Dipartimento di FisicaUniversità degli Studi di Milano-Bicocca

BIOFISICA

Laura SironiMargaux Bouzin

Mykola Borzenkov

Biofisica @UNIMIB:Giuseppe Chirico, Maddalena Collini,

Laura D’Alfonso, Laura SironiMykola Borzenkov, Margaux BouzinAmirbahador Zeynali, Mario Marini

SISTEMI BIOLOGICI COMPLESSI

proteine cellule tessuti

organellivirus

batteri

10 nm 100 nm 1 mm 10 mm 100 mm 1 mm

La figura del biofisico si propone di studiare sistemi cellulari, tessuti e piccoli organismi con metodologie fisiche sia a livello sperimentale sia

a livello di modellizzazione.

MICROSCOPIA VISIBILE/INFRAROSSA

sorgente laser

sistema ottico + scansione

rivelatore (PMT, termocamera..)

• Rivelazione del segnale in funzione di spazio e tempo: I(x,y,t)

• Rivelazione del segnale in funzione di molteplici parametri: I(x,y,q,l)

• Risoluzione spaziale ∼ 1 mm – 50 nm

Sistema MultispotOttica adattiva per correzione aberrazioniSistema per imaging termico a super-risoluzione

MICROSCOPIA VISIBILE/INFRAROSSA

sorgente laser

sistema ottico + scansione

rivelatore (PMT, termocamera..)

1 mm

1 mm

Tra

smis

sio

ne

Tem

per

atu

raF

luo

resc

enza

2°C

0.5°C

1 mm

TUMORIProcessi di fibrosi (fegato, reni, polmoni)

Patologie della corneaPatologie della pelle

Cicatrici/Rimarginazione feritePatologie muscolari

L’organizzazione del collagene è differente in tessuti sani o affetti da patologia

La struttura del collagene cambia durante lo sviluppo di una patologia

Individuazione patologia

Stadio di sviluppo della malattia

MICRO-ARCHITETTURA COLLAGENE

SVILUPPO TUMORE

Organizzazione collagene nella matrice extracellulare tumoraleMetabolismo

SVILUPPO TUMORI

Generazione di Seconda Armonica (SHG)

qLqF

z

x

k

kjijk

j

i EEP )()(),()2()2()2(

lSHG=linc/2

Processo ottico non lineare in cui due fotoni di frequenza vengono trasformati in un singolo fotone di frequenza doppia, 2 Interazione con molecole non centrosimmetriche (tripla elica collagene)Sensibile alla simmetria della molecola e alla polarizzazione

)2()2(/ zxxzzz

COLLAGENE

cos

1

0

1

0

N

n

n

L

N

n

n

L

n

L

I

KI

g

q

qq q

q

1

0

1

0

sin

N

n

n

L

N

n

n

L

n

L

I

KI

s

q

qq q

q

cos

1

0

12/

0

N

n

F

n

L

N

n

F

n

LF

n

L

I

KI

g

qq

qqqq

1

0

12/

0

sin

N

n

F

n

L

N

n

F

n

LF

n

L

I

KI

s

qq

qqqq

12 FNK qq

12 qq NK

N=/qq angular resolution

0 qL <

qF qL

𝑔𝜃

𝑠𝜃

𝜃𝐶

𝑔𝛾

𝑠𝛾

𝛾𝐶 ∆𝛾𝑖𝑗

qC = 1o and C = 0.2

qC = 30o and C = 1

Cluster size43 20

Cluster size115 40

qC = 1o and C = 0.2

cij

j

ciji qq qc c

Cluster nello spazio dei fasoriDipendente da proprietà microscopiche

Radaelli F. et al., Sci Rep. 2017 Dec 12;7(1):17468.

ETEROGENEITA’ ECM

(1) Caratterizzazione morfologica (2) Misura di parametri funzionali in sistemi biologici(3) Studio di processi dinamici

(fenomeni di trasporto)

TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI

(1) Caratterizzazione morfologica (2) Misura di parametri funzionali in sistemi biologici(3) Studio di processi dinamici

(fenomeni di trasporto)

Cellule endoteliali

Zebrafish

TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI

Globuli rossi

10 mm

Sistema animale modello con impieghi in genetica, medicina rigenerativa e

ricerca cardio-vascolare

Misure emodinamiche in vivo (in regime di flusso

pulsatile), su regioni estese, con risoluzione

spaziale minima ~ 10 mm

Inverso, D. et al. Cell, 161(3), 2015

Micro-circolazione epatica

Qdots

Cellule T

Cellule T

Epatociti

TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI

Misure emodinamiche in vivo con risoluzione spaziale minima ~ 10 mmin sistemi circolatori dalla geometria

complessa + single cell tracking

Bouzin, M. et al. Biophys. J., 109:2246-2258, 2015

Terapia fototermica & drug delivery

10 mm

TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI

Nanoparticelle d’oro in cellule HeLa

Dall’emodinamica ai processi di trasporto intra-cellulare:moto Browniano, trasporto attivo, diffusione anomala

