Tecniche di patologia

molecolare finalizzate

all'analisi di mutazioni

dei geni predittivi di dei geni predittivi di

risposta alla terapia

oncologica

Carmelo Lupo

Casa di Cura La MaddalenaPalermo

Test molecolari PREDITTIVI di

risposta al farmaco

Finalizzati alla ricerca di fattori molecolari predittivi di risposta a

terapie biologiche mirate in oncologia (Target Therapies)

nell'ambito della Medicina Oncologica Personalizzata.

La positività o la negatività a tali test permette di:La positività o la negatività a tali test permette di:

• valutare l'appropriatezza di terapie biologiche in base alle

caratteristiche di sensibilità o resistenza dei singoli tumori alle

terapie

• evitare terapie inutili e inutili effetti tossici ai pazienti

Tecniche di patologia molecolare

ONCOLOGIAONCOLOGIA

ANATOMIA PATOLOGICAANATOMIA

PATOLOGICAMOLECULAR PATHOLOGYMOLECULAR PATHOLOGY

Predittivo

Same type of cancer

Perchè

Same type of treatment

Perchè

Perchè

BRAF V600E

K-RAS N-RAS

adenocarcinoma del colon

Cetuximab/panitunumab

HER2/neu

20-25% Carcinoma mammella

Trastuzumab

EGFRBRAF V600E

50-60% Melanoma

Vemurafenib

BRAF

1799 T>A

V600E

EGFR

20-25% adk polmone

Erlotinib

Gefitinib

ALK

3-5% adk polmone

Crizotinib

Il carcinoma del colon e del retto

Il pathway RAS-RAF

RAS

BRAF

Funzione biologica

� Crescita Cellulare

� Proliferazione Cellulare

� Differenziazione Cellulare

ERK

MEK

“RAS-RAF signaling” nelle cellule normali

L’attivazione della cascata “RAS-RAF signaling” accade attraverso steps sequenziali:

� Attivazione attraverso fattori di crescita

� Attivazione di RAS

� Attivazione di RAF

� Fosforilazione di MEK

� Fosforilazione di ERK

� Attivazione dei fattori di trascrizione

Risultati

� Proliferazione cellulare

� Sopravvivenza cellulare

Mutazioni di RAS

KRAS

NRAS NRAS

Esone 2 codone 12, 13

Esone 3 codone 59, 61

Esone 4 codone 117, 146

Il carcinoma del polmoneIl carcinoma del polmone

Lung cancer

NSCLC

Nature Medicine 18, 349–351 (2012)

EGFR

Meccanismi di resistenza ai TKI

• Resistenza primaria: – Inserzioni esone 20

– Mutazioni KRAS

• Resistenza acquisita (6-10 mesi dall’inizio della terapia): – T790M nel 50% dei pazienti

– Amplificazione di MET nel 20%

Mutazioni di K-ras

� Mutazioni di K-ras� Presenti nel 15-30% degli adenocarcinomi

� Elevata incidenza nei forti fumatori

Predittivi di scarsa risposta a inibitori TK� Predittivi di scarsa risposta a inibitori TK

� Mutazioni di EGFR e K-ras sembrano essere mutualmente

esclusive

Ahrendt SA et al. Cancer 2001; 92:1525-30.

Kosaka T et al. Cancer Res 2004; 64: 8919-23.

Eberhard DA et al. JCO 2005;23:5900-09.

Inibitori TK di EGFR e stato molecolare

• Stato molecolare

� EGFR TK mutazioni:

� Fortemente predittive di risposta agli inibitori TK

� EGFR amplificazione (FISH):

� Probabilmente predittivoProbabilmente predittivo

� EGFR (IHC):

� Non predittivo

� KRAS mutazioni:

� Altamente predittive di scarsa risposta agli inibitori

Riarrangiamento del gene ALK

In generale• Mutazioni attivanti EGFR

– Non fumatori (50%)

– Donne

– Est Asia (50% vs 10%)

– Adenocarcinoma con pattern lepidico

– Adenocarcinoma papillare

– Adenocarcinoma micropapillare

– Non componente mucinosa– Non componente mucinosa

• ALK– Non fumatori

– Pazienti più giovani

– 2-8% degli adenocarcinomi

– Pattern solido

– Carcinoma con componente a cellule ad anello con castone

• Le mutazioni di EGFR, KRAS, EML4-ALK e BRAF

sembrano essere mutalmente esclusive

• EGFR e KRAS sono attualmente valutati con metodiche

molecolari di sequenziamento o PCR (mutazione specifica)

• EML4-ALK è valutata mediante FISH

• Non esistono test per predirre la risposta a terapie anti-

VEGF

Il melanomaIl melanoma

Mutazione di BRAF

Il DNA estratto per il test, viene estratto da campioni ditessuto di melanoma umano fissati in formalina e inclusiin paraffina.

Detection: rilevare la presenza della mutazione V600E(T1799A).

Con minore frequenza sono state osservate anchemutazioni dei dinucleotidi che interessano il codone 600(V600K, V600R e V600D).

