1

Trasporto degli elettroni e

fosforilazione ossidativa

2

La respirazione cellulare è il meccanismo attraverso cui

la cellula, in presenza di ossigeno, è in grado di ricavare

energia utilizzabile nei processi vitali dai legami chimici

delle molecole assorbite nella digestione.

La respirazione cellulare consta di diverse reazioni, in cui

i prodotti di un passaggio sono utilizzati come reagenti

per il processo successivo.

I prodotti di scarto della respirazione cellulare (come

CO2 o H2O) vengono eliminati dalla cellula e, negli

organismi superiori, escreti attraverso la respirazione

polmonare e le urine.

LA RESPIRAZIONE CELLULARE

Le cellule respirano?

3

Gli organismi aerobici durante il processo di ossidazione dei carburanti metabolici consumano ossigeno e producono biossido di carbonio:

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6 H2O

Glucosio

4

Le 12 coppie di e- rilasciate durante l’ossidazione del glucosio non sono trasferite direttamente all’O2 ma ai coenzimi NAD+ e FAD

tramite i coenzimi, gli e- passano

alla catena di trasporto degli e-

5

Durante il processo di trasporto degli elettroni accadono i eguenti eventi:

1) NADH e FADH2 sono riossidati a NAD+ e FAD

2) il trasferimento degli e- partecipa all’ossidazione-riduzione di 10 centri redox

3) durante il trasferimento degli e-, dal mitocondrio vengono espulsi dei protoni con la generazione di un gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale.

6

7

Struttura di un Struttura di un mitocondriomitocondrio

50% lipidi, 50% proteine80% proteine

8

LA RESPIRAZIONE CELLULARE

Modello di mitocondrio e schema

generale della respirazione

cellulare

La respirazione aerobica ha luogo nella

matrice e nella membrana mitocondriale

interna e questo processo è incrementato

dalla grande superficie offerta dalle creste.

La matrice contiene la maggior parte degli

enzimi coinvolti nell’ossidazione degli acidi

grassi e gli enzimi degli acidi tricarbossilici

(ciclo di Krebs); sono inoltre presenti DNA

mitocondriale ed RNA.

La membrana mitocondriale interna

contiene i citocromi, le molecole di trasporto

della catena di trasporto degli elettroni e gli

enzimi coinvolti nella produzione di ATP.

I mitocondri sono considerati organuli

semiautonomi, perché riescono a

sintetizzare molte delle proteine di cui

necessitano; inoltre, vanno incontro ad

un’autoreplicazione mediante un processo

che è analogo alla divisione dei batteri.

9

10

11

La porina ha una struttura a foflietto β antiparallelo che si arrotola a formare un barile.

Sono proteine che formano canali nella membrana dei batteri gram-negativi

Le porine sono presenti anche negli eucarioti, nella membrana esterna dei mitocondri e dei cloroplasti.

12

13

14

NAD+, NADH, NADP+, NADPH, FAD, FADH2

La membrana mitocondriale interna è priva di una proteina trasportatrice

del NADH

Nel mitocondrio vengono trasportati soltanto gli elettroni del NADH citosolico mediante ingegnosi sistemi “ navetta”

15

Sistemi navetta di substrati:

si servono di isoforme citoplasmatiche e mitocondriali

dello stesso enzima

16

Shuttle malato – aspartato (fegato, muscolo cardiaco)

(e-)

1

mmi

malato deidrogenasi (ciclo di Krebs)

(reaz. di ossidazione)

2

reaz. di transamminazione

GOT mit.

3

GOT cit.reaz. di transamminazione

4malato deidrogenasi (citosolica)

(reaz. di riduzione)

17

Il sistema navetta del

Glicerofosfato del muscolo alare degli insetti

trasferimento di una coppia di e-

isozima

glicerolo 3-P deidrogenasi

FAD dip.

18

Meccanismo conformazionale del traslocatore ADP-ATP o adenina nucleotide traslocasi che trasporta l’ATP fuori dalla matrice scambiandolo con l’ADP (dimero costituito da due subunità identiche di 30 kD)

Il Pi che è necessario anche per la sintesi di ATP nella matrice, viene importato dal citosol mediante un sistema di simporto Pi-H+ .

Il gradiente protonico transmembrana generato dalla catena di trasporto degli elettroni presente sulla membrana mitocondriale interna non fornisce soltanto la forza termodinamica necessaria per la sintesi di ATP ma promuove anche il trasporto dei suoi materiali di partenza , ADP e Pi.

19

I due sistemi di trasporto

mitocondriale per il Ca 2+

I MT funzionano da tamponi per il calcio citosolico.

Importanza della distribuzione intracellulare del calcio:

contrazione muscolare

trasmissione neuronale

secrezione, azione degli ormoni

L’entrata nella matrice è promossa dal potenziale di membrananegativo che attrae gli ioni positivi.

La velocità dipende dalla [Ca++] esterna

Se la [Ca++]cit

antiportocon ioni Na+

= aumenta l’entrata

Se la [Ca++] cit = diminuisce l’entrata

20

Quando la [Ca++] citoplasmatica aumenta per un lavoro muscolare sostenuto

la [Ca++] aumenta anche nella matrice mitoc., attivando gli enzimi del ciclo di Krebs che porta a un aumento dei livelli di NADH, la cui riossidazione tramite il sistema di trasporto degli elettroni genera l’ATP necessario per la contrazione.

21

�I trasportatori degli elettroni che portano gli elettroni dal NADH e dal FADH all’O2 sono associati alla membrana mitocondriale interna.

�Alcuni di questi centri redox sono mobili, altri sono invece componenti di complessi di proteine integrali di membrana.

�La sequenza dei trasportatori degli elettroni riflette grossolanamente i loro potenziali di riduzione relativi, cosicchè il processo di trsporto degli elettroni ècomplessivamente esoergonico.

22

La via più importante per la formazione di ATP, presente sia negli

organismi autotrofi che in quelli eterotrofi, è la fosforilazione ossidativa:

questo processo è fortemente endoergonico (cioè necessita di una grande

quantità di energia, DG > 0)

Il meccanismo più rilevante per la sintesi di ATP da ADP e Pi utilizza

energia derivante da gradienti elettrochimici.

