Valutazione della tossicitàdei farmaci

IT =DL50

ED50

IT maggiore sicurezza

del farmaco

• Definire la minima dose che produce effettitossici e la massima che non induce alcun effetto,diretto od indiretto

• Definire la relazione tra dose terapeutica e dosetossica

• Individuare quale struttura cellulare, organo osistema sia il bersaglio della tossicità

• Definire le caratteristiche dell’effetto tossicodeterminato dalla molecola o dai suoi metaboliti

• Stabilire la reversibilità o meno degli effettitossici osservati

Studi di tossicologia

Sperimentazione preclinica

• FARMACOCINETICA(Assorbimento, distribuzione, metabolismo,escrezione)

• TOSSICITA’ SUBACUTA E CRONICA

• STUDI TOSSICOLOGICI SULLARIPRODUZIONE

Sperimentazione preclinicaPROVE DI TOSSICITA’

Le prove di tossicità per somministrazioni ripetute,subacuta (breve termine) e cronica (lungo termine)devono mettere in evidenza- la soglia di tossicità,- le alterazioni funzionali e/o anatomo-patologicheconseguenti alla somministrazione ripetuta del farmaco- le condizioni della comparsa di alterazioni in funzionedella posologia.

La valutazione degli effetti tossici viene effettuataesaminando mortalità, comportamento, accrescimento,crasi ematica, prove funzionali a carico dei diversi organi(cuore, fegato, rene, milza ecc.), in base ai repertiautoptici e esami istologici.

Studi di tossicità acuta

• Somministrazione unica (acuta) del principioattivo su due o più specie di mammiferi (ratto,topo, coniglio)

• Due diverse vie di somministrazione (nel caso deiroditori), una delle quali identica a quella propostanell’uomo, mentre l’altra deve garantirel’assorbimento sistemico del farmaco

Studi di tossicità acuta• Il periodo di osservazione deve essere adeguato

a mettere in luce i danni ai tessuti e agli organi,oppure il ritorno delle condizioni dell’animale allanorma;durata 14 giorni, mai inferiore a 7 giorni e puòproseguire per tutto il tempo in cui persistono isegni di tossicità

• Le prove devono fornire dati sulla relazionedose/effetto e dose/mortalità;procedere alla valutazione quantitativa della DL50

• Esame anatomo-istopatologico degli organi

Tossicità acuta

• Animali adulti• Entrambi i sessi• Specie animali diverse• Numero minimo 5 animali• Dose pilota• 7 giorni osservazione• Studio autoptico degli animali deceduti

I sintomi più comunemente descritti negliesperimenti di tossicità acuta sono:

-respiratori (dispnea, apnea, cianosi, tachipnea, edemapolmonare)

-cardiovascolari (variazioni della frequenza, extrasistoli,variazioni dell’ECG, ipotensione, ipertensione,vasocostrizione o vasodilatazione cutanea)

-nevrosi (convulsioni, variazioni del tono muscolare,variazioni della motilità, sonno, analgesia, piloerezione,variazioni delle funzioni motorie superiori)

-cutanei (eritema, edema, alterazioni del pelo)

-gastroenterici (vomito, diarrea, emorragie gastro-intestinali)

TOSSICITA’ SUBACUTA

Prove di tossicità subacuta (30 e 90 giorni).

Le sperimentazioni vengono effettuate:• somministrando tre dosi a gruppi diversi di

animali (nel caso dei roditori, 20 animali pergruppo, di cui 10 maschi e 10 femmine

• utilizzando due specie di mammiferi (ratto,cane, maiale) di cui una di roditori

TOSSICITA’ SUBACUTA

Tre livelli di dose:La più elevata deve far comparire effetti

tossici d’organo o mortalità in non piùdel 10% degli animali;

La minore permette di fissare il marginedi tolleranza (effetto farmacologico);

La intermedia è la media fra la dosemaggiore e la minore;

Tossicità subcronica

• Animali adulti• Entrambi i sessi• Specie animali diverse• Numero minimo 10 animali• 3 livelli di dose (dose più alta non deve

dare più del 10% di mortalità)• Conoscere emivita sostanza

(bioaccumulazione)

-Esame delle urine (chetonuria, porfirinuria, emoglobinuria,ematuria, glicosuria, pressione osmotica, cristalli, cellule disfaldamento, pH).

-Chimica clinica (livelli plasmatici di bilirubina, creatina ecreatinina, colinesterasi, acidi grassi, colesterolo, LDLP eHDLP, glicemia, azotemia, elettroliti, acido urico, proteinetotali e frazionate, immunoglobuline, marcatori enzimaticidi funzioni di organo (creatin-fosfochinasi, colinesterasi,lattico deidrogenasi, fosfatasi alcaline ed acide,transaminasi, amilasi).

-Ematologia ematocrito, emoglobina, conte di GR e GB, coneventuale formula leucocitaria, piastrine, misure dicoagulazione.

Controlli tossicità subcronica

Tossicità cronica• Studi di tossicità cronica (3 - 12 mesi)

• Tre livelli di dose:• La maggiore deve dare segni di tossicità• La minore ben tollerata e se possibile, da 2 a

10 volte superiore a quella giornalieraprevista per l’uso terapeutico,

• La intermedia sia la minima dose in grado diindurre il primo chiaro effetto tossico.

