Quantitative Real-time PCR

Tecnica che consente la simultanea amplificazione e quantificazione del DNA target

AMPLIFICAZIONE: prevede essenzialmente gli step di una classica PCR

QUANTIFICAZIONE:

effettuata aggiungendo composti la cui fluorescenza

emessa ad ogni ciclo di reazione è proporzionale alla quantità di

amplificato

Real-Time PCR: la reazione

COMPONENTI DELLA REAZIONE:

1) DNA target

2) DNA polimerasi

3) Due oligonucleotidi

4) dNTPs

5) Fluorocromo

APPLICAZIONI

Diagnosi malattie infettive

Quantificazione patogeno

RICERCA

Espressione genica

OGM

Perché Real-Time?

Misura l’amplificazione in tempo reale nella fase

esponenziale

cycle number

Tar

get

copy

num

ber

Curva di amplificazione PCR

Exponential phase Pateau phase

RT-PCR quantitativa

La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazione viene rilevata e analizzata tramite computer

Plot lineare

Cicli di PCR

Incr

emen

to d

i fl

uore

scen

za

Plot di amplificazione

Curve di amplificazione

Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT (=Threshold Cycle) è inversamente

proporzionale alla quantità di templato iniziale

Fluo

resc

enza

Cicli di amplificazione

96 replicati di uno stesso campione danno quantità finali di c-DNA

molto diverse

Curva di amplificazione PCR

Differenze quantificazione PCR convenzionale/Real-time PCR

♦  End-point

♦  No monitoraggio

PCR conv.

♦  Fase esponenziale

♦  Monitoraggio

Real-time PCR

♦  < Sensibilità ♦  > Sensibilità

♦  Post-PCR ♦  No post-PCR

Strumentazione Real-time

♦  Termociclizzatore

♦  Sorgente laser

♦  Detector

Strumentazione Real-time

5’ 3’

F Q

Tubulin

5’ 3’

H Q

GapdH

5’ 3’

TX Q

β-actin

5’ 3’

Cy5 Q

Cyclophilin

Strumentazione Real-time

Dopo ogni rilevamento, i segnali di fluorescenza sono processati da un software e la cinetica di formazione

dell’amplificato è visualizzata graficamente come incremento dei

segnali di fluorescenza in ordinata (ΔRn) per cicli di reazione in ascissa

ANALISI REAL-TIME PCR

ΔRn = Rn + - Rn - Rn + = int. fluor. R/int. fluor. Q al mom. rilev. Rn - = int. fluor. R/int. fluor. Q prima dell’amplif.

CICLO THRESHOLD

0

0 . 4

0 . 8

1 . 2

1 . 6

2

0 1 0 2 0 2 1 3 0 4 0

Th re s h o l dB a s e l i n eS a m p l e

CT

Il ciclo threshold (CT) è il ciclo della reazione di amplificatione nel quale il segnale di fluorescenza

supera il valore di threshold

Il threshold rappresenta quel valore di fluorescenza pari a 10 volte la ds della fluorescenza registrata nei

primi cicli di amplificazione (background)

CICLO THRESHOLD Il Ct di 96 replicati dello stesso campione mostra valori di fluorescenza quasi identici

perché è calcolato in fase esponenziale

CICLO THRESHOLD È strettamente correlato al numero di copie iniziali del target

  Un numero iniziale di copie pari al doppio anticipa il Ct di un ciclo   Un numero iniziale di copie pari a metà posticipa il Ct di un ciclo   Due campioni che possiedono q di target diverse di 1 log hanno un

DCt di 3,3

  Si mantiene lineare con log di numero di copie iniziali che superano i 6-8 ordini di grandezza

Which one has the most?

The least?