Questa energia viene liberata grazie alla presenza nella cellula

(mitocondrio) di catene trasportatrici di elettroni (processo redox

fortemente esoergonico, DG < 0)

23

��La catena respiratoria libera energia grazie alla differenza traLa catena respiratoria libera energia grazie alla differenza tra

i potenziali di riduzione tra il donatore (NADH + Hi potenziali di riduzione tra il donatore (NADH + H++), complessi ), complessi

della della catena respiratoria catena respiratoria e le l’’accettore (Oaccettore (O22) di elettroni. ) di elettroni.

��Gran parte di questa energia viene impiegata dallGran parte di questa energia viene impiegata dall’’ATP ATP sintasisintasi

per convertire lper convertire l’’ADP in ATPADP in ATP

24

Il flusso di elettroni può produrre un lavoro biologico:

Nel “circuito che potenzia un motore”, la fonte di e- può essere una batteria che contiene due specie chimiche che hanno una diversa affinità per gli e- .

Il flusso elettronico procederà spontaneamente nel circuito

guidato da una forza proporzionale alla differenza tra le due

affinità detta forza elettromotrice (fem).

La fem può generare un lavoro se al circuito viene collegato un

trasduttore energetico.

25

In un analogo “circuito biologico” la fonte di elettroni è un

composto ridotto come per es. il glucosio.

Quando viene ossidato enzimaticamente sono rilasciati e-

che fluiscono spontaneamente attraverso una serie di

trasportatori intermedi fino a raggiungere una specie

chimica con un’elevata affinità per gli e- come l’ossigeno.

La forza motrice che si genera fornisce energia ad una

varietà di trasduttori molecolari (enzimi e proteine) che

compiono un lavoro biologico.

26

LL’’ossidazione biologica completa di sostanze organiche nutrienti cossidazione biologica completa di sostanze organiche nutrienti crea un rea un flusso di elettroni che procede verso lflusso di elettroni che procede verso l’’ossigeno mediante una serie di ossigeno mediante una serie di trasportatori di elettroni intermedi che si comportano come un ptrasportatori di elettroni intermedi che si comportano come un ponte a onte a cestelli:cestelli:

reazione reazione redoxredox esoergonicaesoergonica: gli elettroni passano spontaneamente da un : gli elettroni passano spontaneamente da un trasportatore a bassa affinittrasportatore a bassa affinitàà per gli elettroni ad un altro con affinitper gli elettroni ad un altro con affinitààmaggiore e cosmaggiore e cosìì via. La reazione complessiva via. La reazione complessiva èè: :

sostanza organica + Osostanza organica + O22 �� COCO22 + H+ H22O + energia O + energia

27

Il sistema mitocondriale di trasporto degli eIl sistema mitocondriale di trasporto degli e-- non non èè altro che una sequenza dialtro che una sequenza di

reazioni di ossido riduzionereazioni di ossido riduzione

Durante le reazioni redox, gli elettroni trasferiti possono passDurante le reazioni redox, gli elettroni trasferiti possono passare are direttamente dai donatori agli accettori: direttamente dai donatori agli accettori:

FeFe2+2+ + Cu+ Cu2+2+ �������� FeFe3+3+ + Cu+ Cu++

In alternativa, gli elettroni possono essere trasferiti da un doIn alternativa, gli elettroni possono essere trasferiti da un donatore a un natore a un accettore mediante un trasportatore di elettroni:accettore mediante un trasportatore di elettroni:

XHXH2 2 + Y + Y �� X +Y HX +Y H22

NAD+NAD+ + FADH2+ FADH2NADH + NADH + HH++ + FAD+ FAD

28

Un atomo di idrogeno neutro Un atomo di idrogeno neutro èè in grado di trasferire un singolo in grado di trasferire un singolo elettrone: elettrone:

H H �������� ee-- + H+ H++

Lo ione negativo idruro (HLo ione negativo idruro (H--) ) èè invece in grado di trasferire due invece in grado di trasferire due elettroni: elettroni:

HH-- �������� 2e2e-- + H+ H++

29

Le forme ossidate e ridotte dei composti sono dette coppie redox.

donatore di e- (agente riducente)

accettore di e- (agente ossidante)

La facilità con la quale gli e- passano dal riducente all’ossidante è espressa quantitativamente dal valore del potenziale di ossido-riduzione del sistema.

30

In una coppia redox il riducente con un potenziale di ox-redmolto negativo cede facilmente i suoi e- a coppie con potenziali redox meno negativi o più positivi

Viceversa un forte ossidante (caratterizzato da un potenziale redox molto positivo) mostra una grande affinitàper gli e-.

31

Il potenziale di riduzione standard (EIl potenziale di riduzione standard (E00) ) èè una misura una misura quantitativa dell'affinitquantitativa dell'affinitàà di un accettore per gli elettroni in una di un accettore per gli elettroni in una semisemi--reazione.reazione.

Per convenzione internazionale, alla semiPer convenzione internazionale, alla semi--reazione reazione

HH++ + e+ e-- �������� 1/2H1/2H22

viene assegnato un potenziale di riduzione standard pari a zero,viene assegnato un potenziale di riduzione standard pari a zero,quando la concentrazione di ioni Hquando la concentrazione di ioni H++ èè 1 M e H1 M e H22 èè presente alla presente alla pressione parziale di 101,3 pressione parziale di 101,3 kPakPa. .

Questa semiQuesta semi--reazione viene usata come riferimento per la reazione viene usata come riferimento per la determinazione dei potenziali delle altre semideterminazione dei potenziali delle altre semi--reazioni. reazioni.

