DI PRIMERS E SONDE MGB CPVa/b-For CPVb/c For CPVa/b-Rev CPVb/c Rev CPVa-Pb (marcata con VIC) CPVb2-Pb
(marcata con FAM) CPVb1-Pb (marcata con FAM) CPVc-Pb
(marcata con VIC)
Test 2a/2b Test 2b/2c
4062A G 4064T A
PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2)
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MOLECULAR BEACONS
• Possiedono una struttura “stem and loop”
• Il loop è costituito da una regione complementare alla sequenza target
• Lo stem è costituito da due braccia complementari tra di loro, marcate rispettivamente con reporter e quencher
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MOLECULAR BEACONS
Lungh. braccia = 4-7 bp Tm loop = 68-70°C Tm braccia =2-5°C<Tm loop Tm primers=58-60°C
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• In soluzione il beacon assume una forma a forcina (hairpin), a causa della elevata complementarietà tra le basi delle braccia
• Quando è ibridato al target, il beacon assume conformazione lineare
MOLECULAR BEACONS
QUENCING
FLUORESCENZA
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MOLECULAR BEACONS
5’
5’
3’ 3’
d.NTPs
Thermal Stable DNA Polymerase
Primers 5’
3’ Add Master Mix and Sample
Annealing
Reaction Tube
Denaturation
5’
3’
5’
3’
Taq
5’ 3’
R Q
R Q
Molecular Beacon
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MOLECULAR BEACONS
5’ 3’ 5’ 3’
Extension Step 5’ 3’
1. Strand Displacement Taq 5’
2. Polymerization Complete
Probe Silent
λ
5’ 3’
R Q
Detection
5’ 3’
R Q
5’ 3’ 3’ 5’
Taq R Q
Molecular Beacon
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MOLECULAR BEACONS
Vantaggi
• Alta specificità (1 nt) • Basso background
Svantaggi • I beacon non producono un robusto segnale cumulativo • Difficoltà nel disegno del beacon
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FRET PROBES
• Utilizzano due sonde diverse che ibridizzano al target in modo che l’estremità 5’ della prima sia vicina alla estremità 3’ della seconda (ibridazione testa-coda)
• La prima sonda reca alla estremità 5’ un fluoroforo (donatore) la cui emissione è silente, ma capace di eccitare il fluoroforo presente alla estremità 3’ dell’altra sonda
• Solo l’emissione del secondo fluoroforo è captata dal detector
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Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però due sonde ognuna marcata con un solo f luorocromo (accettore e donatore) Quando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente d a l l ' a c c e t t o r e n o n è r i l e v a t o
Durante lo step di annealing PCR, entrambe le sonde FRET ibridizzano alle sequenze target: c i ò avv i c i na i l f l uoroforo donatore all'accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di u n s e g n a l e f l u o r e s c e n t e d a p a r t e d e l l ' a c c e t t o r e c h e v i e n e r i l e v a t o
donatore accettore
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FRET PROBES
5’ 3’ 5’ 3’
l 3’
D R 5’ Detection
Extension Step 5’ 3’
1. Strand Displacement System Silent
2. Polymerization Complete
System Silent 5’ 3’
3’ 5’
Taq
3’ D
1-5 bases
R
Taq 5’
R 5’