Un nuovo approccio: la VEQ in biologia molecolaredi biologia molecolare nell’U.O. Microbiologia...

Un nuovo approccio:la VEQ in biologia molecolare

Il crescente interesse nella biologia molecolare applicata alla diagnostica è il risultato dei profondi progressi ottenuti nelleconoscenze scientifiche in genetica, rese possibili dall’introduzione delle tecniche di amplificazione genica.

Il numero di laboratori che utilizzano la tecnologia dell’ amplificazione genica sta crescendo rapidamente e una conseguenza inevitabile di questa “esplosione demografica” è la necessità di standardizzazione oltre che di una definizione dell’organizzazione dei laboratori.

Microbiologia Genetica Oncologia Farmacogenetica

Biologia Molecolare applicataalla diagnostica

Tecniche impiegate

PCR: amplificazione del DNA

RT-PCR: amplificazione dell’RNA

PCR-SEQ: sequenziamento del DNA/RNA, previa amplificazione

Campioni sottoposti a tecniche diagnostiche di biologia molecolare nell’U.O.

Microbiologia nel primo semestre 2005

PCR o altre tecniche di amplificazione del bersaglio

4090

RT-PCR 14722

PCR-SEQ 235

Toxoplasma, Antrace, Chlamydia, Micoplasma, HSV 1-2, VZV, CMV, EBV, HHV6, HHV8, Enterovirus, HPV, Parvovirus, HBV, HCV, HIV.

Talloni d’Achille delle tecniche di amplificazione degli acidi

nucleici

• Elevata sensibilità: rischio di contaminazioni

• Inattivazione delle DNA polimerasi da impurezze

Rischio di contaminazioni

Organizzazione del laboratorio e della strumentazione:

1. Area conservazione dei reagenti e allestimento master mix

2. Area preparazione del campione3. Area assemblaggio miscele di reazione e mplificazione4. Area analisi amplificati

Aspetti preanalitici

Necessaria una chiara definizione dei passagi preanalitici

Rischi:

Degradazione degli acidi nucleici da parte di nucleasi ubiquitarie

Sensibilità della PCR rende possibile l’amplificazione di materiale contaminante

Lavaggio bronchiale

Sciacquo orale

Saliva

Buffy Coat

Sangue dessicato

Siero o plasma

Sangue intero

Fluido cerebrospinale

Midollo osseo

Urina

Feci

Materiale bioptico

CAMPIONI BIOLOGICI

Campioni omogenei PCR compatibili

Centralità del campione

Validazione

AssicurazioneQualità

Interna

Tipo dicampione

ValutazioneEsterna

Qualità

Approccio integrato allo sviluppo di un saggio PCR diagnostico

Campionamento

Dove possibile evitare contenitori aperti

In caso diverso è importante evitare contaminazione con materiale dell’operatore

Preferibili contenitori di plastica monouso

Sangue e midollo osseo non devono coagulare

Conservazione dei campioniI campioni destinati all’analisi del DNA dovrebbero essere conservati in tamponi di T10-E1 10 (mM Tris, 1 mM EDTA pH 7.5– 8.0) a 4 °C.

I campioni destinati all’analisi dell’RNA dovrebbero essere conservati in soluzioni tamponate preferibilmente a -80°C o in azoto liquido. Adeguata anche la conservazione sotto forma di precipitato in etanolo a -20 °C.Campioni di RNA stabilizzati con ITCG possono essere conservati 7 gg a T ambiente.

Otto preparazioni diverse di genoma di CitomegalovirusConservate a 4°C in TE per 5 anni

Amplificazione del gene UL44 (1299pb)

Fattori che interferiscono con le procedure analitiche

Preparazione dei campioni

DNA. Eliminazione incompleta di inibitori: • dal campione stesso (eme e precursori)• da campionamento inadeguato (eparina)• dalla procedura di purificazione (solventi organici)

RNA. Eliminazione incompleta di inibitori,Contaminazione con RnasiPerdita durante la precipitazione


Contaminazioni

• Dagli stessi ampliconi• Da acidi nucleici nativi• Dei reagenti• Crociate (fra un campione positivo e uno negativo)


Analisi dei prodotti di amplificazione

ElettroforesiDigestioni di restrizioneTrasferimento degli ampliconi (blotting)IbridizzazioneSequenziamento

