Quali sono gli argomenti di cui si occupa la BIOFISICA? · fisica24ore Biofisica La struttura delle...
52
fisica24ore Biofisica Quali sono gli argomenti di cui si occupa la BIOFISICA? STRUTTURA PROTEICA DINAMICA E FUNZIONE BIOFISICA TEORICA: MODELLI ACIDI NUCLEICI E RIBOSOMI BIOENERGETICA CANALI IONICI BIOFISICA DELLA SINGOLA MOLECOLA STRUTTURA E DINAMICHE DELLE MEMBRANE INTERAZIONI LIPIDI-PROTEINE AGGREGAZIONI DI MACROMOLECOLE BIOFISICA CELLULARE
Transcript of Quali sono gli argomenti di cui si occupa la BIOFISICA? · fisica24ore Biofisica La struttura delle...
fisica24oreBiofisica
Quali sono gli argomenti di cui si occupa la BIOFISICA?
STRUTTURA PROTEICA DINAMICA E FUNZIONE
BIOFISICA TEORICA: MODELLIACIDI NUCLEICI E RIBOSOMIBIOENERGETICA
CANALI IONICIBIOFISICA DELLA SINGOLA MOLECOLASTRUTTURA E DINAMICHE DELLE MEMBRANEINTERAZIONI LIPIDI-PROTEINEAGGREGAZIONI DI MACROMOLECOLEBIOFISICA CELLULARE
fisica24oreBiofisica
La struttura delle biomolecole è un argomento di grande interesse per molti settori della ricerca di base e applicativa
Conoscere la struttura delle macromolecole biologiche è fondamentale per capire la loro funzione e quindi per conoscere il meccanismo dei processi biologici.
La fisica fornisce metodi teorici (computazionali) e approcci sperimentali molto potenti per indagare la struttura delle macromolecole biologiche.
fisica24oreBiofisica
Le più importanti tecniche sperimentali e teoriche per l’analisi delle strutture di
macromolecole
Microscopie
Spettroscopie
Difrattometria ai raggi X
Modellistica molecolare
Simulazioni di dinamica molecolare
fisica24oreBiofisica
Brevi cenni sulla struttura delle macromolecole biologiche più importanti:Proteine;
Come si affronta dal punto di vista fisico il problema della risoluzione di strutture complesse;
Quale è il contributo dell’analisi informatica per la comprensione della struttura e funzione;
Di che cosa trattiamo?
fisica24oreBiofisica
La complessità della vita richiede che molte biomolecole siano di grande dimensioni
DNA che caratterizza un cromosoma umano: peso molecolare di circa 1012
daltons, lunghezza totale circa 10 cm. La lunghezza totale del DNA umano esteso è di circa 2 m.
fisica24oreBiofisica
Un semplice organismo unicellulare come l’ Escherichia Coli ha un DNA con un peso molecolare di circa 109 daltons.
fisica24oreBiofisica
Le proteine e gli acidi nucleici sono polimeri
Le macromolecole sono costruite collegando insieme unità strutturali definite MONOMERI. Essi sono etero polimeri caratterizzati rispettivamente da 4 e
20 unità strutturali.
Proteine:
Acidi nucleici 4 basi nucleotidiche
20 amminoacidi
fisica24oreBiofisica
Le proteine sono più piccole ma il loro grado di complessità è comunque molto alto
La mioglobina di capodoglio: la prima struttura tridimensionale risolta con la diffrazione ai raggi X
fisica24oreBiofisica
LE PROTEINE (dal greco protos: principale) SONO LE MACROMOLECOLEPIU’ ABBONDANTI E SVOLGONO SVARIATE FUNZIONI:
c) la proteina cheratina è il componente strutturale dei capelli, squame, corna, lana, unghie etc.
a) la luce prodotta dalle lucciole coinvolge la proteina luciferina;
b) gli eritrociti contengono la proteina emoglobina che trasporta l’ossigeno;
fisica24oreBiofisica
Le proteine hanno dimensioni molto variabili
Possono essere ad una sola subunità o a più subunità
fisica24oreBiofisica
Contengono 20 amminoacidi uniti tramite un legame “peptidico”covalente
Il legame peptidico
Amminoacido
fisica24oreBiofisica
La sequenza degli amminoacidi costituisce la struttura primaria
Ogni pallina corrisponde ad un ammino acido:
fisica24oreBiofisica
Le strutture primarie a confronto: mioglobina (Mb) di capodoglio e di uomo.
