Un modo alternativo per valutare la concentrazione di DNA è misurare l'intensità di fluorescenza emessa utilizzandocoloranti che si legano agli acidi nucleici (ad esempio bromuro di etidio).

Quantificazione di acidi nucleici mediante coloranti fluorescenti

L’elettroforesi su gel di Agarosio è un metodo di elettroforesi molto utilizzato in biochimica, biologia molecolare e chimicaclinica per separare DNA, RNA (o proteine) in una matrice di agarosio. Il DNA o frammenti di DNA e l’RNA sono separatiapplicando un campo elettrico per far migrare in base alle loro dimensioni dell molecole cariche attraverso una matrice diagarosio.

β-(1-4)-(3,6)-anhydro-L-galactose

α-(1-3)-D-galactose

Quantificazione di acidi nucleici usando l’elettroforesi in gel di Agarosio

Proprietà del gel di Agarosio. Il gel di Agarosio è una matrice tridimensionale formata da molecole di agarosioelicoidali strutturate in fasci superavvolti, raggruppati in strutture tridimensionali formanti canali e pori attraverso iquali possono passare delle biomolecole. La struttura 3-D è tenuta insieme da legami idrogeno e può quindi essereinterrotta mediante riscaldamento del gel, ri-portandolo allo stato liquido. La temperatura di fusione è diversa dallatemperatura di gelificazione, a seconda delle fonti, il gel di agarosio ha una temperatura di gelificazione di 35-42 °C e unatemperatura di fusione di 85-95 °C. Sono inoltre commercialmente disponibili agar con basso punto di fusione e bassaproprietà gelificante, ottenute tramite modificazioni chimiche.

Quantificazione di acidi nucleici usando l’elettroforesi in gel di Agarosio

I gel di agarosio sono facili da allestire e sono particolarmente adatti per la separazione di DNA di varie dimensioni e spesso utilizzati neilaboratori.Il DNA separato può essere visualizzato come una banda, più frequentemente illuminandolo con una luce UV, ed i frammenti di DNA possonoessere estratti facilmente dal gel. La maggior parte dei gel di agarosio sono usati a concentrazioni tra 0.7-2% e sciolti in un opportunotampone di elettroforesi.

Il polimero di agarosio contiene gruppi carichi, in particolare piruvato e solfato. Durante la corsa elettroforetica si può assistereall'insorgenza di un fenomeno è la conseguenza di una differenza di carica tra le molecole di acqua del tampone e la superficie del gel. Ciògenera una forza motrice che provoca il movimento verso il catodo degli ioni del tampone che, per un effetto di trascinamento del solvente,portano con se anche molecole prive di carica. Questo fenomeno accelera il movimento dei cationi e ritarda quello degli anioni essendocontrario alla loro migrazione. L'effetto elettro-endosmotico (EEO), può essere vantaggioso o dannoso. E‘ vantaggioso nell'elettroforesicapillare, mentre è dannoso nell'isoelettrofocusing. L’elettroendoosmosi può quindi ritardare il movimento di DNA e causare sfocatura dibande. Una maggiore concentrazione di gel avrebbe un più alto flusso elettro-endosmotico. Un basso EEO è quindi generalmente preferito perelettroforesi di acidi nucleici, ma agarosio ad alta EEO può essere utilizzato per scopi specifici. Un agaroso con minore contenuto in solfati, conun punto di fusione particolarmente basso (LMP), è anche utile nei casi in cui il DNA estratto dal gel deve essere utilizzato per ulteriorimanipolazioni dove la presenza di solfati contaminanti possono influenzare alcune procedure, come reazioni di ligasi o di PCR.

Quantificazione di acidi nucleici usando l’elettroforesi in gel di Agarosio

L’Agarasi: un enzima usato per digerire frammenti di DNA “ritagliati” (excisi) da gel d’agarosio

Il gel di agarosio per le dimensioni dei pori e buona resistenza risulta particolarmente adatto per l'elettroforesi sia di DNA, chedi molecole proteiche. La dimensione dei pori di un gel di agarosio all’1% è stato stimato da 100 nm a 200-500 nm.

Gel a bassa concentrazione (0.1 - 0.2%) sono fragili e quindi più difficili da maneggiare.