QUANTIFICAZIONE

ASSOLUTA: i campioni sono quantificati in modo assoluto

 Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una curva standard)

 Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni

RELATIVA: la quantificazione viene effettuata paragonando i Ct

 Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una curva standard)

 Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro ΔCT con quello del controllo endogeno

QUANTITATIVA ASSOLUTA

Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente (b-actina, GAPDH,

ATPs, b2 etc)

CICLO THRESHOLD Il Ct è un indicatore del numero di copie iniziali

CURVA STANDARD

Amplificando in parallelo ai campioni a conc. non nota (unknown) degli standard esterni (a conc. nota) a

diverse diluizioni, è possibile costruire una retta di regressione (curva di taratura o curva standard)

Conoscendo il valore di Ct, la conc. degli UKN si può ricavare per interpolazione ponendo il Ct in ordinata

e la conc. iniziale in ascissa

CURVA STANDARD

CURVA STANDARD

Il sistema consente di valutare l’efficienza di amplificazione mediante l’analisi di tre parametri:

1.Slope (s): indica il n° di cicli che intercorrono tra due diluizioni dello standard che differiscono di 1 log (teorico -3,3)

2.Coeff. correlazione (R): esprime le correlazioni esistenti tra i diversi segmenti che compongono la

retta di regressione (teorico 1)

3. Intercetta nell’asse (y): definisce il n° di cicli necessari per rilevare 1 copia di DNA target

STANDARD

ac. nucleico estratto da diluizioni log di sosp. virale titolata su cellule (TCID50/50ml, PFU)

Virus:

Per DNA: plasmide contenente il target, la cui conc. è stata

determinata allo spettrofotometro (ng/ml) ed eventualmente trasformata in numero di copie

Per RNA: plasmide trascritto in vitro; la conc. di RNA standard è determinata allo SF (ng/ml) ed

eventualmente trasformata in numero di copie

QUANTITATIVA RELATIVA

Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il cambiamento di espressione di un gene target in un campione

rispetto ad un altro campione scelto come calibratore

ΔCT

QUANTITATIVA RELATIVA

Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario:

• TARGET – La sequenza di DNA da analizzare.

• CALIBRATORE – Il campione da usare come riferimento per l’analisi comparativa

• CONTROLLO ENDOGENO – Un gene espresso costitutivamente in tutti i campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione

Quantitativa relativa: analisi dei dati

 Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente (ΔCT)

 Comparare ciascun ΔCT così ottenuto con il ΔCT di un

calibratore (cb) (ΔΔCT) 2 -(ΔCT,r- ΔCT,cb) = 2 –ΔΔCT

 Il valore così ottenuto permette di determinare la Concentrazione relativa del target

Step per il calcolo del 2- DDCT

1. Normalizzazione con un controllo endogeno (HK)

Ct gene interesse – Ct HK = ΔCt

2. Normalizzazione con il calibratore

ΔCt Campione – ΔCt Calibratore = ΔΔCt

3. Applicare la formula 2 -ΔΔCt

ESEMPIO

Di quanto varia l’espressione dell’ IL-10 tra Liver e Brain?

1. ΔCt Brain = 18 ΔCt Liver = 12

2. ΔCt campione – ΔCt calibratore = 12-18 = -6

3. 2 -ΔΔCT = 26 = 64

L’IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain!

Chimiche Real-time PCR

Coloranti intercalanti

Sonde specifiche ad ibridizzazione

Tutte le chimiche fanno uso di fluorocromi che emettono fluorescenza se eccitati da una luce a determinata λ

"   SYBR green

"   Etido bromuro

"   TaqMan (sonde di ibridazione con idrolisi)

"   FRET "   Molecular beacons

"   Scorpion (sonde incorporate nei primers)

(sonde di ibridazione senza idrolisi)

COLORANTI INTERCALANTI

EtBr emette fluorescenza 25 volte più intensa se legato a dsDNA

SYBR Green emette fluorescenza 200 volte più intensa se legato a

dsDNA

SYBR GREEN: principio

Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si

lega al solco minore del DNA

SYBR GREEN

  L’intercalante emette una bassa fluorescenza quando non è legato a dsDNA   Durante l’estensione SYBR Green si lega a dsDNA: il segnale aumenta   Durante la denaturazione SYBR Green torna in soluzione: il segnale dimunisce

SYBR Green E’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed

emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.

DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza

L’intensità della fluorescenza comincia ad aumentare

ANNEALING

ALLUNGAMENTO L’intensità della fluorescenza continua

ad aumentare e diventa massima al termine della fase di allungamento

L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’ REGISTRATO A 530nm

SYBR Green Primer Luce emessa

Polimerasi

5’

5’

3’ 3’

d.NTPs

Thermal Stable DNA Polymerase

Primers 5’

3’ Add Master Mix and Sample

Denaturation

5’

3’

5’

3’

Annealing

Reaction Tube

Intercalation Dyes

Taq ID λ

SYBR GREEN

Extension

5’ 3’

5’ 3’ 5’ 3’

5’ 3’

Extension Continued Apply Excitation

Wavelength

5’ 3’

5’ 3’ 5’

5’

Taq

Taq

3’

5’ 3’

Taq

Taq 5’

5’

Repeat

ID ID

ID ID ID

ID ID ID

ID ID

λ λ λ

λ λ

SYBR GREEN

♦  Specificità è data solo dai primers

♦ La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers

SVANTAGGI

♦ È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici

VANTAGGI

 Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa   Non costosa

  Misurazione della fluorescenza durante il progressivo aumento T > Tm target   Alla T alla quale i filamenti di DNA si separano, il segnale precipita

Curva di melting alla fine della reazione

Il modo più semplice di programmare una curva di melting consiste nell’aumentare gradatamente la

temperatura (0.5°C per ciclo)

Due modi per analizzare la curva di melting

  la diminuzione della fluorescenza con l’aumentare della temperatura

  il tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo

SYBR GREEN

SYBR GREEN

  Diminuzione della fluorescenza con l’aumentare della temperatura

SYBR GREEN

  Tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo

specifico

aspecifico

SONDE DI IBRIDAZIONE

•  Sonde di ibridazione con idrolisi –  TaqMan

•  Sonde di ibridazione senza idrolisi

–  Molecular Beacons –  Dual oligo FRET probes

•  Sonde incorporate nei primers

–  Amplifluor –  Scorpions

TAQMAN PROBES

Sfrutta l’attività 5’-3’ esonucleasica di alcune polimerasi (Taq, Tth, Tfl)

Il probe è costituito da un oligonucleotide marcato con fluorocromi alle estremità 5’ e 3’

•  Fluorocromo 5’ REPORTER

•  Fluorocromo 3’ QUENCHER Quando la sonda non è ibridata, Q assorbe la fluorescenza di R ed il sistema è silente

Il sistema TaqMan è costituito da 2 primers + 1 sonda (probe)

TAQMAN PROBES

R Q

R

Q

Principio di Forster del trasferimento dell’energia

TAQMAN PROBES

5’

5’

3’ 3’

d.NTPs

Thermal Stable DNA Polymerase

Primers 5’

3’ Add Master Mix and Sample

Denaturation

5’

3’

5’

3’

Annealing

Reaction Tube

Taq

λ

5’ 3’

R Q Probe

5’ 3’

R Q

TAQMAN PROBES

5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’

R Q

Extension Step

5’ 3’ 1. Strand Displacement Taq

3’

Q

R

5’

5’ 3’ 3’

Q Taq

R

5’ 2. Cleavage

3. Polymerization Complete 5’ 3’

Taq R

3’ 5’

4. Detection 5’ 3’ 3’

Taq R

5’

λ

R

TAQMAN PROBES

Vantaggi •  Il sistema TaqMan produce un robusto segnale cumulativo •  Chimica più utilizzata in real-time •  Mix precostituite per molti saggi TaqMan

Svantaggi •  Il quencher emette fluorescenza •  Elevato background •  Specificità alta, ma inferiore rispetto a

beacon

TAQMAN PROBES

Disegno di primers e probe

º  Amplicone di 70-150 bp (+ facile denaturazione)

º  Tm probe = 68-70°C (10°C > Tm primers) º  Tm primers = 58-60 °C º  No G all’estremità 5’ del probe

TAQMAN PROBES

Effetto della lunghezza dell’amplicone sull’efficienza di reazione

Primers studiati per RealTime PCR: I primers amplificano un segmento di 79 basi del transgene TSWV-N

Primers utilizzati in PCR tradizionale: I primers amplificano un segmento di 273 basi del transgene TSWV-N