10 mm

SPETTROSCOPIA DI CORRELAZIONE

tempo t

F(t

)

t

Fluttuazioni di intensità

Diffusione Browniana

Moto direzionale

Reazioni chimiche

Fotodinamica

Tempo di ritardo t

G(t

)

Funzione di auto-correlazione

𝛿𝐹 𝑡 = 𝐹 𝑡 − 𝐹 𝑡 𝑡

𝐺 𝜏 =𝛿𝐹 𝑡 𝛿𝐹(𝑡 + 𝜏) 𝑡

𝐹(𝑡) 𝑡2

xy

z

SPETTROSCOPIA DI CORRELAZIONE

tem

po

1 2

Flusso, v

R

F2(t)

t

F1(t)

t t1

t1 + t

t1

t1 + t

Flusso, v

1 2

Globuli rossi

𝜏𝑉,𝑅 =𝑅

𝑣

R // v

SPETTROSCOPIA DI CORRELAZIONE

tem

po

1 2

Flusso, v

R

F2(t)

t

F1(t)

t t1

t1 + t

tV,R

t1

t1 + t

Flusso, v

1E-3 0.01 0.1

0.000

0.004

0.008

𝜏𝑉,𝑅 =𝑅

𝑣𝐺12 𝜏 =

𝛿𝐹1(𝑡)𝛿𝐹2(𝑡 + 𝜏) 𝑡𝐹1(𝑡) 𝑡 𝐹2(𝑡) 𝑡

∝1

1 +4𝐷𝜏𝜔02

1

1 +4𝐷𝜏𝜔0𝑧2

𝑒𝑥𝑝 −1

𝜔02

𝑅 − 𝑣𝜏2

1 +4𝐷𝜏𝜔02

G12

t

Globuli rossi

R // v

Globuli rossi

SPETTROSCOPIA DI CORRELAZIONE

Misura della velocità del flusso arterioso+ parametri emodinamici critici (frequenza

battito, flow rate, shear stress..):

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

750

1500

2250

3000

3750

v (

mm

/s)

Time (s)t (s)

sistole

diastole

Sviluppo e applicazione di metodi correlativi per la misura di campi di velocità 3D in geometrie anche complesse

SINGLE PARTICLE TRACKINGxyt-stack

t1

tN

Identificazione picchi + fit Gaussiani

Ricostruzione traiettoria

?

?MSD(t):

spostamentoquadratico medio

𝑥 𝑡𝑗=1…𝑁 ≡ 𝑥 𝑡𝑗 , 𝑦 𝑡𝑗

𝑥 𝑡𝑗𝑥 𝑡𝑗−1

∆𝑥 𝑡𝑗 = 𝑥 𝑡𝑗 − 𝑥 𝑡𝑗−1

𝑝 ∆𝑥 𝑡𝑗 , ∆𝑡 = 𝑡𝑗 − 𝑡𝑗−1

𝑝 𝑥, 𝑡|𝑥′, 0

𝑥 − 𝑥′2=ඵ

−∞

+∞

𝑥 − 𝑥′2𝑝 𝑥′ 𝑝 𝑥, 𝑡|𝑥′, 0 𝑑𝑥𝑑𝑥’

SINGLE PARTICLE TRACKINGxyt-stack

t1

tN

Identificazione picchi + fit Gaussiani

Ricostruzione traiettoria

?

?MSD(t):

spostamentoquadratico medio

𝑥 𝑡𝑗=1…𝑁 ≡ 𝑥 𝑡𝑗 , 𝑦 𝑡𝑗

𝑥 𝑡𝑗𝑥 𝑡𝑗−1

∆𝑥 𝑡𝑗 = 𝑥 𝑡𝑗 − 𝑥 𝑡𝑗−1

𝑝 ∆𝑥 𝑡𝑗 , ∆𝑡 = 𝑡𝑗 − 𝑡𝑗−1

𝑝 𝑥, 𝑡|𝑥′, 0

𝑥 − 𝑥′2=ඵ

−∞

+∞

𝑥 − 𝑥′2𝑝 𝑥′ 𝑝 𝑥, 𝑡|𝑥′, 0 𝑑𝑥𝑑𝑥’

0 1 2 3 4 5

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

t (s)

MS

D (m

m2 )