32

Il piIl piùù forte agente forte agente ossidante cioossidante cioèè ha elevata ha elevata affinitaffinitàà per gli elettroniper gli elettroni

e-

33

La catena respiratoria comprende 3 complessi proteici inseriti nella

membrana mitocondriale interna (complessi I, III e IV) e molecole di

trasferimento mobili, quali il coenzima Q e il citocromo-c:

• complesso I: NADH deidrogenasi

• complesso III: citocromo-c reduttasi

• complesso IV: citocromo-c ossidasi

Il complesso II è la succinato deidrogenasi, è l’unico enzima presente del

ciclo dell’acido citrico presente nella membrana interna mitocondriale. Il

complesso V, l’ATP sintasi, non partecipa al trasferimento di elettroni

II

34

Tutti i complessi della catena respiratoria sono formati da numeTutti i complessi della catena respiratoria sono formati da numerose rose

subunitsubunitàà polipeptidichepolipeptidiche e contengono una serie di coenzimi e contengono una serie di coenzimi redoxredox

legati alle proteine:legati alle proteine:

•• Flavine: Flavine: FMN e FAD nei complessi I e IIFMN e FAD nei complessi I e II

•• Coenzima QCoenzima Q

•• Centri FerroCentri Ferro--Zolfo: Zolfo: complessi I, II e IIIcomplessi I, II e III

•• Gruppi eme: Gruppi eme: II, III e IVII, III e IV

I trasportatori I trasportatori flaviniciflavinici e il e il CoQCoQ sono sono trasportatori mistitrasportatori misti: trasportano : trasportano elettroni e Helettroni e H++

I centri FerroI centri Ferro--Zolfo e i gruppi eme dei citocromi sono Zolfo e i gruppi eme dei citocromi sono trasportatori trasportatori puripuri: trasportano elettroni: trasportano elettroni

35

Nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+)

e nicotinamide adenina dinucleotide fosfato

(NADP+).

R= H nel NAD+

R= PO3–- nel NADP

36

•• LL’’FMNFMN e il e il FADFAD

subiscono delle reazioni di subiscono delle reazioni di

ossidoossido--riduzione riduzione

reversibili. reversibili.

••LL’’FMN FMN èè saldamente saldamente

legato al complessolegato al complesso--I della I della

catena respiratoria e non si catena respiratoria e non si

comporta come un comporta come un

substrato diffusibile. substrato diffusibile.

••Il Il FADFAD èè tenacemente tenacemente

legato al complesso II, o legato al complesso II, o

succinato deidrogenasi. succinato deidrogenasi.

••Le flavine sono dei Le flavine sono dei

derivati della derivati della vitavinavitavina

riboflavinariboflavina

37

Flavina adenina dinucleotide (FAD)

Costituita da FMN + AMP

38

••Il Il CoQCoQ, a differenza dei , a differenza dei nucleotidi nucleotidi flaviniciflavinici èèdiffusibile e può diffusibile e può spostarsi, durante il spostarsi, durante il trasporto elettronico, tra trasporto elettronico, tra molecole donatrici e molecole donatrici e accettriciaccettrici. .

••Il Il coenzima Qcoenzima Q èè un un benzochinone con una benzochinone con una catena catena isoprenoideisoprenoideinsatura. insatura.

••Un valore numerico Un valore numerico riportato al pedice indica riportato al pedice indica il numero di unitil numero di unitààisoprenoidiisoprenoidi (CoQ6, (CoQ6, CoQ10)CoQ10)

39

Forma ossidata

Forma radicalica

Forma ridotta

Flavin mononucleotide (FMN) ( forma ossidata o chinonica)

FMNH*(forma radicalica o semichinonica) CoenzimaQH*o ubisemichinone

FMNH 2 (forma ridotta o idrochinonica)

(forma radicalica o semichinonica

Coenzima QH2 o ubichinolo(forma ridotta o idrochinonica)

CoenzimaQ (CoQ) o ubichinone(forma ossidata o chinonica)

I tre stati di I tre stati di ossidazione ossidazione delldell’’FMN e del FMN e del CoQCoQ

40

Stati di ossidazione diStati di ossidazione di FlavinFlavin mononuleotidemononuleotide (FMN) e (FMN) e Coenzima Q (Coenzima Q (CoQCoQ) o ) o ubichinoneubichinone

Il Il FMN FMN (a) e il (a) e il coenzimaQcoenzimaQ (b) formano radicali liberi (b) formano radicali liberi semichinonicisemichinonici stabili.stabili.

IL IL FMN FMN e il e il CoQCoQ (che possono trasferire uno o due (che possono trasferire uno o due elettroni per volta) sono quindi il punto di contatto tra elettroni per volta) sono quindi il punto di contatto tra il donatore a due elettroni NADH e i citocromi il donatore a due elettroni NADH e i citocromi accettori ad un solo elettroneaccettori ad un solo elettrone

41

•• I I centri centri FeFe--SS, come i nucleotidi , come i nucleotidi flaviniciflavinici, sono strettamente , sono strettamente legati alle proteine. legati alle proteine.

••Il Il ferroferro èè legato allo legato allo zolfo zolfo elementare e ai gruppi elementare e ai gruppi tiolicitiolici di di cisteine messe a disposizione dalla proteina. cisteine messe a disposizione dalla proteina.

••BenchBenchèè in un centro possano essere presenti vari atomi di in un centro possano essere presenti vari atomi di ferro, i centri ferroferro, i centri ferro--zolfo partecipano a reazioni di zolfo partecipano a reazioni di trasferimento di un solo elettronetrasferimento di un solo elettrone

Esempi di centri ferroEsempi di centri ferro--zolfozolfo

33

42

•• I citocromiI citocromi rappresentano lrappresentano l’’ultima classe di componenti che ultima classe di componenti che partecipano al trasporto degli elettroni.partecipano al trasporto degli elettroni.

••I citocromi sono delle proteine contenenti eme.I citocromi sono delle proteine contenenti eme.

••LL’’emeeme èè la la ferroferro--porfirinaporfirina che si trova nelle che si trova nelle emoglobineemoglobine e nella e nella mioglobinamioglobina. I citocromi del tipo . I citocromi del tipo aa,, bb e e c c sono le principali varianti sono le principali varianti di queste proteine presenti nelle cellule. di queste proteine presenti nelle cellule.