Stessa sonda, stesso DNA-target, stessa [ ] di DNA

TC = 19.4

TC = 20.9

File termico

•  Poiché l’idrolisi della sonda avviene solo se questa è ibridata al target, l’estensione dovrebbe avvenire a T compatibili con la Tm della sonda

•  Molti sistemi TaqMan utilizzano due soli

step: 1. denaturazione a 94°C 2. annealing/extension a 60°C

SONDE MINOR GROOVE BINDER (MGB)

•  Aumento della stabilita’ termodinamica •  Riduzione della lunghezza della sonda

(12-18 basi) •  Incremento della specificita’ snps

diidrociclopirroloindolocarbossilato tripeptide, CDPI3

VARIAZIONE NEL GENE DELLA PROTEINA DEL CAPSIDE

PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2)

DISEGNO DI PRIMERS E SONDE MGB CPVa/b-For CPVb/c For CPVa/b-Rev CPVb/c Rev CPVa-Pb (marcata con VIC) CPVb2-Pb

(marcata con FAM) CPVb1-Pb (marcata con FAM) CPVc-Pb

(marcata con VIC)

Test 2a/2b Test 2b/2c

4062A G 4064T A

PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2)

MOLECULAR BEACONS

•  Possiedono una struttura “stem and loop”

• Il loop è costituito da una regione complementare alla sequenza target

• Lo stem è costituito da due braccia complementari tra di loro, marcate rispettivamente con reporter e quencher

MOLECULAR BEACONS

Lungh. braccia = 4-7 bp Tm loop = 68-70°C Tm braccia =2-5°C<Tm loop Tm primers=58-60°C

• In soluzione il beacon assume una forma a forcina (hairpin), a causa della elevata complementarietà tra le basi delle braccia

• Quando è ibridato al target, il beacon assume conformazione lineare

MOLECULAR BEACONS

QUENCING

FLUORESCENZA

MOLECULAR BEACONS

5’

5’

3’ 3’

d.NTPs

Thermal Stable DNA Polymerase

Primers 5’

3’ Add Master Mix and Sample

Annealing

Reaction Tube

Denaturation

5’

3’

5’

3’

Taq

5’ 3’

R Q

R Q

Molecular Beacon

MOLECULAR BEACONS

5’ 3’ 5’ 3’

Extension Step 5’ 3’

1. Strand Displacement Taq 5’

2. Polymerization Complete

Probe Silent

λ

5’ 3’

R Q

Detection

5’ 3’

R Q

5’ 3’ 3’ 5’

Taq R Q

Molecular Beacon

MOLECULAR BEACONS

Vantaggi

•  Alta specificità (1 nt) •  Basso background

Svantaggi •  I beacon non producono un robusto segnale cumulativo •  Difficoltà nel disegno del beacon

FRET PROBES

• Utilizzano due sonde diverse che ibridizzano al target in modo che l’estremità 5’ della prima sia vicina alla estremità 3’ della seconda (ibridazione testa-coda)

• La prima sonda reca alla estremità 5’ un fluoroforo (donatore) la cui emissione è silente, ma capace di eccitare il fluoroforo presente alla estremità 3’ dell’altra sonda

• Solo l’emissione del secondo fluoroforo è captata dal detector

Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però due sonde ognuna marcata con un solo f luorocromo (accettore e donatore) Quando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente d a l l ' a c c e t t o r e n o n è r i l e v a t o

Durante lo step di annealing PCR, entrambe le sonde FRET ibridizzano alle sequenze target: c i ò avv i c i na i l f l uoroforo donatore all'accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di u n s e g n a l e f l u o r e s c e n t e d a p a r t e d e l l ' a c c e t t o r e c h e v i e n e r i l e v a t o

donatore accettore

FRET PROBES

5’ 3’ 5’ 3’

l 3’

D R 5’ Detection

Extension Step 5’ 3’

1. Strand Displacement System Silent

2. Polymerization Complete

System Silent 5’ 3’

3’ 5’

Taq

3’ D

1-5 bases

R

Taq 5’

R 5’