Il gel di agarosio ha un potere di risoluzione inferiore rispetto gel di poliacrilammide per il DNA, ma presenta una gamma piùampia di separazione, ed è quindi usato per frammenti di DNA di dimensioni che possono variare da 50-20.000 bp. Illimite superiore di risoluzione è di circa 750 kb, ma la risoluzione di oltre 6 Mb è possibile usando pulsed field gelelectrophoresis (PFGE).

Quantificazione di acidi nucleici usando l’elettroforesi in gel di Agarosio

Fattori che possono influenzare la migrazione degli acidi nucleici:

la dimensione dei pori del gel (concentrazione di gel = % diagarosio)

dimensioni del DNA da analizzare per elettroforesi

la tensione utilizzata (Voltaggio)

la forza ionica del tampone

la concentrazione di colorante intercalante (ad esempio bromuro dietidio, se utilizzato durante l'elettroforesi)

Migrazione di acidi nucleici in gel di Agarosio

Preparazione del gelLa concentrazione di gel influisce sulla risoluzione e la separazione del DNA. Per una elettroforesi su gel di agarosio standard, unaconcentrazione dello 0,8% dà una buona separazione e risoluzione di grandi frammenti di DNA 5-10 kb, mentre il 2% dà una buonarisoluzione per i piccoli frammenti 0.2-1 kb. 1% gel è usato spesso per un elettroforesi standard. La concentrazione del gel è misuratacome percentuale % (in peso di agarosio su volume di tampone utilizzato g/100 ml). Alte percentuali di Agarosio produce gel rigidi espesso l’Agarosio non si scioglie in modo uniforme, al contrario i gel con basse percentuali (0,1-0,2%) sono molto molli e non facili damaneggiare.

Il gel viene preparato sciogliendo la polvere di agarosio in un tampone appropriato, ad esempio Tris/acetato/EDTA (TAE) e Tris/borato/EDTA(TBE), da utilizzare per l’elettroforesi. I tamponi utilizzati contengono EDTA per inattivare molte nucleasi che richiedono cationi bivalenti per laloro funzione. L'agarosio viene sciolto nel buffer prima di riscaldarlo fino al punto vicino al punto di ebollizione, ma evitando di farlo bollire.L'agarosio fuso viene lasciato raffreddare prima di versarlo in un cast per non deformare o rompere il cast, qualora la soluzione di agarosiofosse troppo calda. Un pettine è posto nel gel per creare pozzetti («spazi vuolti») per il caricamento del campione. l gel deve esserecompletamente solidificato prima dell'utilizzo.

Tamponi (buffers)In generale, il buffer ideale dovrebbe avere una buona conducibilità e produrre poco calore, non surriscaldarsi troppo. Oltre ai buffers di TAEo TBE, sono stati proposti molti altri tipi di buffer, ad esempio litio borato (LB), poco utilizzato, ecc.; nella maggior parte dei casi ilpresupposto logico è applicare una più bassa corrente (=meno calore) e/o mobilità di ioni abbinati, che consente anche una «vita» più lungadel buffer. Il TAE ha la capacità di tamponamento più basso ma fornisce la migliore risoluzione per il DNA più grandi dimensioni. Ciòsignifica una tensione inferiore e un maggiore tempo di migrazione, ma un prodotto migliore. Il tampone borato TBE potrebbe dare piùproblemi nella polimerizzazione, e/o interagire con l’RNA. Un tampone Tris-fosfato ha elevata capacità tamponante, ma non può essere usatose il DNA estratto dalla banda del gel deve successivamente essere utilizzato in reazioni sensibili al fosfato LB è relativamente nuovo ed èinefficace nel risolvere i frammenti più grandi di 5 kb; tuttavia, per la sua bassa conduttività, potrebbe essere utilizzata una tensione molto piùalta (fino a 35 V / cm), che significa un tempo di analisi più breve per elettroforesi di routine.

Elettroforesi di acidi nucleici in gel di Agarosio

Elettroforesi di acidi nucleici in gel di Agarosio

Analisi di acidi nucleici usando elettroforesi in gel di Agarosio

Caricamento di campioniUna volta che il gel è solidificato, il pettine viene rimosso,lasciando pozzetti (buchi) vuoti in cui i campioni di DNApossono essere caricati.

Il buffer di caricamento contiene anche un composto denso,come il glicerolo (maggiore gravità del glicerolo in soluzioniacquose), saccarosio, o Ficoll, che aumentano la densità delcampione, in modo che il campione di DNA può depositarsi sulfondo del pozzetto. Se il campione di DNA contiene etanoloresiduo dall’estrazione, ne può causare la fuoriuscita dalpozzetto per galleggiamento.