Campioni per diagnosi

• Citologici

• Microistologici• Microistologici

• Resezioni chirurgiche

Fondamentale l'analisi del contesto in cui si operaFondamentale l'analisi del contesto in cui si opera

Requisiti

• Requisiti strutturali

•• Requisiti culturali

• Requisiti comportamentali

Le fasi nella preparazione del tessuto tumorale

Taglio sezioni

2

Scelta della sezione tumorale più

1

Taglio sezioniScelta della sezione tumorale più

rappresentativa del tumore

La dissezione manuale

3

Processo di preparazione dei campioni

• Prelievo bioptico/chirurgico

• Fissazione del tessuto

• Inclusione in paraffina

• Taglio sezioni del tessuto tramite

microtomo

• Colorazione

Contestualizzare

Il ruolo dell’anatomopatologo nel valutare:

�Dimensioni area tumorale (le biopsie hanno frequentemente materiale insufficiente)

�Percentuale di cellule tumorali nell’area/sezione scelta

�Aree di necrosi

�Aree con caratteristiche istologiche diverse (grado, istotipo, infiltrazione)

Fissazione

Gli scopi principali della fissazione sono:

�Preservare la morfologia cellulare e l’architettura tissutale

�Permettere al campione di tollerare gli stress della

processazione

�Mantenere un buon grado di reattività per le colorazioni

tradizionali

�Preservare l’integrità antigenica

�Mantenere le molecole antigeniche nella loro posizione

originale

La formalina

La fissazione con formalina determina legami crociati tra il

liquido fissativo e gruppi attivi delle proteine, conliquido fissativo e gruppi attivi delle proteine, con

mascheramento di molti siti antigenici.

Metodiche mutazionali disponibili

Metodi di screening

Sequenziamento

Pirosequenziamento

HRMA (high resolution melting analysis)

SSCPSSCP

Bersaglio Molecolare

Scorpion Arms

PNA/LNA clamp

SNAPshot PCR

mutant-Enriched PCR

PCR Real-Time

Strip Assays

BioChip film Array

Sequenziamento diretto del DNA

Sequenziamento diretto

• I prodotti di due distinte PCR devono essere sequenziati in

forward e reverse, in modo da ottenere un numero di 3-4

sequenze per campione.

• Il controllo qualitativo viene effettuato mediante

assemblaggio delle sequenze con un software dedicato

all’analisi delle sequenze, lettura dell’elettroferogramma e

confronto con la sequenza wild type.

• I software per l’analisi di sequenza devono essere impostati

con livelli soglia piu bassi di quelli utilizzati per l’analisi dei

polimorfismi nel DNA della linea germinale.

Sequenziamento diretto

• Un campione può essere definito positivo per mutazione se

questa è presente in almeno due diverse sequenze (una

forward ed una reverse) ottenute da PCR indipendenti.

• Nel caso venga evidenziata una nuova mutazione (mai• Nel caso venga evidenziata una nuova mutazione (mai

riportata precedentemente) o una mutazione rara (riportata

1-2 volte nei database internazionali) questa deve essere

verificata in due ulteriori amplificati PCR.

• Ad intervalli di 25-30 sequenze, deve essere sequenziato

un DNA di controllo per verificare l’assenza di

contaminazioni e la qualità della procedura.

Pirosequenziamento

Pyrosequencing

Pirosequenziamento

• Il Pirosequenziamento è una tecnologia di sequenziamento

mediante sintesi. La tecnica consente il monitoraggio in

tempo reale della sintesi di DNA mediante il rilevamento

della bioluminescenza prodotta al termine di una cascata di

reazioni enzimatiche innescata dall’incorporazione di un

nucleotide.nucleotide.

• Vantaggi rispetto al sequenziamento standard: maggiore

sensibilità (riportata tra il 5 ed il 10%) e possibilità di

sequenziare frammenti piuttosto corti di DNA, superando in

tal modo eventuali problematiche legate alla

frammentazione del DNA.

DNA Sample

Preparation KitGenomic

DNA IsolationDNA

Quantification

Macro dissect as

per package insert

(1) H&E Staining

& Tumor Content

Determination

Step

1Step

2

PCR Real Time workflowQuattro fasi di lavoro che possono essere concluse

in <8 ore

Automated /

Standardized

Reporting

Automated

Analysis

cobas® 4800

v2.0

Preparation Kit DNA Isolation Quantificationper package insert

Step

3

Step

4

PCR setup

BRAF V600

PCR Real-Time Sequenziamento DNA

BRAF

1799 T>A

V600E

Quantificazione Acidi Nucleici

I criteri per lavorare in sicurezza

Laboratorio• Accreditato• Superamento controlli di Qualità AIOM SIAPEC/Europei

Campioni• Campione più rappresentativo• Campione più rappresentativo• Definire la % delle cellule tumorali• Procedere alla macrodissezione se necessario

Analisi Molecolare• Scelta della metodologia/tecnologia• SensibilitàReport • Chiaro e completo di informazioni

Conclusioni

Qualità di DNA (poco ma di buona qualità, non grandi quantità di DNA

degradato inutilizzabili)

Ricerchiamo mutazioni somatiche, concetto di “idoneità

tissutale”

Tutte le figure professionali coinvolte nel percorso

diagnostico-terapeutico del paziente, devono lavorare in

sinergia per un corretto management del materiale

biologico

La sommatoria di questi elementi condiziona fortemente la

valutazione dell’analisi mutazionale

“It is not the strongest of the species that

survives, nor the most intelligent, but the

ones most responsive to change”