Le sequenze delle due Mb sono molto simili;
Anche le strutture tridimensionale sono molto simili;
La funzione fisiologica è la stessa: il legame con l’ossigeno;
L’evoluzione ha proceduto per molti milioni di anni, ma capodoglio e uomo hanno avuto un comune antenato;
Le proteine evolvono cambiando la loro sequenza.
fisica24oreBiofisica
Dalla sequenza è facile definire la composizione amminoacidica
fisica24oreBiofisica
Altri gruppi chimici caratterizzano le proteine coniugate
fisica24oreBiofisica
Le proteine hanno diversi livelli di struttura
fisica24oreBiofisica
La struttura secondaria si riferisce ad alcune parti di un polipeptide
Atsbury (1930) con i primi studi di diffrazione ai raggi X dimostrò che la proteina fibrosa α cheratina, di cui sono fatti i capelli, aveva una struttura regolare che si ripeteva ogni 5.12 Å (Angstrom: 0.1 nm)
Nel 1950 Pauling e Corey analizzarono le possibili conformazioni regolari di una catena polipetidica secondo questi principi:
Minor distorsione possibile dei legami chimici
La planarità del legame peptidico
Formazione di molti legami non covalenti: idrogeno
fisica24oreBiofisica
La più semplice disposizione che può assumere una catena polipetidica: αααα elica
MODELLO A PALLE E BASTONCINI
a) Elica destrorsa,b) Si evidenziano i legami idrogenoc) Il passo dell’elica è 5.4 Å o 3.6
residui amminoacidici
fisica24oreBiofisica
Modelli di αααα elica
Nelle proteine gli ammino acidi sono D e le eliche sono in larga misura destrorse
fisica24oreBiofisica
La struttura foglietto ββββ :I legami idrogeno si formano tra segmenti adiacenti;I segmenti adiacenti possono anche essere lontani nella sequenza amminoacidica; Le catene possono essere parallele o antiparalleleI residui laterali R sporgono al di fuori della struttura azig zag in modo alternato
fisica24oreBiofisica
La struttura terziaria analizza il “folding” di una singola catena polipeptica o di una parte di catena (dominio)
α eliche e β sheets, unità di struttura secondaria, si assemblano (folding) in una particolare conformazione proteica
il dominio è l’unità della struttura terziaria
Nelle proteine a più domini la struttura terziaria include l’assemblaggio di più domini
fisica24oreBiofisica
C’è una classificazione delle strutture terziarie in base alla loro topologia: alcuni esempi semplici
Proteine con predominanza di α elica
Proteine con predominanza di β sheets
Proteine miste
fisica24oreBiofisica
Proteine con predominanza di α elica
Due eliche antiparallele + un loopRna binding protein ROP: 63 residui (proteina estratta da plasmidi)
Quattro eliche antiparallele + tre loopsMioemeritrina
fisica24oreBiofisica
altri esempi:
Citocromo c’
Citocromo b-562
fisica24oreBiofisica
Tipologie ββββ: ββββ sandwich
Due foglietti β impacchettati l’uno di fronte all’altro
fisica24oreBiofisica
Tipologie ββββ: ββββ barrel
fisica24oreBiofisica
Proteine con αααα eliche + ββββ sheets
Placental ribonuclease inhibitor
fisica24oreBiofisica
La struttura quaternaria riguarda proteine multimeriche costituite da più catene polipeptidiche o da più domini strutturali. Le proteine regolatrici hanno spesso più subunità. Le interazioni tra le subunità consentono grandi variazioni nell’attività catalitica .
Esempio: la emoglobina
La struttura quaternaria delle proteine
fisica24oreBiofisica
Il problema del “folding”: che cosa determina la struttura tridimensionale delle proteine?