D=(0.024±0.001) mm2/s

𝑝 𝑥, 𝑡 =1

4𝜋𝐷𝑡𝑒𝑥𝑝 −

𝑥2

4𝐷𝑡

0 1 2 3 4 5

0

15

30

45

MS

D (m

m2 )

t (s)D=1 mm2/s, v=1 mm/s

moto Browniano, diffusione + drift& diffusione anomala

a=1.3

a=0.7

𝑀𝑆𝐷 𝑡 = 4𝐷𝑡

𝑀𝑆𝐷 𝑡 = 4𝐷𝑡 + 𝑣2𝑡2

𝑀𝑆𝐷 𝑡 = 4𝐷𝛼𝑡𝛼

SINGLE PARTICLE TRACKING

Nanoparticelle d’oro in cellule HeLa

10 mm

1. D=(3.9±0.1)10-5 mm2/sMoto Browniano ✓

2. D=(8.9±0.3)10-5 mm2/sv=(2.3±0.1)10-3 mm/sDiff. + drift ✓

3. Moto Browniano ✗Diff. + drift ✗Trasporto attivo intermittente ✓

Modellizzazione e analisi delle traiettorie

Dinamica intra-cellulare:

0.2 mm

0.2 mm

0.2 mm

0.2 mm

0.2 mm

0.4 mm

1

2

3

Bouzin, M. et al. Biophys. J.,

109:2246-2258, 2015

TRASPORTO IN SISTEMI COMPLESSI

modellizzazione fenomeni di trasporto su

scala sub-cellulare (trasporto intermittente, diffusione anomala…)

100 500

sviluppo/programmazione di algoritmi e metodi per l’analisiquantitativa di immagini in risposta a problemi di interessebiologico, biomedico, nanotecnologico

sviluppo di metodi correlativi per studidi emodinamica in-vivo su sistemicircolatori dalla geometria complessa

OUTLINE

Nanoparticles and photo-thermal effect

Research background

Novel application possibilities:

Remotely activated antibacterial surfaces Scaffolds for tissue engineering

Nanoparticles and Photo-Thermal Effect

Nanoparticles and Photo-Thermal Effect

Nanoparticles can convert absorbed light into heat

NIR LIGHT INCREASE OF TEMPERATURE APPLICATION

Nanoparticles

solution Cancer cellsablation

Research background

TRITON X-100 assisted synthesis of GNSChem.Commun. 2013, 49, 6225

GNS feature two intense LSPRs in the 600-900 and 1100-1600 nm ranges, and are able to convert laser radiation into heat, offering two photo-thermally active channels

Small, 2014, 4, 631

CuS nanoparticles and thin films display interesting electrical and optical properties. In comparison with other plasmonic nanoparticles, the absorption wavelength of CuS nanoparticles is less affected by synthetic conditions, particle shape and surrounding environment.

PB nanoparticles display an intense absorption band with λmax ≈ 650-900 nm and the irradiation of this band results in thermal relaxation. PB nanoparticles are biocompatible and non-toxic.

Supramol. Chem., 2017, 19, 1

Research background

Langmuir, 2015, 31, 8081

Increase of temperature of GNS printed patterns

during NIR laser irradiation

Remotely activated antibacterial surfaces

No NIR After NIR

Scaffolds for tissue engineering

ΔT ≈3-4.5°C

F11 neuronal cells

growth after NIR

irradiation

CONCLUSIONI

Le nanoparticelle fototermiche hanno potenziali applicazioni nell’ambito della nanomedicina e delle biotecnologie, consentendo di eliminare batteri

e biofilms ma anche di stimolare la crescita delle cellule.

RESEARCH NETWORK

Biophysics Group

Dipartimento di FisicaUniversità degli Studi di Milano-Bicocca

ESPERIMENTAZIONIDI BIOFISICA

ESPERIMENTAZIONI DI BIOFISICA

DOCENTE RESPONSABILE: Dott.ssa Laura Sironi

laura.sironi@unimib.it

ESPERIMENTAZIONI DI BIOFISICA

ORGANIZZAZIONE DEL LABORATORIOesperimenti ruotati sui diversi gruppi

ESAMERelazioni relative agli esperimenti svolti + orale

Corso propedeutico consigliato: ELEMENTI DI BIOFOTONICA

(Prof. G.Chirico/Prof.ssa M.Collini) I semestre, III anno

ORGANIZZAZIONE LABORATORIO

ARGOMENTISPETTROSCOPIA DI BIOMOLECOLE

PROPRIETA’ DI NANOPARTICELLE D’OROMICROSCOPIA OTTICA

Spettroscopia di fluorescenza:

Proprietà fluorescenza

Interazione proteina-farmaco

Protein unfolding

ESPERIMENTI

ESPERIMENTI

Unfolding proteine

Spettroscopia infrarossa

Dicroismo circolare

Struttura=

Funzione fisiologica

Folding non corretto

Malattie (Alzheimer, Huntington, Parkinson,

tumori)

Fluorescenza

Determinazione della dimensione diNANOPARTICELLE mediante light scattering

0 100 200 300 400

20

25

30

35

40

45

50

T (

°C)

Time (s)

CTRL

NC

NC20

NC12

Termocamera (terapia fototermica)

ESPERIMENTI

Imaging di cellule e tessuti mediante microscopia confocale a fluorescenza

Analisi immagini/esperimenti di ottica

ESPERIMENTI