Cap.11 Ottimizzazione Della PCR

OTTIMIZZAZIONE della PCR

❖ Tecnica SEMPLICE,RAPIDA, SENSIBILE e DUTTILE

❖ Numerose APPLICAZIONI❖ Diagnostica: virologia, batteriologia, microbiologia❖ Genetica: sequenziamento, microsatelliti, linkage❖ Citogenetica: PRINS, IS PCR❖ Ambiente: Ricerca di patogeni in acque, cibi, matrici

alimentari❖ Medicina Legale: fingerprinting, diagnosi paternita’❖ Ricerca di Base: studi di espressione, studi

retrospettivi

LE PAROLE MAGICHE DELLA PCR

❖ SPECIFICITA’❖ EFFICIENZA❖ FEDELTA’❖ Nf = N0 (1 + Y)n

equazione della PCR

PCR IDEALE

❖ Alta specificita’, molta resa di prodotto di amplificazione, molto fedele.

❖ Max specificita’... minor resa...Sigh...❖ Alta fedelta’...poca resa...Acc...❖ Quando si costruisce un esperimento di PCR

occore sapere quale dei tre parametri e’ il piu’importante (es. sequenziamento diretto prodotti PCR e fedelta’)

TIPI DI TEMPLATI DA AMPLIFICARE

❖ DNA genomico, plasmidico, di fago, cDNA, mRNA, DNA precedentemente amplificati (NESTED PCR) etc.

❖ ESTRAZIONE dell’acido nucleico e FONTE di PROVENIENZA

❖ Estrazione: occorre eliminare gli eventuali inibitori della Taq polimerasi.

❖ QUANTITA’ da utilizzare: 0.1-1 µg

DIMENSIONI DEL TEMPLATO❖ Efficienza maggiore per templati di piccola taglia

piuttosto che per gli alti pesi molecolari❖ Rottura meccanica o mediante enzimi di restrizione

(con siti rari)❖ Controllo del templato (minigel), pulizia e

purificazione del templato❖ Quantizzazione del templato (gel +spettrofotometro)

DISEGNO DEI PRIMERS

❖ SPECIFICITA’. Oligo V, Primer Express, Calcolo della Tm in base alla [primers] e [MgCl2]

❖ Applicazioni particolari ❖ PCR allele-specifica, clonaggio di geni

omologhi dove mancano informazioni sulla sequenza, ingegnerizzazione di nuove mutazioni o nuovi siti di restrizione: dei “mismacthes” vengono introdotti intenzionalmente o inevitabilmente

SPECIFICITA’ DEI PRIMERS

❖ Lunghezza dei primers: da 15 a 30 basi, media 20 basi

❖ Probabilita’ di trovare una zona non desiderata in cui i primers non si ibridino: (1/4)(20+20)= 9 x 10-26

❖ Dimensioni Genoma aploide dei mammiferi 3x109 bp: e’ molto improbabile che un set di primers specifici per una regione, ne trovino un’altra perfettamente identica nel genoma

MIX DI REAZIONE

❖ Buffer Standard: 50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH 8.3) 1.5mM MgCl2.

❖ [MgCl2] e stringenza della reazione❖ [dNTPs] fonte maggiore di gruppi fosfato, effetti

sulla [MgCl2] ❖ [KCl] influenza positiva sulla sopravvivenza

della Taq polimerasi (40’ a 95οC) ma influenza negativa sulla sua PROCESSIVITA’.

PROCESSIVITA’

❖ NUMERO DI NUCLEOTIDI CHE LA POLIMERASI RIESCE AD INCORPORARE IN UNA SOLA VOLTA.

❖ AMPLITAQ POLIMERASI: 70 NUCLEOTIDI

COSOLVENTI

❖ Triton X-100, Gelatina, BSA stabilizzazione dell’enzima

❖ Glicerolo, DMSO, Formamide, aumentano la specificita’ della reazione abbassando la Tm e di denaturazione del DNA: si facilita la denaturazione del templato e si aumenta la specificita’ di annealing dei primers.

PRIMERS

❖ Rapporto tra [primers] e sequenza genomica target 108/1

❖ Eccesso di primers: il templato, una volta denaturato, si ibridera’ con i primerspiuttosto che con se stesso (reannealing)

❖ Se il rapporto primers/templato e’ troppo alto, rischio aspecifici, primer/dimer, concatameri, se il rapporto e’ troppo basso l’efficienza di PCR puo’ essere ridotta

dNTPs

❖ [dNTPs] liberi dipende dal numero di sequenze target generate e dalla loro lunghezza.