Validazione mediante “GoldStandard”

I risultati ottenuti con il saggio PCR dovrebbero essere paragonabili a quelli ottenuti con un metodo di

riferimento


Definizioni usate nella validazione di saggi PCR (protocollo MicroVal, ISO 16140, 2003)

• PCR qualitativa: la risposta al saggio è la presenza o l’assenzadi un prodotto di PCR (amplicone) rilevato o per osservazione diretta o con strumentazione

• PCR quantitativa: la risposta al saggio può essere correlatacon il numero delle copie di amplicone, determinato dal numero di copie di sequenza bersaglio

• Limite di determinazione: il minimo numero di microrganismi bersaglio per produrre una risposta PCR positiva


• Selettività: misura della inclusione di ceppi bersaglio (fra unampio spettro di ceppi) ed esclusione (la mancata amplificabilità di un rilevante spettro di ceppi non bersaglio strettamente correlati)

• Deviazione positiva (DP): caso PCR + a fronte di un risultato - del saggio di riferimento (SR) (falso positivo)

• Deviazione negativa (DN): caso PCR - a fronte di un risultato + del SR (falso negativo)

• Accordo positivo (AP): campione PCR + e SR +

• Accordo negativo (AN): campione PCR - e SR -


• Accuratezza diagnostica (AC): grado di corrispondenzatra risultato ottenuto con PCR e SR su campioni identici (AC=(AP+AN)/Numero totale dei campioni

• Sensibilità diagnostica (SE): capacità del saggio PCR dirilevare il bersaglio quando è rilevato dal SR {(AP/N+)x100}

• Specificità diagnostica (SP): capacità del saggio PCR di non rilevare il bersaglio quando non è rilevato dal SR {(AP/N-)x100}

• Robustezza: riproducibilità da parte di altri laboratori che usinoaltri lotti e altre marche di reagenti, termociclatori e strumentazione validati

N+ numero totale di risultati positivi con SRN- numero totale di risultati negativi con SR

Controlli di qualitàControlli interni 1

• Relativi alla preparazione del materiale da saggiare:

DNA Integrità - elettroforesi in gel d’agarosioInibitori - digestione con ER, quindi elettroforesi

analisi spettrofotometrica a 260 e 280nm

RNA Integrità - elettroforesi in gel d’agarosio non denat.o denaturante

Inibitori - analisi spettrofotometrica a 260 e 280nm


• Relativi alla sintesi di cDNA e amplificazione:sintesi di cDNA

Controllo interno (CI) - mRNA presenti nel campione (messaggeri ubiquitari) o RNA aggiunto al momentoSe il prodotto del CI non viene amplificato:

• degradazione dell’RNA• mancato priming della sintesi del cDNA• assenza di attività enzimatica

L’aggiunta di quantità note di un CI consente di rilevare diminuita sensibilità dell’RT-PCR


•Relativi alla sintesi di cDNA e amplificazione:PCR.:

Controllo interno (CI) - gene essenziale per la sopravvivenza (fattore di letalità, presente almeno allo stato di emizigote) opure aggiunto al momento

In questo caso il CI consente di distinguere tra assenza della sequenza bersaglio e insuccesso della PCR.

Controlli di qualità

Controlli esterni

Controllo esterno positivo: aliquote di DNA appropriate e loro appropriate diluizioni consentono un controllo di qualità della miscela di reazione.E’ essenziale se si sospetta che il limite di determinazione possa essere inadeguato a rivelare la presenza del bersaglio.

Controlli di qualitàControlli esterni

Controllo esterno negativo: Campione negativo contenente materiale genetico

strettamente imparentato con quello cercato, ma che non può funzionare da bersaglio

Bianco: contiene tutti i reattivi ma non il campione da amplificare. Diversi bianchi possono essere inseriti ai passaggi che si ritengano a rischio di contaminazione.

Controllo ambientale: provetta contenente la miscela di reazione lasciata aperta durante lo svolgimento di tutto il saggio per la rivelazione di DNA contaminante proveniente dall’ambiente.