••Ciascun citocromo Ciascun citocromo èè costituito da una catena costituito da una catena polipeptidicapolipeptidica e da un e da un gruppo eme specifico.gruppo eme specifico.

••Il ferro presente nei citocromi, Il ferro presente nei citocromi, ma non quello nellma non quello nell’’emoglobinaemoglobina, , subisce delle ossidosubisce delle ossido--riduzioni fisiologiche passando dallo stato riduzioni fisiologiche passando dallo stato ferroso (2+)ferroso (2+) a quello a quello ferrico (3+) e viceversaferrico (3+) e viceversa

43

Esempi di gruppi emeEsempi di gruppi eme

I gruppi eme sono composti I gruppi eme sono composti tetrapirrolicitetrapirrolici contenenti contenenti

ferroferro

I singoli citocromi differiscono l’uno dall’altro per la natura del nucleo porfirinico

(Fe-protoporfirina IX)

44

��LL’’ossidazione del NADH e del FADHossidazione del NADH e del FADH22 viene compiuta dalla catena di viene compiuta dalla catena di trasporto degli elettroni, un insieme di complessi proteici conttrasporto degli elettroni, un insieme di complessi proteici contenenti centri enenti centri redoxredox caratterizzati da affinitcaratterizzati da affinitàà per gli elettroni progressivamente per gli elettroni progressivamente crescenti. Gli elettroni viaggiano lungo questa catena partendo crescenti. Gli elettroni viaggiano lungo questa catena partendo da potenziali da potenziali di riduzione standard pidi riduzione standard piùù bassi verso potenziali pibassi verso potenziali piùù alti. alti.

��Gli elettroni vengono trasportati dai Complessi I e II al CompleGli elettroni vengono trasportati dai Complessi I e II al Complesso III sso III mediante il mediante il CoQCoQ, e dal complesso III al Complesso IV attraverso la proteina , e dal complesso III al Complesso IV attraverso la proteina periferica di membrana citocromo cperiferica di membrana citocromo c

Sequenza del trasporto degli elettroniSequenza del trasporto degli elettroni

4 H+

Complesso IComplesso II

Succinato deidrogenasi-FAD

FeS, cit b560

45

Il Il complesso Icomplesso I o o NADHNADH--coenzimacoenzima Q Q ossidoreduttasiossidoreduttasi((NADHNADH deidrogenasideidrogenasi))

catalizza lcatalizza l’’ossidazione del NADH da parte del ossidazione del NADH da parte del CoQCoQ. E. E’’ il piil piùù grosso, complesso contenente grosso, complesso contenente 43 catene 43 catene polipeptidichepolipeptidiche. Contiene una molecola di FMN e sei o sette centri ferro. Contiene una molecola di FMN e sei o sette centri ferro--zolfo zolfo che partecipano al trasporto degli elettroni.che partecipano al trasporto degli elettroni.

NADH + NADH + CoQCoQ (ossidato)(ossidato) NADNAD++ + + CoQCoQ (ridotto)(ridotto)

4 H+

Complesso IComplesso II

Succinato deidrogenasi-FAD

FeS, cit b560

(6-7)

37

46

Il NADH può trasferire soltanto due elettroni per volta, mentre i citocromi del Complesso III a cui il CoQ passa i suoi elettroni, sono in grado di accettare solo un elettrone per ogni passaggio.

Il FMN e CoQ che possono trasferire uno o due elettroni per volta, sono quindi il punto di contatto tra il donatore a due elettroni NADH e i citocromi accettori a un solo elettrone.

47

Modello che rappresenta il trasporto dei protoni (batteriodopsina,una proteina integrale di membrana di Halobacterium halabium)

Il complesso I potrebbe esistere in due stadi conformazionali:

ossidato e ridotto.

Nel momento in cui gli elettroni vengono trasportati tra i vari centri redox del Complesso I, quattro protoni vengono trasferiti fuori dalla matrice nello spazio inermembrana .

48

IlIl complesso IIcomplesso II (citocromo c(citocromo c--reduttasi)reduttasi)

catalizza lcatalizza l’’ossidazione del FADHossidazione del FADH22 da parte del da parte del CoQCoQ

FAD + FAD + CoQCoQ (ridotto)(ridotto)FADHFADH22 + + CoQCoQ (ossidato)(ossidato)

4 H+

Complesso IComplesso II

Succinato deidrogenasi-FAD

FeS, cit b560

I suoi centri redox comprendono il FAD legato covalentemente alla succinato deidrogenasi, sul quale passano inizialmente gli elettroni , un centro 4Fe-4S, due centri 2Fe-2S e un citocromo b560 .

49

Quando il succinato è convertito in fumarato nel ciclo del TCA, nella succinico deidrogenasi avviene una concomitante riduzione del FAD legato a FADH2. Questo FADH2 trasferisce i suoi elettroni immediatamente ai centri Fe-S che li passano al UQ.

UQ + 2H+ + 2e = UQH2

50

�L’energia libera per il trasferimento degli elettroni dal succinato al CoQ èinsufficiente per promuovere la sintesi di ATP .

�Il complesso II è però ugualmente importante perché consente ad elettroni con un potenziale relativamente alto di entrare nelle catene di trasporto degli elettroni saltando il Complesso I.

�Il complesso I e II non operano in serie, anche se entrambi trasferiscono elettroni da substrati ridotti, NADH o Succinato al CoQ.

�Il CoQ che diffonde nel doppio strato lipidico tra i complessi respiratori, serve come una sorta di punto di raccolta per gli elettroni.

�Dalla prima tappa dell’ossidazione degli acidi grassi si generano gli elettroni che entrano nella catena di trasporto degli elettroni a livello del CoQ. Il CoQ raccoglie anche gli elettroni provenienti dal FADH2 prodotto dalla navetta del glicerolfosfato.