Tossicità riproduttiva

• Fertilità

• Morte fetale

• Malformazioni

Esame della funzione riproduttivaDeve mettere in rilievo su due specie animali

(ratti e conigli):

• Modifiche della fertilità o procreazioneanormale dovuta a danni dei gameti maschilie/o femminili

• Interferenza con le fasi di pre-impianto eimpianto del feto e del suo sviluppo

• Effetti tossici sull’embrione

• Effetti tossici sul feto

• Studi di fertilità: (somministrazione durante e dopoaccoppiamento) valutazione nel maschio e nella femmina,della funzione riproduttiva (funzionalità delle gonadi,ciclo estrale, comportamento di accoppiamento, indici difertilità, analisi dei primi stadi della gestazione);

• Studi di teratogenesi: somministrazione alla madredurante il periodo dell’organogenesi per determinareembriotossicità e capacità di indurre malformazionischeletriche, di organi ed apparati;

• Studi di tossicità peri- e post-natale: per valutareeffetti durante ultimo trimestre di gravidanza elattazione. Studio di sviluppo fetale tardivo,allattamento, svezzamento.

FASE I pre-impianto. 14 giorni somministrazione(coprire ovulazione). Morte fetale e aborto.

FASE II organogenesi. Dal 6^ al 15^ giorno dopola fecondazione (topo), dal 6^ al 18^ giorno dopola fecondazione (coniglio). Malformazioni.

FASE III embrionale e neonatale. Ultimo quartodella gravidanza e allattamento. Ritardo crescita,deficits funzionali.

•Pubertà

•Inizia il trattamento che prosegue per 100giorni

•Accoppiamento e produzione della primanidiata (F1)

•Dopo 50 giorni inizia il trattamento degli F1che prosegue per 120 giorni. Si accoppiano gliF1 producendo gli F2

•Svezzamento degli F2, conta, misura delpeso, uccisione, necroscopia e istopatologia

Studi tossicità in F1

PROVEPROVE DIDI MUTAGENESIMUTAGENESI

Test in vitro e in vivo, per valutare:

Induzione mutazioni geniche, danni cromosomicie/o genomici, danni primari al DNA.

Completano studi di cancerogenesi e diteratogenesi.

ICH (Inter. Conf. Harmonisation) fissa i terminidelle prove di mutagenesi, garantendo che ognicomposto sia esaminato in accordo con gli specificirazionali scientifici.

Test di mutagenesiCEE (GU NC 238 del 5 novembre 1984) stabilisce che itest comprendano:

•Un test di mutazione genica sui batteri

•Un test di mutazione genica in un sistema eucariotico inpresenza o meno di induttori del metabolismo

•Un test di aberrazioni cromosomiche in colture di celluledi mammifero

•Un test in vivo di danno genetico (i più convalidati sonoquelli a livello cromosomico, come il Mouse Spot Test)

Studi di cancerogenicità

Registrano incidenza di tumori (tessuti specifici) e/omaligni e periodo di latenza prima della manifestazione.

Due specie animali (preferito ratto)

Somministrazione per la stessa via proposta per l’uomo

Documentazione assorbimento

Somministrazioni giornaliere

Gruppi sperimentali di almeno 100 animali (50 maschi e 50femmine), uno per ogni livello di dose

Almeno tre dosaggi

• dose massima deve esercitare almeno un minimoeffetto tossico oppure una tossicità minima a livello diorgano bersaglio

• dose minima deve essere pari al doppio o al triplo delladose terapeutica massima per l’uomo o della dose cheproduce un effetto farmacologico nell’animale

• dose intermedia è la media geometrica fra la dosemassima e la dose minima

Periodo da 18 mesi (topo, criceto) ai 24 mesi (ratto)

Dosi per studi di cancerogenicità

Obiettivi degli studi di cancerogenicità

Identificare capacità di indurre tumori nell’animale e possibile

rischio per l’uomo

Sono richieste per nuove molecole ma particolarmente, perquelle appartenenti a determinate categorie:•molecole di una classe chimica che ha già dimostrato effetticancerogeni rilevanti anche per l’uomo;

•relazione struttura attività che suggerisce un rischiocancerogeno;

•evidenza di lesioni neoplastiche negli studi di tossicità ripetuta;

•ritenzione a lungo termine della molecola o suoi metaboliti, indeterminati organi;

•evidenze di positività nei test di mutagenesi.

Frequenza nei controlli (%) Frequenza nei trattati (%)

N 60 30 20 10

10 17 65 241 -

5 13 35 76 464

1 10 27 46 114

Dimensioni del campione sperimentale richieste per ottenere differenze significative(P<0.05) nella frequenza di tumori nel gruppo dei trattati rispetto a controlli con variefrequenze di tumori spontanei.

•Prove di pediatria: se si prevede utilizzo in bambini, puòessere necessario eseguire studi in ratti neonati.Normalmente, si preferisce avviare studi pediatrici, solo sein possesso di consistenti risultati nell’adulto e in presenzadei test completi di tossicità della riproduzione, mutagenesie tossicità ripetuta

Studi di tollerabilità locale: sono richiesti prima dellasperimentazione clinica se, la via di somministrazione topica èrilevante per l’impiego nell’uomo o se si ritiene che la viaendovenosa possa determinare lesioni

•Prove di immunogenicità: sono effettuate per valutare lacapacità immunogenica e allergizzante di un farmaco, oltre allasua eventuale interferenza con il sistema immunitario