In genere la sequenza amminoacidica contiene la informazione completa per il raggiungimento della struttura funzionale
Se si provoca mediante agenti chimico-fisici la distruzione della struttura di una proteina (unfolding) si ottiene una struttura disordinata detta “random coil”
In alcuni casi il recupero della struttura nativa è possibile semplicemente ripristinando le condizioni sperimentali originali
fisica24oreBiofisica
Le interazioni non covalenti che partecipano nella definizione della struttura dellebiomolecole
fisica24oreBiofisica
Il paradosso di LevinthalSe consideriamo che ogni residuo amminoacidico abbia 10 conformazioni diverse, una ipotetica proteina con 100 amminoacidi può, in linea teorica, assumere 10100 conformazioni.
Se il tempo per analizzare la singola conformazione fosse molto breve (10-13 s), il tempo necessario per analizzare tutte le conformazioni sarebbe dell’ordine di 1077 anni
Quindi il processo di ripiegamento non può essere un processo casuale: DEVE PER FORZA ESISTERE UNA SCORCIATOIA
Il “folding” procede attraverso un limitato set di conformazioni intermedie metastabili (modello sequenziale) o con la formazione di un collasso idrofobico (molten globule).
fisica24oreBiofisica
Termodinamica del folding visto come imbuto di energia libera
Scendendo verso il basso si ha una diminuzione delle specie
Si raggiunge il minimo energetico percorrendo anche strade diverse
Ogni minimo corrisponde a stati intermedi metastabili
Le interazioni idrofobiche di residui non polari provocano il “collassoidrofobico”
fisica24oreBiofisica
Molte malattie sono dovute al difettoso ripiegamento di una proteina
Alcune patologie derivano da proteine che non sono in grado di raggiungere la loro struttura funzionale e che tendono a formaregrossi aggregati (fibrille o forme amiloidi): Alzheimer, Parkinson,encefalopatia spongiforme, diabete di tipo II.
In altri casi mutazioni puntiformi generano proteine che non raggiungono laloro locazione finale o che non sono più in grado di svolgere la loro funzione perché icapaci di legare i loro substrati: fibrosi cistica
Fibrosi cistica: difetto nella proteina transmembrana che agisce come un canale degli ioni cloro (CFTR). La mutazione più comune è ladelezione di un amminoacido (Phe 508) e la proteina mutata non si avvolge correttamente
fisica24oreBiofisica
Come si studiano le strutture tridimensionali delle macromolecole: diffrattometria ai raggi X
Tecnica fisica molto potente per risolvere le strutture solide regolari (cristalline)
In fisica con il termine cristallo si intende una struttura atomica ordinata
In un solido cristallino gli atomi sono disposti in modo regolare nello spazio reticolo geometrico
Cristallo di pirite
fisica24oreBiofisica
In un cristallo l’unità ripetente può essere un atomo o una molecola
nei cristalli di Ferro l’unità è un singolo atomo,
nel sale da cucina NaCl sono due atomi,
in laboratorio si possono realizzare cristalli in cui l’unità ripetente è una macromolecola biologica costituita da migliaia di atomi
NaCl
QuickTime™ and a Cinepak decompressor are needed to see this picture.
fisica24oreBiofisica
Come si determina la struttura dei cristalli?
Le distanze tra atomi in un solido cristallino sono dell’ordine di 0.1 nm paragonabili con le lunghezze d’onda dei raggi X (da 0.07 a 0.15 nm);
L’interferenza dei raggi X che vengono deviati dagli atomi porta ad un fenomeno generale chiamato diffrazione
fisica24oreBiofisica
La diffrazione
Se posizioniamo due oggetti nel cammino di un fronte di onda ognuno devia (scattering) la luce generando due fronti d’onda sferici
DIFFRAZIONE: in alcune posizioni dello spazio si ha interferenza positiva (onde in fase) in altre interferenza negativa (onde fuori fase)
fisica24oreBiofisica
Dalla diffrazione alla distanza interatomica
Se si fanno diverse osservazioni delle ampiezze dei nuovi fronti d’onda a differenti angoli di incidenza e con diverse orientazioni
SI POSSONO OTTENERE LE POSIZIONI DEGLI OGGETTI A E B
LA LEGGE DI BRAGG BEN CHIARISCE IL RAPPORTO TRA POSIZIONI DEGLI ATOMI E LA DIFFRAZIONE.