51

Il Il complesso IIIcomplesso III

catalizza lcatalizza l’’ossidazione del ossidazione del CoQCoQ (ridotto) da parte del citocromo c . La (ridotto) da parte del citocromo c . La UQUQ--citocromocitocromo c riduttasi (c riduttasi (UQUQ--citcit c riduttasi, nome con cui c riduttasi, nome con cui èè noto questo complesso)noto questo complesso)

citocromo c citocromo c (ridotto)(ridotto) + + CoQCoQ (ossidato)(ossidato)CoQ (ridotto) + citocromo c (ossidato)

4 H+

Complesso IComplesso II

Succinato deidrogenasi-FAD

FeS, cit b560

Tale complesso funziona per consentire a una molecola di CoQH2 , un trasportatore a due elettroni , di ridurre due molecole di citocromo c, un trasportatore a un elettrone.

Questo complesso contiene due citocromi b,un citocromo c1 e un centro 2Fe-2S (centro di Rieske) al quale è legata la proteina ferro zolfo detta ISP.

52

�Il Complesso III è un dimero a forma di pera la cui parte più larga è immersa nella matrice mitocondriale.

�La porzione che attraversa la membrana è costituita da 13 eliche transmembranaper ogni monomero la maggior parte delle quali sono inclinate rispetto al piano della membrana.

�Otto di queste eliche appartengono alle subunità del citocromo b che lega i gruppi eme di entrambi i citocromi di tipo b, il citocromo b 562 ( detto anche citocromo H a causa del suo alto potenziale e che si trova vicino allo spazio intermembrana ) e b 566 ( chiamato anche b1 per il basso potenziale e che si trova nella matrice ).

�La proteina ferro-zolfo (ISP) che lega il centro di Rieske, è ancorata nella regione transmembrana mediante due eliche situate alla sua estremità N-terminale e si estende nello spazio intermembrana.

�Il citicromo c1 è ancorato nella regione transmembrana mediante la sua eleica C-terminale relativamente mobile contenente un gruppo eme di tipo c

53

54

Esempi di gruppi emeEsempi di gruppi eme I gruppi eme sono composti I gruppi eme sono composti tetrapirrolicitetrapirrolici contenenti ferrocontenenti ferro

I cit a contengono una catena contengono una catena isoprenoideisoprenoide di di 15 carbonii uniti a un gruppo vinilico modificato 15 carbonii uniti a un gruppo vinilico modificato ed un gruppo formile al posto di uno dei metili. ed un gruppo formile al posto di uno dei metili.

I cit b contengono la contengono la ferroferro--protoporfirinaprotoporfirina IX IX lo stessolo stesso eme che si trova nell’emoglobina e nella mioglobina .

I cit c contengono l’eme c , derivato dalla ferroferro--protoporfirinaprotoporfirina IXIX ma legata covalentemente a residui di cisteina della apoproteina.

55

La membrana mitocondriale interna contiene una grande concentrazione di CoQ e CoQH2

Il ciclo Q inizia quando una molecola di UQH2 diffonde dalla membrana ad un sito catalitico del complesso III il sito QP.

L’ossidazione di QUH2 ha luogo in due fasi:

1. Un primo elettrone proveniente dal UQH2 è trasferito alla proteina di Rieske e successivamente al citc1. Questa reazione rilascia due H+ nel citosol e produce UQ.-, un anione semichinonico del UQ nel sito

QP.

2. Un secondo elettrone è successivamente trasferito a l’eme bL convertendo l’ UQ.- a UQ. L’elettrone

sull’eme bL vicino al lato citosolico della membrana è quindi trasferito ad una molecola di UQ su un

secondo legante chinoni QN convertendo questo UQ a UQ.-. UQ.- rimane saldamente legato al sito QN .

Si completa la prima metà del ciclo del CoQ

56

La seconda metà del ciclo è simile alla prima.

1. Una seconda molecola di UQH2 viene ossidata al sito QP ed en secondo elettrone è trasferito al citc1

2. L‘ altro elettrone passa all’eme bL e successivamente all’eme bH.

3. L’elettrone su bH è trasferito sul anione semichinonico UQ.-, al sito QN .

4. Con l’apporto di due H+ provenienti dalla matrice mitocondriale questa reazione produce UQH2, che viene rilasciato dal sito QN e torna nella membrana completando il ciclo del CoQ

57

L’essenza del ciclo Q è che il CoQH2 subisce una riossidazione che avviene in due cicli, in cui il semichinone, CoQ.-, è un intermedio stabile.

Questo richiede che vi siano per il coenzima Q due siti di legame indipendenti:

1. QP che si lega a CoQH2 ed è localizzato tra il centro di Rieske [2Fe-2S] e il gruppo eme bL in prossimità dello spazio intermembrana.

2. QN che lega sia CoQ.- sia CoQ ed è localizzato vicino al gruppo eme bH in prossimità della matrice.

58

59

Il citocromo c è un trasportatore mobile di elettroni

�Gli elettroni che attraversano il Complesso III sono trasferiti al citocromo C dal cit c1.

�Il citocromo C è il solo citocromo nella catena di trasporto degli elettroni che sia idrosolubile.

�Il citocromo C come l’UQ è un trasportatore mobile , è associato debolmente alla membrana interna mitocondriale ( nello spazio intermembrana dalla parte citosolica della membrana interna) .

�In questa posizione è in grado di acquisire elettroni dall’insieme Fe-S-cit1 del Complesso III e successivamente migrare lungo la superfice della membrana allo stato ridotto, per trasferire gli elettroni alla citocromo c ossidasi , il IV complesso della catena di trasporto degli elettroni.

60

IL CITOCROMO C E’ UN MEDIATORE DELLA APOPTOSImorte cellulare programmata

Reagendo a segnali molecolari nel citosol, nella membrana mitocondriale si aprono i

canali di trasporto che rilasciano il citocromo c.

Il citocromo c a sua volta, attiva le caspasi, una famiglia di proteasi contenenti una

cisteina nel loro sito catalitico.