❖ Eccesso di dNTPs effetti deleteri sull’efficienza di PCR

CICLI TERMICI

❖ Accuratezza e Riproducibilita’ delle temperature

❖ Alte temperature di annealing e tempi brevi di annealing ed estensione

❖ PCR lunghe (>1Kb) aumento della durata dell’estensione (1’ ogni Kb)

COINVOLTI NELL’AIDS PEDIATRICO

❖ STUDIO DELLE CHEMOCHINE E DEI RECETTORI DELLE CHEMOCHINE (CXCR5, SDF-1, CXCR4 ETC.)

❖ PCR ALLELE-SPECIFICA PER LO STUDIO DI DUE POLIMORFISMI PRESENTI NEL PRIMO ESONE DELLA PROTEINA SERICA LEGANTE IL MANNOSIO (MBP)

OTTIMIZZAZIONE PCR-ALLELE SPECIFICA

❖ DISEGNO DEI PRIMERS ALLELE-SPECIFICI (PRIMER EXPRESS 1.0)

❖ HOT START FONDAMENTALE❖ REGOLA FONDAMENTALE: EVITARE

L’APPAIAMENTO TRA LE BASI G E T(PROBLEMI DI INGOMBRO STERICO)

❖ ADEGUATE CONDIZIONI DI STRINGENZA❖ SCELTA NUMERO CICLI AL FINI DI AVERE

UNA ELEVATA SPECIFICITA’ ANCHE A

Thermostable DNA PolymerasesDomains

Proofreading activity

3’ EXO

5’ EXO Synthetic

DNARNAModified dNTP

CLeavageTaqman

Enzyme Processivity

Number of consecutive nucleotides incorporated bya single average molecule of enzyme

5’-3’ Exonuclease activity

90

Structure dependent endonuclease activity


70



72



A

C

Enzyme capability to correct for misincorporations


A

G

C

Enzyme capability to correct for misincorporations

Enzyme dependent PCR Features❖ Synthetic activityProcessivity :Stutter bands, Maximum Amplicon

lenght Mismatch Extension (SSP)RT-PCR

❖ 3’Exonuclease ActivityFidelityOverall cycle efficiency (eXtra Long PCR)

❖ 5’-3’ exonuclease activitylate cycles product cleavage, smear

Probe cleavage, Taqman Assay

AmpliTaq GOLDFeatures

5’ EXO Synthetic

CLeavageTaqman

DNARNAModified dNTP

❖ Modified version of AmpliTaq DNA Polymerase❖ Same Processivity and Thermostability❖ Polymerization and 5’ Exo activities are thermally

activated❖ Activity release is progressive

Non-Enzyme dependent PCR features

❖ Non specific amplicon generation❖ Specificity❖ Sensitivity❖ yield

Sources of Non-Specificity

PrePre PCRPCR

Primer Dimerpre-PCR mispriming

Primer Dimer Formation

Pre-PCR Mispriming

DS Domain

denatured Domain

Sample DNA

Hot Start PCR

Reagents

Transfer to cycler

Cycle

Tube

4-25ÞC

Conventional PCR

Reagent subset

Heat to 60-70ÞC

Missing Reagent

75-80ÞC

Tube

Manual Hot Start PCR

Transfer to cycler

Cycle

4-25ÞC

AmpliWax

Heat 5-10 min.

to 35ÞC

Tube

Hot Start PCR with AmpliWax ®

PCR Gems

Reagent subset

Missing Reagent

Cycle

Transfer to cycler

75-80ÞC

4-25ÞC

Sources of non specificity

❖ IN PCR

•Poor primer design•Wrong annealing temperature•Non optimal MgCl2 conc•Early cycles generation of non specific products

Early Cycles generation of Non Specific Products

60% Homology 50% Homology 40% Homology 100% homology

Annealed Primer

Free PrimerEven at stringency conditionsPrimers have a probability to annealto non fully complementary regions of DNA

Early Cycles generation of Non Specific Products

Taq concentrationHIGH LOW

AvailabilityAvailability ofof free enzyme molecules isfree enzyme molecules is thethe limiting factor forlimiting factor for thethe extensionextension ofofmismis--annealed primersannealed primers.. Too much free enzymeToo much free enzyme in thein the reaction increasesreaction increases the chance the chance ofof generatinggenerating nonnon specific productsspecific products..

Penalties of Non-SpecificityObscure specific product in agarose gel analysis

High background in quantitative PCR and sequencing of PCR product

Low product yield/sensitivity from depletion of PCRreactants

Apparent lack of intended product

Factors Contributing toPrimer-Dimer formation

❖ Poor Primer Design❖ High Concentration of Primers❖ High Concentration of free Taq❖ low Kinetic Motions (low Temp)

Cap.11 Ottimizzazione Della PCR

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