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Analisi cromatografica

su strato sottile

di coloranti alimentari

A cura di Federico Rusconi, dottorando dell'Università dell'Insubria

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Cromatografia su strato sottile

Thin Layer Chromatography

T.L.C.

• “Lastrina”: supporto di vetro omogeneamente rivestito

di materiale adsorbente (silice)

• Camera di sviluppo

• Eluente opportunamente scelto

• Capillari per la deposizione delle soluzioni

• Campione da analizzare – Standards di riferimento

Materiale richiesto – Terminologia :

Tecnica analitica (qualitativa) :

Scopo : Individuare i coloranti impiegati in un determinaro alimento.

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Decreto Ministeriale del 31 marzo 1965 sulla "Disciplina degli additivi chimici consentiti nella preparazione e per la conservazione delle sostanze alimentari", articolo 3:

"Sono considerati additivi chimici quelle sostanze, prive di potere nutritivo o impiegate a scopo non nutritivo, che si aggiungono in qualsiasi fase di lavorazione alla massa o alla superficie degli alimenti per conservare nel tempo le caratteristiche chimiche, fisiche o fisico-chimiche, per evitare l'alterazione spontanea o per impartire ad essi, oppure per esaltarne favorevolmente, particolari caratteristiche di aspetto, di sapore, di odore o di consistenza". 

Coloranti

ConservantiAntiossidantiEmulsionantiAddensanti

Agenti gelificantiStabilizzanti

Esaltatori di sapiditàAcidi

Regolatori di aciditàAmidi modificati

Edulcoranti…

I coloranti sono sostanze che conferiscono un colore ad

un alimento o che ne restituiscono la colorazione originaria, ed includono

componenti naturali dei prodotti alimentari e altri elementi di origine naturale, normalmente non consumati come alimenti né usati come ingredienti

tipici degli alimenti.

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Coloranti Alimentari ( prima cifra della sigla: 1) :

 I coloranti gialli e arancione: E100 - E111

I coloranti rossi: E120 - E129                                I coloranti blu: E130 - E133

I coloranti verdi: E140 - E142

Esempi di strutture molecolari:★

E131 : Blue Patent V

E102 : Tartrazina

★

sono polveri colorate,tipicamente solubili in acqua.

E132 : Indigotina

4,5-dihydro-5-oxo-1-(4-sulfophenyl)-4-[(4-sulfophenyl)azo]-1H-Pyrazole-3-carboxylic acid, trisodium salt

Ethanaminium, N-[4-[[4-(diethylamino)phenyl](2,4-disulfophenyl)methylene]-2,5-cyclohexadien-1-ylidene]-N-ethyl-, inner salt, sodium salt

2,2'-Bi(2,3-dihydro-3-oxoindolylidene)-5,5'-disulfonic acid disodium salt

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Cos’è la Cromatografia ?

Grazie alle sue notevoli potenzialità trova applicazione in tutte le branchedella scienza. In molti casi, i prodotti organici che si formano in una reazione chimica –oppure che sono presenti in una matrice naturale-non possono essere separati o purificati tramite

• estrazione con solvente• ricristallizzazione• distillazione

perché le proprietà chimico-fisiche dei componeti sono troppo simili tra loro,e le differenze non sono apprezzabili e tali da consentire la separazione.

E’ la tecnica più diffusa ed efficiente per la separazione analitica

di diversi componenti di una miscela.

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Come e quando fu scoperta ?

Nel 1906 il biochimico Mikhail Tswett adottò questa tecnica per separare i vari pigmenti di un estratto vegetale.

CROMATOGRAFIA = +κρόμα γράφειν“colore” “scrivere”

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La cromatografia può essere definita come la separazione di una miscela in varie frazioni per distribuzione dei componenti tra due FASI tra loro immiscibili :

FASE STAZIONARIA (immobile)

FASE MOBILE

► A seconda del tipo di fase mobile e fase stazionaria, è possibile classificare:

► Inoltre, a seconda della modalità fisica mediante la quale è assicurato il contatto tra la fase mobile e quella stazionaria, si hanno:

Cromatografia su colonna

Cromatografia planare

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La tecnica sperimentale prevede la dissoluzione della miscela campione in una fase mobile (liquida o gassosa).

La fase mobile viene fatta passare attraverso una fase stazionaria

(generalmente un solido o un gel) posto in una colonna

o su una superficie solida

La miscela da separare è “trascinata” dalla fase mobile in modo dinamico: il componente della miscela cheinteragisce di più con la fase stazionaria è quello che viene RITARDATO di più, e viceversa. Ovvero la separazione è possibile nel momento in cui i diversi componenti tendono a ripartirsi in modo diverso fra le due fasi, in funzione del loro grado di affinità con ciascuna di esse!

FASE STAZIONARIA

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tempo tempo

L’importanza della TLC è dovuta a :• basso costo• velocità con cui è possibile eseguire separazione cromatografica• possibilità di scegliere un opportuno solvente (eluente) che poi verrà utilizzato per la colonna cromatografia su colonna, dunque su più larga scala

TLCTLC : cromatografia planare : cromatografia planare

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Come si esegue una TLC

Tracciare la linea di partenza (linea di deposizione) con una matita

Per mezzo di un capillare deporre alcune gocce delle soluzioni delle diverse sostanze

Si pone la lastrina nella camera di eluizione contenente la miscela eluente opportuna

Si nota che il solvente sale per capillarità lungo la fase stazionaria

Quando il solvente ha raggiunto i bordo superiore della lastrina, la si estrae e si segna a matita il “fronte del solvente”

Si analizza la lastrina con un opportuno metodo:• analisi visiva• esame della lastrina sotto lampada UV• lastrina immersa in reattivi tali da colorare le macchie -e non la fase stazionaria- (H2SO4, vapori di iodio, ninidrina, …)

Valutazione degli Rf

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Cos’è il fattore di ritenzione Rf

Per ogni composto:

Rf =distanza percorsa dalla sostanza

distanza percorsa dal solvente

Il valore di Rf di un composto è una costante fisica, per quelle determinate condizioni cromatografiche di eluente e fase stazionaria, e può servire a caratterizzare quel composto.

dist

anza

per

cors

a da

ll so

lven

te

A

B

Rf (B) = d solv

d (B)

Rf (A) = d solv

d (A) d (B

)

d (A

)

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Procedura sperimentale

La fase di estrazione è così eseguita:Si lavano 5-6 caramelle di colore verde in circa 4ml di H2O a temperatura ambiente. La sospensione verde presenta una parte solida derivante dall’agente di rivestimento (cera di carnauba) : esso vieneallontanato tramite filtrazione. Eventualmente la soluzione ottenuta è concentrata per evaporazione.

Di ciascuno dei quattro coloranti puri ( E102, E104, E131, E132) a disposizione, si prepara la rispettiva soluzione acquosa; si ottengono così le quattro soluzioni di riferimento.

L’eluente è costituito da una miscela di solventi, ed è così preparato:

25ml di n-butanolo 25ml di etanolo 12,5ml di H2O 5ml di NH3 al 25% Sulla lastrina vengono depositati i quattro standard di riferimento, e la soluzione campione.