Poiché il DNA non è visibile alla luce naturale, l'avanzamentodella elettroforesi del campione è controllata mediantel’addizione di coloranti, come Xilene cianolo, Cresol Red,Orange G, e il blu di bromofenolo utilizzato per monitorarel'andamento della elettroforesi. Xilene cianolo (colore azzurro)co-migra con grandi frammenti di DNA, mentre il blu dibromofenolo (blu scuro) co-migra con i frammenti più piccoli.Meno usati includono Cresol Rosso e Orange G.

I campioni di DNA vengono caricati con una pipetta.

ElettroforesiL’elettroforesi su gel di Agarosio è comunemente eseguitaorizzontalmente in immersione nel tampone. E‘ anchepossibile, ma meno comuni, eseguire l'elettroforesi verticale,utilizzando una apparecchiatura appropriata. Il buffer usatoper diluire l’Agarosio che costituisce il gel deve esserelo stesso del tampone di corsa nel serbatoio elettroforesi.

Per una risoluzione ottimale di DNA di dimensioni maggioridi 2 kb in elettroforesi su gel di norma è da 5 a 8 V/distanzain cm tra gli elettrodi. La tensione (Voltaggio) può esserelimitata dal fatto che riscalda il gel e può causarne lafusione, se viene la migrazione viene eseguita ad altatensione per un periodo prolungato, soprattutto se il gelutilizzato è gel di agarosio LMP. Una tensione troppoelevata può anche ridurre la risoluzione, oltre a causarestriature nella banda quando si analizzano grandi molecoledi DNA (DNA genomico). Un voltaggio troppo basso puòportare ad allargamento (diffusione) della banda quando sianalizzano piccoli frammenti di DNA.

Elettroforesi di acidi nucleici in gel di Agarosio

La velocità di migrazione del DNA è proporzionale allatensione applicata: maggiore è la tensione, più velocementeil DNA si muove. La risoluzione di grandi frammenti di DNA ècomunque inferiore se si applica alta tensione.

La mobilità del DNA può anche cambiare in un campoinstabile, in un campo che è periodicamente invertito (PFGE),causando field inversion gel electrophoresis (FIGE), per cuigrandi frammenti di DNA si muovono più velocemente diquelli piccoli.

Anomalie nella migrazioneUn sovraccarico (troppo concentrato) di DNA rallenta lamigrazione di frammenti di DNA, ridurrà la migrazioneelettroforetica DNA in modo dose-dipendente producendosbavature.Gel "smiley»: questo effetto distorto è causato quando latensione applicata è troppo alta rispetto alla concentrazione di gelutilizzato.Contaminazione - presenza di impurità, come sali o proteine puòinfluenzare il movimento del DNA.

A

Elettroforesi di acidi nucleici in gel di Agarosio

La colorazione e la visualizzazioneDNA e RNA sono normalmente visualizzati mediante colorazione con bromuro di etidio, che si intercala nel solco maggiore del DNA ed èfluorescente quando sottoposto a luce UV. Il bromuro di etidio può essere aggiunto alla soluzione di agarosio prima della sua gelificazione, oil gel DNA può essere colorato più tardi dopo elettroforesi. SYBR Green, GelRed e altri prodotti commerciali simili sono venduti comealternative meno pericolose rispetto all’etidio bromuro, che è stato dimostrato essere mutageno nei test di Ames, anche se non è stataeffettivamente stabilita la sua cancerogenicità. Il SYBR Green richiede l'uso di un transilluminatore luce blu, ma il DNA colorato con crystalviolet può essere visualizzato con luce naturale, senza l'uso di un transilluminatore UV, ciò costituisce un vantaggio, ma tuttavia non puòprodurre una banda intensa.

ethidium bromide Syber Green

Analisi di acidi nucleici usando coloranti fluorescenti

La colorazione e la visualizzazioneQuando colorato con bromuro di etidio, il gel viene visto con un (UV) transilluminatore a luce ultravioletta. I transilluminatori standardutilizzano lunghezze d'onda di 302/312-nm (UV-B), tuttavia l'esposizione del DNA alle radiazioni UV per un minimo di 45 secondi è in grado diprodurre danni al DNA e influenzare le procedure successive, ad esempio riducendo l'efficienza di reazione come la trasfezione, latrascrizione in vitro e PCR. L'esposizione del DNA a radiazioni UV, pertanto deve essere limitata. Usando una lunghezza d'ondamaggiore, di 365 nm (UV-A) si provocano meno danni al DNA, ma produce una fluorescenza molto più debole.

