Separazione cromatografica su colonna di due coloranti I coloranti da separare sono la fluoresceina ed il blu di metilene. Fluoresceina sodica

La fluoresceina sodica (o sale sodico della fluoresceina o uranina) è un indicatore.

Usi della fluoresceina

• Trattandosi di un colorante attivo anche ad elevatissime diluizioni, viene utilizzato in speleologia per individuare rami di corsi d'acqua sotterranei che, scomparendo nel sottosuolo per ricomparire altrove, diventerebbero problematici da seguire.

Per questo tipo di applicazione, una certa quantità di fluoresceina viene disciolta nel corso d'acqua che si addentra nel sottosuolo e, successivamente, si cercano corsi d'acqua che a loro volta sono stati colorati. Il tempo che intercorre fra la dissoluzione e la ricomparsa a distanza può dare indicazioni sulla velocità del flusso.

• L'elevata fluorescenza della fluoresceina, anche in piccole tracce, viene sfruttata per rivelare minime quantità di sostanze (altrimenti incolori) su piastre per cromatografia su strato sottile.

Per questo utilizzo, si impiegano una piastra ricoperta da materiale assorbente (usualmente allumina) impregnato di fluoresceina. Quando la piastra viene utilizzata per una separazione, le tracce delle sostanze separate cromatograficamente ne bloccano la fluorescenza e, in questo modo, la loro presenza viene rivelata da aloni non fluorescenti.

• La fluoresceina viene impiegata come indicatore visuale nelle determinazioni di alogenuri e tiocianati con il metodo di Fajans.

• Rilevazione di macchie latenti di sangue.

A temperatura ambiente si presenta come un solido rosso-bruno inodore, che emette una intensa fluorescenza nella gamma 520-530 nm (di colore giallo-verde, molto caratteristica) quando viene eccitata da raggi ultravioletti a 254 nm e nella gamma del blu (465-490 nm). Blu di metilene, cloruro di 3,7-bis(dimetilammino)fenazationio

Il blu di metilene (BdM) è un composto organico della classe degli eterociclici aromatici. Trova impiego in una vasta gamma di campi differenti.

A temperatura ambiente si presenta come un solido cristallino inodore di colore verde scuro, stabile all'aria e alla luce. Dissolto in soluzione acquosa assume intensa colorazione blu scuro. È un composto nocivo quasi inodore.

In acquacoltura, specialmente negli acquari domestici, è usato per curare i pesci dall'infezione del protozoo parassita Ichthyophthirius multifiliis, noto anche come ictio o ichtyo.

Nell'industria alimentare e tessile è usato come colorante.

Indicatore redox In chimica analitica l'uso più comune del blu di metilene è come indicatore nelle reazioni di ossidoriduzione, dato i suo intenso colore blu in ambiente ossidante che si converte in incolore in ambiente riducente. Cromatografia su colonna per separare una miscela di fluoresceina e blu di metilene

Preparare una colonna cromatografica inserendo un piccolo batuffolo di cotone idrofilo e spingerlo con un’altra pasteur dentro una pipetta di vetro. Il cotone deve essere premuto cautamente verso il fondo della pipetta. Pesare in un beker piccolo circa 1 gr di silice. Diluire nell’eluente 1 la silice. La colonna andrà fissata mediante un morsetto ad un sostegno. Riempire la colonna –pipetta prelevando la sospensione di silice servendosi di un’altra pipetta pasteur.

Aggiungere una certa quantità di gel di silice fino ad arrivare alla tacca superiore. Cercare di impaccare bene la fase stazionaria battendo leggermente la pipetta con una matita.

Condizionare la colonna con l’eluente n° 1 (acqua/1-propanolo/acetone, 1:1:1). La miscela da separare contiene fluoresceina e blu di metilene in etanolo (1 mg di ogni colorante per mL di etanolo).

Aggiungere due gocce della miscela alla testa della colonna, facendo attenzione a depositarle immediatamente sopra lo strato del gel.

Riempire la colonna fino alla sommità con l’eluente n° 1 e cominciare a raccogliere frazioni di circa 1 mL.

Il livello del solvente deve essere sempre mantenuto sopra quello della fase staz ionaria, quindi bisogna continuamente rabboccarlo. I componenti della miscela si separeranno molto rapidamente. La prima sostanza ad essere eluita sarà la fluoresceina. Una volta eluita completamente sarà necessario cambiare eluente. Per cambiare eluente la frazione deve arrivare sino al bordo. Preparare l’eluente n° 2 (2-propanolo/acetone/acido acetico, 1:1:1) e caricare con esso la testa della colonna. Anche il blu di metilene comincerà a percolare attraverso la fase stazionaria. Al termine della separazione con colonna, sviluppare le varie frazioni su TLC per vedere se la separazione della miscela è stata efficace. Utilizzare delle lastrine di gel di silice ed un eluente costituito da 2-propanolo/acido acetico (15:2 v/v). Seminare anche i composti puri da utilizzare come riferimento per il calcolo dell’Rf. Gli eluenti vi saranno forniti già pronti. Le frazioni raccolte saranno poi analizzati per TLC, per vedere come le sostanze separate presentano mobilità diverse su lastrina. Anche gli eluenti per la TLC vi saranno forniti già pronti.