L’attivazione delle caspasi innesca una serie di reazioni proteolitiche che causano

in ultimo la morte della cellula

61

citocromo c citocromo c (ossidato)ossidato) + H+ H22O O citocromo c citocromo c (ridotto)(ridotto) + + ½½ OO22

Il Il complesso IV (citocromo ccomplesso IV (citocromo c--ossidasi)ossidasi)

catalizza lcatalizza l’’ossidazione del citocromo c ridotto da parte dellossidazione del citocromo c ridotto da parte dell’’OO22, l, l’’accettore accettore terminale degli elettroni nel processo di trasporto degli elettrterminale degli elettroni nel processo di trasporto degli elettronioni

4 H+

Complesso IComplesso II

Succinato deidrogenasi-FAD

FeS, cit b560

citocromo cossidasi

62

Struttura del dimero delle citocromo c ossidasi, l’enzima che catalizza le ossidazioni, con l’acquisto di un elettrone, di quattro molecole consecutive di citocromo c ridotto e la contemporanea riduzione di una molecola di O2 utilizzando quattro elettroni.

Il complesso IV dei mammiferi è un dimero i cui monomeri hanno un peso molecolare di 200 KD e sono costituiti da 13 subunità.

La parte centrale del ComplessoIVè costituita dalle sue tre subunitàI,II,III, più grandi e più idrfobiche, che sono codificate dal DNA mitocondriale, le altre sono codificate dal DNA nucleare e devono essere trasportate dentro il mit.

4 citocromoc (Fe2+) + 4H+ + O2 4 citocromo c(Fe3+) + 2H2O

63

Contiene quattro centri redox: il citocromo a, il citocromo a3, un atomo di rame chiamato CuB e un paio di atomi di rame chiamato centro CuA, Sono anche presenti uno ione Mg2+ e uno ione Zn2+ . Il Fe dell’eme a3 e il CuB formano un unico complesso binucleare

Il complesso IV

64

��Reazione della citocromo c ossidasi e riduzione di O2 ad H2O.Reazione della citocromo c ossidasi e riduzione di O2 ad H2O. Per ridurre una Per ridurre una molecola di O2 a 2 di H2O a livello del complesso binucleare citmolecola di O2 a 2 di H2O a livello del complesso binucleare citocromo a3ocromo a3--CuB CuB èènecessario un totale di 4 elettroni, donati dal citocromo c, e dnecessario un totale di 4 elettroni, donati dal citocromo c, e di 4 protoni che si i 4 protoni che si originano nella matrice mitocondriale.originano nella matrice mitocondriale.

��Oltre ai 4 protoni utilizzati per ridurre lOltre ai 4 protoni utilizzati per ridurre l’’OO2, 4 protoni provenienti dalla matrice , 4 protoni provenienti dalla matrice vengono traslocati nello spazio intermembrana (ogni 2 evengono traslocati nello spazio intermembrana (ogni 2 e-- che attraversano il che attraversano il complesso IV, vengono traslocati 2 protoni).complesso IV, vengono traslocati 2 protoni).

RIASSUMENDO

65

66

Blocca il flusso di H+ attraverso l’ATP

sintasi

Oligomicina

Blocca il flusso elettronico legandosi al

Fe3+ dei citocromi del complesso IV

Monossido di carbonio

Blocca il flusso elettronico legandosi al

Fe3+ dei citocromi del complesso IV

Cianuro

Si lega al complesso III e blocca il

trasferimento dall’ubichinolo ai gruppi

Fe-S

Antimicina A

Si lega al complesso II e blocca il

trasferimento di elettroni dal FADH2

all’ubichinone

Carbossina

Si lega al complesso I e blocca il

trasferimento di elettroni dai gruppi Fe-S

all’ubichinone (Q)

Rotenone

Inibitori della catena respiratoriaInibitori della catena respiratoria

Inibitore Inibitore sito/tipo di azionesito/tipo di azione

e Amital

67

68

Inibitori sitoInibitori sito--specifici del trasporto di elettronispecifici del trasporto di elettroni

69

Il cianuro è un anione che deriva dalla dissociazione dall'acido cianidrico (HCN)

HCN ���� H+ + CN-

Una delle proprietà chimiche del cianuro, utile per capire la sua

tossicità è la capacità di combinazione con i metalli: Fe, Ag, Au

ecc.

Una delle molecole indispensabili per questa funzione è il

citocromo-c ossidasi, (o complesso IV) che è l'ultimo complesso

enzimatico coinvolto nella catena di trasporto degli elettroniche e

possiede al centro della sua complessa struttura un atomo di ferro

(Fe). Quando il cianuro entra nella cellula si lega al ferro e

l'enzima cessa la sua funzione. La conseguenza è che la cellula

cessa di respirare e muore.

Per tale ragione il cianuro è un veleno, per tutti gli esseri viventi,

anche dosi molto piccole.

Zyklon B (o Zyclon B) era il nome commerciale dell'acido

cianidrico, un pesticida utilizzato come agente tossico nelle

camere a gas di alcuni campi di concentramento e sterminio

nazisti.

Cianuro di potassio

Citocromo-c ossidasi

Inibitori della respirazione cellulare: il cianuro

70

I forti bevitori vanno incontro a gravi e spesso letali malattie al fegato.

CH3CH2OH ���� CH3CHO + 2H+

Gli enzimi del fegato ossidano inizialmente l’etanolo ad

acetaldeide eliminando due atomi di idrogeno, come da reazione

schematizzata.

Sebbene gli effetti intossicanti dell’alcol siano dovuti soprattutto

all’acetaldeide, i responsabili dell’insorgenza delle malattie

epatiche sono gli atomi di idrogeno (elettroni e protoni) eliminati

dall’etanolo.

Questi atomi di idrogeno “in più”, trasportati dalle molecole di

NADH, seguono due vie principali nella cellula.

La maggior parte di essi passa direttamente nella catena di

trasporto degli elettroni, così da saturare il processo e rallentare

la normale decomposizione di zuccheri, acidi grassi, amminoacidi,

che invece di essere scissi vengono convertiti in grassi che si

accumulano nel fegato.

Gli altri atomi di idrogeno sono utilizzati nella sintesi degli acidi

grassi a partire dagli zuccheri e dagli amminoacidi.