L'apparato transilluminatore può anche contenere dispositivi di cattura delle immagini, come ad esempio una fotocamera digitale o polaroid,che permettono di avere un’immagine del gel e/o stamparla.

Analisi di acidi nucleici usando coloranti fluorescenti

Ethidium Bromide

Quantificazione di DNA usando gel di Agarosio

Un marcatore DNA è caricato vicino ai campioni nel gel per misurarela lunghezza kb (lunghezza) e ngr (peso) dei frammenti di DNA

Le molecole di DNA più piccole molecole viaggiano più velocemente rispetto a molecole più grandi in gel, e si muovono ad un tasso che èinversamente proporzionale al log10 del numero di paia di basi (bp). Molecole più grandi vengono risolte meglio utilizzando gel a bassaconcentrazione, mentre le molecole più piccole sono separate meglio in gel ad alta concentrazione.

Quantificazione di DNA usando gel di Agarosio

Kb

e ng

rQuantificazione di DNA usando gel di Agarosio

La concentrazione può essere determinata quandol’elettroforesi su gel è completata, confrontandol'intensità del campione di DNA con quella di unostandard di quantificazione.

Ad esempio, se 2 μl di un campione di DNA diluitocaricato sul gel (PCR) ha la stessa intensitàapprossimata dello standard 100 ng, quindi laconcentrazione della soluzione è 50 ng/µl (100 ngdiviso per 2 μl.

Gli Standard usati per la quantificazione devonoessere costituiti da bande di cui una avente lastessa dimensione del campione di DNAanalizzato e intensità simile. Per visualizzare ilDNA nel gel, si usa una colorazione con uncolorante intercalante come il bromuro di etidio oSYBR® Verde.

Quantificazione di DNA usando gel di AgarosioCaricati 100 ng di DNA standard

Il movimento del DNA può essere influenzato dalla conformazione dellamolecola di DNA, per esempio, DNA superavvolto di solito si muove piùvelocemente di DNA «rilassata», perché è strettamente avvolto e quindi piùcompatto. In una normale preparazione di DNA plasmidico, possono esserepresenti molteplici forme di DNA.L’elettroforesi su gel dei plasmidi normalmente mostra la forma«superavvolta» come la banda principale, mentre le altre forme di DNAforma circolare aperta («lineare») e la forma circolare chiuso («rilassata»)appaiono come bande minori. La velocità con cui le varie forme si muovonotuttavia può cambiare usando differenti condizioni di elettroforesi, e lamobilità del DNA circolare può essere maggiormente influenzata rispetto alDNA lineare dalle dimensione dei pori del gel.

L’etidio bromuro che si intercala nel DNA circolare può cambiare la carica,la lunghezza, così come la superhelicity della molecola di DNA, quindi lasua presenza nel gel durante l'elettroforesi ne può influenzare il movimento.

L’ elettroforesi in gel di Agarosio può essere utilizzata per analizzare il DNAcircolare con diversa tipologia di avvolgimento.

* Nota: la dimensione di un DNA circolare plasmidico non può essereaccuratamente quantificata utilizzando marcatori standard, se non è statoprima linearizzato con digestrione usando enzimi di restrizione.

Applicazioni: analisi di DNA plasmidico

Applicazioni

Separazione di frammenti di DNA per l'estrazione epurificazione

L'analisi dei prodotti di PCR (in diagnosi geneticamolecolare o fingerprinting genetico)

Stima della dimensione delle molecole di DNA tagliati conenzimi di restrizione (presenti nella mappatura direstrizione del vettore di clonaggio del DNA)

Southern blotting o Northern blotting (trasferimento diRNA)

Nucleic acid analized by Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)

Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), describes a technique widely used in biochemistry, forensics, genetics, molecular biology andbiotechnology to separate biological macromolecules, usually proteins or nucleic acids, according to their electrophoretic mobility. Mobility is afunction of the length, conformation and charge of the molecule.