Controlli di qualitàControlli per la valutazione dei risultati

Se l’amplicone deve essere sottoposto a digestione enzimatica (RFLP) la funzionalità dell’enzima usato può essere controllata mediante la scelta di frammenti diagnostici che includano siti di restrizione costanti per lo stesso enzima

Elettroforesi: calibratori delle dimensioni degli ampliconi e ampliconi di controllo a concentrazione nota. Devono subire le stesse procedure di preparazione dei campioni

Controlli di qualitàControlli per la valutazione dei risultati

Controlli per il sequenziamento: le ditte produttrici in genere forniscono opportuni templati per l’amplificazione e i corrispondenti primer per il controllo delle reazioni di sequenziamento. Queste reazioni consentono anche di controllarela qualità del gel di sequenziamento. Per l’analisi di mutazioni sarebbe opportuno l’analisi in parallelo di alleli wt di controllo e campioni da altri membri della famiglia.

Valutazione esterna di qualitàproficiency testing

• Methodological proficiency testingVerifica della qualità dei passaggi analitici elementari:

Preparazione di DNA/RNAPerformance del metodo di amplificazione con primer fornitielettroforesi in gel d’agarosio

• Application based proficiency testing: Realizzabile per saggi eseguiti con relativa frequenza

Valutazione esterna di qualitàApplication based proficiency testing

Valutazione esterna di qualitàApplication based proficiency testing

1. Determinazione di mutazioni genetiche2. Interpretazione dei risultati

Campioni

DNA purificato

Azioni

Determinazione di mutazioni specifiche per:

Fibrosi cistica, Poliposi adenomatosa

familiare

β-talassemia, sindrome dell’ X fragile

Valutazione esterna di qualitàMethodological proficiency testing

1. Estrazione del DNA2. Performance della PCR3. Interpretazione dei risultati

Campioni

DNA standard

Campione di sangue

DNA di riferimento e Primer

Azioni

Determinazione spettrofotometrica

Estrazione di DNA e det. spettrofotom.

PCR in parallelo con il DNA estratto con

3 coppie di primer e analisi dei prodotti

Valutazione esterna di qualitàMethodological proficiency testing

Da C. Casini Raggi, Clin. Biochem. (2003); 49:782-791

Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare

Il Vostro laboratorio esegue metodiche di biologia olecolare?

16 No17 Si

Il sistema di estrazione degli acidi nucleici utilizzato è:

6 Si5 No6 Non so

Protocollo riconosciuto come gold standard?

0Protocollo in house17Kit commerciale


Il materiale genetico estratto viene controllato per qualità e purezza prima di essere processato?

Il laboratorio dispone di uno spettrofotometro?

3 Non Risponde4 No10 Si

Il laboratorio utilizza enzimi di restrizione?

2 Non Risponde11 No4 Si

1 A volte13 No3 Si


Quale/i metodo/i di amplificazione genica è/sono in usonel vostro laboratorio?

2 PCR-SEQ

5 RT-PCR

3 RealTime PCR

14 PCR


I risultati sono interpretati con l’aiuto di:

1Non Risponde

1 Metodi propri

5Standard Interno e Standard esterno

4 Standard esterno

6 Standard Interno


Viene eseguita l’identificazione del genoma di microrganismi patogeni?

2 Non risponde6 NO10 Si

Programma VEQ biologia molecolare

1. Estrazione del DNA2. Performance della PCR3. Interpretazione dei risultati

Campioni

Campione di sangue

DNA di riferimento, Primer

ed Enzima di Restrizione

Azioni

Estrazione di DNA:

determinazione quantità e verifica

purezza.

PCR in parallelo con il DNA estratto con

3 coppie di primer e analisi dei prodotti

Programma VEQ biologia molecolare

Estrazione del DNA Determinazione spettrofotometricaA260/A280

Digestione con ER e analisi elettroforetica

Amplificazione DNA estratto e DNA di riferimento con primerForniti in doppio

Analisi diretta

Interpretazione dei risultati

Spedizione gruppo VEQ BMS.Orsola - Verifica

Variabilià dei saggi di PCRLa qualità dei risultati del saggio è influenzata in modo determinante da fattori che riguardano il prelievo del campione, la preparazione del campione e la preparazione della miscela di reazione.

I saggi PCR di routine andrebbero controllati a livelli di vari parametri: specificità, limite di determinazione, linearità, precisione, etc.)

Il limite di determinazione dovrebbe essere valutato su tutta laprocedura, dalla raccolta del campione, alla sua preparazione, all’amplificazione dell’acido nucleico e alla rivelazione degli ampliconi

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