Nella trattazione semplice si considera solo la riflessione del raggio incidente, ma considerazioni analoghe posssono essere fatte considerando lo scattering su tutto l’angolo solido
fisica24oreBiofisica
L’interferenza costruttiva del fascio diffratto è possibile solo se è soddisfatta la relazione di Bragg:
λ: lunghezza d’onda dei raggi X, d: distanza tra i piani cristallini paralleli e θ: l’angolo di incidenza dei raggi X rispetto i piani considerati
La legge di Bragg
fisica24oreBiofisica
Come si opera sperimentalmente
Cristallizzazione della macromolecola
Posizionamento del cristallo tra sorgente X e rivelatore
Mediante il movimento del cristallo si genera una serie ordinata di macchie che rappresentano le riflessioni dei raggi X
fisica24oreBiofisica
Dalla distribuzione complessiva delle macchie viene creata una mappa di densità elettronica
fisica24oreBiofisica
Si costruisce un modello per la struttura compatibile con le mappe di densità elettronica
La diffrazione ai raggi X della mioglobina di capodoglio comporta circa 25000 macchie (riflessioni)
fisica24oreBiofisica
Risonanza magnetica nucleare: NMR
Le macromolecole da studiare sono in soluzione
Si hanno informazioni anche sulla dinamica della struttura
I nuclei di alcuni atomi hanno numero di spin diverso da zero e si comportano come piccoli magnetini ruotanti (1H, 31P, 15N, 13C etc).
fisica24oreBiofisica
Il campo magnetico esterno Quando questi nuclei sono posti in un campo magnetico ci sono due possibili configurazioni una di bassa energia (a) e una di alta energia (b)
La differenza di energia tra i due stati è data da
E=hγB
dove h : cost di Plank, γ costante giromagnetica e B la forza del campo magnetico esterno
a) b)
fisica24oreBiofisica
La radiazione elettromagnetica induce la transizione
Se faccio incidere una radiazione elettromagnetica con con frequenza ν la sua energia è E= hν. Quando la frequenza è uguale a γB si ha risonanza e il magnetino inverte la sua polarità
fisica24oreBiofisica
Due modi per ottenere la transizione
Mantenendo fissa la frequenza (radiofrequenza) e modulando il campo
QuickTime™ and a GIF decompressor are needed to see this picture.
fisica24oreBiofisica
Il secondo modo
Modulando la frequenza incidente e mantenendo fisso il campo
QuickTime™ and a GIF decompressor are needed to see this picture.
fisica24oreBiofisica
Le informazioni dallo spettro NMR
La energia necessaria per avere assorbimento dipende fortemente dall’intorno dell’atomo che può accoppiarsi con gli atomi vicini
Spettro NMR monodimensionale di una globina
fisica24oreBiofisica
Per le macromolecole è necessario usare tecniche bidimensionali che consentono di misurare con precisione accoppiamenti con atomi attraverso lo spazio (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY: NOESY) o attraverso i legami covalenti (COherent SpectroscopY: COSY).
Gli spettri NMR bidimensionali
Il cambio di intensità di un segnale di un nucleo è ottenuto irraggiando un nucleo vicinale. Questa interazione è dipendente dalla distanza (r-6)
fisica24oreBiofisica
L’ interazioni 1 e 2 sono state determinate: in particolare la interazione 2 è connessa alla vicinanza tra gli idrogeni di un metile della proteina e un idrogenodell’eme
fisica24oreBiofisica
Queste informazioni sono usate per costruire la struttura tridimensionale della proteina
NMR Raggi X
Con NMR si ottengono delle famiglie di strutture: si hanno informazioni sulla dinamica delle macromolecole
fisica24oreBiofisica
QuickTime™ and a GIF decompressor are needed to see this picture.