As with all forms of gel electrophoresis, molecules may be run in their native state, preserving the molecules' higher-order structure, or achemical denaturant may be added to remove this structure and turn the molecule into an unstructured linear chain whose mobility dependsonly on its length and mass-to-charge ratio. For nucleic acids (small fragments of dsDNA and oligonucleotides), urea is the mostcommonly used denaturant (for ssDNA analysis). For proteins, sodium dodecyl sulfate (SDS) is an anionic detergent applied to proteinsample to linearize proteins and to impart a negative charge to linearized proteins, this procedure is called SDS-PAGE.

Polyacrylamide matrix

Preparing Polyacrylamide gels

The gels typically consist of acrylamide, bisacrylamide, (named native gel) the optional denaturant (SDS or urea), and a buffer with anadjusted pH. The solution may be degassed under a vacuum to prevent the formation of air bubbles during polymerization. Alternatively,butanol may be added to the resolving gel (for proteins) after it is poured, as butanol removes bubbles and makes the surface smooth. Asource of free radicals Ammonium persulfate and a stabilizer, such as tetramethylethyldiamine (TEMED), are added to initiatepolymerization. The polymerization reaction creates a gel because of the added bisacrylamide, which can form cross-links between twoacrylamide molecules. The ratio of bisacrylamide to acrylamide can be varied for special purposes, but is generally about 1 part in35. The acrylamide concentration of the gel can also be varied, generally in the range from 5% to 25%. Lower percentage gels arebetter for resolving very high molecular weight molecules, while much higher percentages are needed to resolve smaller proteins. Gels areusually polymerized between two glass plates in a gel caster, with a comb inserted at the top to create the sample wells. After the gel ispolymerized the comb can be removed and the gel is ready for electrophoresis.

Nucleic acid analized by Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)Various buffer systems are used in PAGE depending on the nature of the sample and the experimental objective. The buffers used at theanode and cathode may be the same or different.

An electric field is applied across the gel, causing the negatively charged proteins or nucleic acids to migrate across the gel away from thenegative electrode (which is the cathode being that this is an electrolytic rather than galvanic cell) and towards the positive electrode (theanode). Depending on their size, each biomolecule moves differently through the gel matrix: small molecules more easily fit through the poresin the gel, while larger ones have more difficulty. The gel is run usually for a few hours, though this depends on the voltage applied across thegel; migration occurs more quickly at higher voltages, but these results are typically less accurate than at those at lower voltages. After the setamount of time, the biomolecules have migrated different distances based on their size. Smaller biomolecules travel farther down the gel,while larger ones remain closer to the point of origin. Biomolecules may therefore be separated roughly according to size, which dependsmainly on molecular weight under denaturing conditions, but also depends on higher-order conformation under native conditions.

Chemicals for processing and visualization

The following chemicals and procedures are used for processing of the gel and samples visualized in it:

• Tracking dye. As proteins and nucleic acids are mostly colorless, their progress through the gel during electrophoresis cannot be easilyfollowed. Anionic dyes of a known electrophoretic mobility are therefore usually included in the PAGE sample buffer. A very commontracking dye is Bromophenol blue (BPB, 3',3",5',5" tetrabromophenolsulfonphthalein). This dye is colored at alkali and neutral pH and is asmall negatively charged molecule that moves towards the anode. Being a highly mobile molecule it moves ahead of most proteins. As itreaches the anodic end of the electrophoresis medium electrophoresis is stopped. It can weakly bind to some proteins and impart a bluecolor. Other common tracking dyes are xylene cyanol, which has lower mobility, and Orange G, which has a higher mobility.

• Loading aids. Most PAGE systems are loaded from the top into wells within the gel. To ensure that the sample sinks to the bottom of thegel, sample buffer is supplemented with additives that increase the density of the sample. These additives should be non-ionic and non-reactive towards proteins to avoid interfering with electrophoresis. Common additives are glycerol and sucrose.

• Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB)(C45H44N3NaO7S2; mW: 825.97). CBB is the most popular protein stain.• Ethidium bromide (EtBr) is the traditionally most popular nucleic acid stain.• Silver staining. Silver staining is used when more sensitive method for detection is needed, as classical Coomassie Brilliant Blue

staining can usually detect a 50 ng protein band, Silver staining increases the sensitivity typically 50 times.• Western Blotting is a process by which proteins separated in the acrylamide gel are electrophoretically transferred to a stable,

manipulable membrane such as a nitrocellulose, nylon, or PVDF membrane. It is then possible to apply immunochemical techniques tovisualise the transferred proteins.

DNA/RNA Purification from PAGE

Electroelution