Modificatori della respirazione cellulare: l’etanolo

71

Il trasporto degli elettroni lungo la catena respiratoria Il trasporto degli elettroni lungo la catena respiratoria determina un determina un passaggio di protonipassaggio di protoni

dalla matrice mitocondriale allo spazio intermembranadalla matrice mitocondriale allo spazio intermembrana

Teoria Teoria ChemiosmoticaChemiosmotica di Peter di Peter MitchellMitchell

LL’’energia liberaenergia libera prodotta durante il trasporto degli elettroni viene conservata pprodotta durante il trasporto degli elettroni viene conservata pompando ompando ioni ioni H+H+ dalla matrice mitocondriale nello spazio intermembrana, per credalla matrice mitocondriale nello spazio intermembrana, per creare attraverso la are attraverso la membrana mitocondriale interna membrana mitocondriale interna un gradiente elettrochimico di un gradiente elettrochimico di H+H+..

Il potenziale elettrochimico di questo gradiente viene sfruttatoIl potenziale elettrochimico di questo gradiente viene sfruttato per per sintetizzare ATP.sintetizzare ATP.

Il trasporto degli elettroni , promuove il trasferimento dei proIl trasporto degli elettroni , promuove il trasferimento dei protoni da parte dei Complessi I, toni da parte dei Complessi I, III, e IV dalla matrice una regione contenente una bassa [III, e IV dalla matrice una regione contenente una bassa [H+H+], attraverso la membrana ], attraverso la membrana mitocondriale interna, allo spazio intermembrana ( che mitocondriale interna, allo spazio intermembrana ( che èè in contatto con il in contatto con il citosolcitosol), ), caratterizzato da uncaratterizzato da un’’alta alta [[H+H+].].

72

73

Nel modello proposto da Mitchell, il pH della matrice si innalza, e la matrice stessa acquista un potenziale elettrico negativo rispetto al citosol come conseguenza dell’uscita dei protoni,

Il pompaggio dei protoni cioè produce un gradiente di pH ed una differenza di potenziale elettrico attraverso la membrana mitocondriale interna, condizioni che contribuiscono entrambe ad attrarre i protoni di nuovo nella matrice del citoplasma.

Il flusso di protoni lungo questo gradiente elettrochimico è un processo favorito energeticamente, e può quindi promuovere la sintesi di ATP.

74

Fosforilazione ossidativa

l’energia libera prodotta durante il trasporto degli e- deve essere

conservata in una forma utilizzabile dall’ATP sintasi.

75

�Il trasporto degli elettroni , promuove il trasferimento dei protoni da parte del complesso I, III, e IV dalla matrice una regione contenente una bassa concent. di H+,

attraverso la membrana mitocondriale interna, caratterizzata da un’alta concent. di H+

�L’energia libera sequestrata dal risultante gradiente elettrochimico (forza motrice protonica ) alimenta la sintesi di ATP.

76

La ATP-sintasi trasportante H+ tra due settori è un complesso

enzimatico che catalizza la seguente reazione:

ADP + fosfato + H+esterno ���� ATP + H2O + H+interno

Quando la reazione è catalizzata verso destra, l'enzima è comunemente

chiamato ATP-sintasi ed è responsabile della sintesi di

adenosintrifosfato (ATP) utilizzando come substrati adenosindifosfato

(ADP) e fosfato inorganico, sfruttando il gradiente protonico generato

dalla catena di trasporto degli elettroni.

Il motore della respirazione cellulare: ATP-sintasi

77

LL’’ATP ATP sintasisintasi ((FF11FFoo--ATPasi)ATPasi), , èè una una

proteina proteina transmembranatransmembrana costituita da picostituita da piùù

subunitsubunitàà con un peso complessivo di 450 con un peso complessivo di 450

KD. KD.

Fo ( lega lFo ( lega l’’antibiotico antibiotico oligomicinaoligomicina B) B) èè

costituita nei mammiferi da 6 copie di una costituita nei mammiferi da 6 copie di una

proteina che attraversa la membrana che proteina che attraversa la membrana che

formano un canale polare per il passaggio formano un canale polare per il passaggio

di Hdi H++..

F1 F1 èè costituita da costituita da subunitsubunitàà αααααααα33ββββββββ33γδεγδεγδεγδεγδεγδεγδεγδε. . . . . . . . Le Le

subunitsubunitàà αααααααα e e ββββββββ sono disposte in modo sono disposte in modo

alternato. alternato.

Lo stelo Lo stelo èè costituito dalla costituito dalla subunitsubunitàà γγγγγγγγ

associato alle associato alle subunitsubunitàà δδδδδδδδ ed ed εεεεεεεε

78

Il meccanismo per la sintesi di ATP può essere suddiviso in tre tappe:

1. Traslocazione di protoni promossa da F0

2. Formazione catalitica del legame fosfoanidrinico dell’ATP promossa da F1

3. Accoppiamento della dissipazione del gradiente protonico con la sintesi di ATP,

che necessitano dell’interazione di F1 con F0

79

1 1 -- L'ADP e il PL'ADP e il Pii si legano debolmente al sito di legame nella conformazione L.si legano debolmente al sito di legame nella conformazione L.

2. Un cambiamento conformazionale promosso dal rilascio di energ2. Un cambiamento conformazionale promosso dal rilascio di energia libera ia libera converte il sito L in sito di legame T (chiamato converte il sito L in sito di legame T (chiamato bbTPTP) che catalizza la formazione ) che catalizza la formazione di ATP. Questa tappa implica anche cambiamenti conformazionali ndi ATP. Questa tappa implica anche cambiamenti conformazionali negli altri egli altri due due protomeriprotomeri, che convertono il sito T a cui , che convertono il sito T a cui èè legato l'ATP in sito aperto (O) legato l'ATP in sito aperto (O) (detto (detto bbEE), ), e che convertono il sito O in sito L.e che convertono il sito O in sito L.

3. L'ATP viene sintetizzato a livello del sito T di una subunit3. L'ATP viene sintetizzato a livello del sito T di una subunitàà mentre si mentre si dissocia dal sito O di un'altra subunitdissocia dal sito O di un'altra subunitàà. L'energia libera fornita dal flusso dei . L'energia libera fornita dal flusso dei protoni facilita principalmente il rilascio dall'enzima dell'ATPprotoni facilita principalmente il rilascio dall'enzima dell'ATP appena appena sintetizzato; ciosintetizzato; cioèè, promuove la transizione T O, distruggendo cos, promuove la transizione T O, distruggendo cosìì le le interazioni ATPinterazioni ATP--enzima che in precedenza avevano promosso la formazione enzima che in precedenza avevano promosso la formazione spontanea di ATP a partire da ADP e Pspontanea di ATP a partire da ADP e Pii, , quando la quando la subunitsubunitàà era nella era nella conformazione T. conformazione T.

Interconversione dei tre stati conformazionali

80

IL RAPPORTO P/O

�E possibile esprimere la quantità di ATP sintetizzato in termini di molecole di substrato ossidate.

�Le ossidazioni di NADH e FADH2 sono associati rispettivamente con la sintesi di 3, 2 molecole di ATP.

�Questa stechiometria chiamata rapporto P/O mette in relazione la quantità di ATP sintetizzata con la quantità di ossigeno che viene ridotto.

81

Disaccoppiamento della fosforilazione ossidativaDisaccoppiamento della fosforilazione ossidativa

La presenza nella membrana interna di un agente che ne aumenta lLa presenza nella membrana interna di un agente che ne aumenta la a permeabilitpermeabilitàà agli ioni Hagli ioni H++ disaccoppia la fosforilazione ossidativa dal trasporto disaccoppia la fosforilazione ossidativa dal trasporto degli elettroni in quanto fornisce una strada per la dissipaziondegli elettroni in quanto fornisce una strada per la dissipazione del gradiente e del gradiente protonico elettrochimico che non necessita della sintesi di ATP.protonico elettrochimico che non necessita della sintesi di ATP. La La dissipazione di un gradiente elettrochimico di Hdissipazione di un gradiente elettrochimico di H++, che viene generato dal , che viene generato dal trasporto degli elettroni ed trasporto degli elettroni ed èè disaccoppiato dalla sintesi di ATP, produce disaccoppiato dalla sintesi di ATP, produce calore .calore .

82

Meccanismo dMeccanismo d’’azione del 2,4azione del 2,4--dinitrofenolodinitrofenolo

Uno ionoforo trasportatore di protoni, come il DNP, disaccoppia la fosforilazione ossidativa dalla catena di trasporto degli elettroni dissipando il gradiente elettrochimico di protoni generato dal trasporto degli elettroni.

83

�Nel tessuto adiposo bruno ( grasso bruno ) il disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa genera calore.

�I mitocondri del grasso bruno contengono un canale per i protoni conosciuto con il nome di proteina disaccoppiante ( UCP, chiamata Termogenina ).

�Il flusso di protoni porta alla dissipazione del gradiente protonico presente attraverso la membrana mitocondriale interna.

�Questo processo consente all’ossidazione del substrato di procedere e di generare calore senza sintesi diATP:

84

Controllo coordinato della glicolisi e del Controllo coordinato della glicolisi e del

ciclo dellciclo dell’’acido citricoacido citrico

Le fonti principali degli elettroni che entrano nella catena di trasporto degli elettroni sono:

Glicolisi

Degradazioni degli ac. grassi

Ciclo dell’ac. citrico

Disegno schematico ,la sfera verde indica attivazione, la sfera rossa indica inibizione

85

Nella riduzione di O2 si cela un pericolo:

-il trasferimento di 4 elettroni dà origine a prodotti innocui

- il trasferimento di un singolo elettrone forma un anione superossido

-il trasferimento di 2 elettroni genera un perossido

O2e- O2

-. e-O2

2-

Specie reattive dell’ossigeno

86

I derivati tossici dell’ossigeno molecolare (ROS) vengono rimossi da enzimi protettivi

O2-.

2 + 2H+ O2 + H2O2

superossidodismutasi

H2O + O2.

22H2

Catalasi

Della superossido dismutasi (SOD) esistono due forma:

La SOD mitocondriale un tetramero contenente Mn

La SOD citosolica un dimero contenente Cu e Zn

2 GSH+H2O2 GSSG+ 2 H2O

glutatione perossidasi

O2

87

Alcune malattie degenerative sono associate a danni ossidativi del mitocondrio:

�Morbo di Parkinson

�La malattia di Alzheimer

�La Corea di Huntington

88

Alcuni individui affetti dalla malattia ereditaria sclerosi laterale amiotrofica (ALS; malattia di Lou Gehrig)

sono caratterizzati da una Cu,Zn-SOD mutata

Negli enzimi la magior parte delle mutazioni porta a una perdita della funzione.

Nella ALS il difetto viene ereditato con un tratto dominante, fattore che è compatibile con l’acquisizione di una attività tossica.

Infatti la SOD si comporta come una perossidasi e si pensa che ossidi i lipidi, causando la degenerazione dei motoneuroni, caratteristica della malattia.

89

Anemia da carenza di Ferro

Fabbisogno di ferro

in un uomo adulto: 1mg/die

in una donna in età fertile: 2mg/die

in una donna in gravidanza: 3mg/die

Il ferro è necessario per il mantenimento di una quantità normale di

1. Hb,

2. di citocromi

3. di centri ferro-zolfo.

90

Miopatie mitocondriali

-il lattato si accumula nel liquido cerebrospinale

-crampi, debolezza muscolare, encefalopatia

trattamento con CoQ10

-Carenza di CoQ10: forma rara che colpisce i bambini.

91

Malattie mitocondriali

-Neuropatia ottica ereditaria di Leber (mutazione del Complesso I)

- Miopatie mitocondriali

-I mitocondri svolgono un ruolo centrale nell’apoptosi

92

CITOCROMO P450

Sono enzimi ossidativi detossificanti

Idrolizzano le molecole idrofobiche in modo da ottenere prodotti solubili

Molti dei substrati sono composti tossici come alcuni idrocarburi aromatici policiclici alcuni dei quali cancerogeni: bifenili policlorurati(PCB)

L’idrossilazione catalizzata dal cit. 450 converte queste molecole in sostanze piùsolubili per la successiva escrezione