Biofisica dei microtubuli

Fabio Costanzo Caratteristiche Biofisiche dei Microtubuli Nerurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche

Caratteristiche biofisiche dei Microtubuli Neurali: Sperimentazione e Confronto con le Ipotesi Teoriche

Fabio Costanzo

Relatrice: Prof.ssa Rita Pizzi

Correlatore: Prof. Giuliano Strini

Dipartimento di Tecnologie dell’informazione

Università degli Studi di Milano


Obiettivi

Fornire un’organizzazione ragionata dell’enorme mole di letteratura presente sui microtubuli

Validare ipotesi riguardo proprietà anomale dei microtubuli valutando le possibili modificazioni delle caratteristiche biofisiche tramite tre misure fisiche:

risonanza, birifrangenza, superradianza.

Analisi di significatività statistica delle elaborazioni


Microtubuli 1

La tubulina è una proteina globulare che costituisce l'unità fondamentale delle strutture del citoscheletro dette microtubuli.

I microtubuli sono formati da due subunità proteiche di α e β tubulina e possiedono un'intrinseca polarità, dovuta alla disposizione delle subunità proteiche di tubulina


Microtubuli 2

Anni ’80: Stuart Hameroff – medico ricercatore – ipotizza che i microtubuli siano capaci di calcolo. Fino ad allora considerati solo componenti del citoscheletro.

Studi successivi e recenti portano all’attribuzione di funzioni quali:trasporto intracellulare degli organelli;movimento ciliare, ondulatorio e sincronizzato;divisione cromosomicascambio di segnali tra un elemento e l’altro;comunicazione tra nucleo e interno della cellulacrescita di collegamenti fra neuroni


Microtubuli 3

Modello quantistico di J. Tuszynski – Università di Alberta.

La tubulina, che possiede due possibili stati, passerebbe dall’uno all’altro a causa del passaggio per effetto tunnel dal dimero α a quello β.

Il processo quantistico avverrebbe a temperatura ambiente con tempi di decoerenza sufficientemente lunghi.

Funzionamento del microtubulo come trasmettitore elettromeccanico di segnale, agente come cavo intelligente autoadattativo.

La rete neurale del cervello sarebbe accoppiata alla rete dei microtubuli e viceversa.


Nanotubi di carbonio

Sono una particolare conformazione molecolare che il carbonio può assumere.

-Diamante-Grafite- ecc..

• Molta ricerca si sta attualmente sviluppando intorno ai nanotubi, che hanno capacità di trasporto di corrente estremamente elevato e possono agire sia come semiconduttori sia come superconduttori.

• Grazie alla struttura su nanoscala di questi materiali, le loro proprietà non sono limitate dalla fisica classica, ma sono aumentate da un ampia gamma di effetti quantistici.

• Questi possono portare a un ancor più efficiente mezzo di trasferimento di informazioni.


Motivazioni degli Esperimenti - Risonanza

Qualsiasi conduttore tubolare cavo, risuonando meccanicamente, agisce da antenna (antenna in cavità).

E’ noto che i nanotubi di carbonio si comportano come antenne in grado di captare le altissime frequenze della radiazione luminosa visibile.

I microtubuli, simili in struttura e dimensione ai nanotubi, si possono comportare come oscillatori, e questo potrebbe renderli dei ricevitori superreattivi in grado di amplificare il segnale.

Verifica dell’esistenza di risonanza dei microtubuli, in analogia con i nanotubi, su una certa frequenza, con effetto di amplificazione del segnale.


Motivazioni degli Esperimenti - Birifrangenza

Attraverso la luce polarizzata e un adeguato apparato per la rilevazione, è possibile osservare la birifrangenza associata, e quindi l’indice di orientamento, di materia cellulare sottoposta a campi elettrici (effetto Pockels) e magnetici (effetto Faraday).

Ipotesi di lavoro: Un particolare comportamento biofisico è funzionale ad qualche proprietà caratteristica della materia biologica.

Differenze di comportamento osservate tra campioni di tubulina e del suo diretto aggregato (microtubuli) porterebbero a credere che la struttura in cavità predisponga a particolari configurazioni in risposta a stimoli cellulari precisi.


Motivazioni degli Esperimenti - Superradianza

La superradianza è un effetto in grado di convertire energia di vario genere da uno stato disordinato in un’energia elettromagnetica coerente, per così dire “ordinata”, comportando un’emissione di radiazioni con un pompaggio spontaneo e coerente di fotoni.

Attraverso questo effetto i microtubuli potrebbero trasformare qualsiasi energia in fotoni coerenti all’interno del microtubulo stesso.

L’esperimento previsto dal progetto sarà eseguito successivamente presso il Dipartimento di Scienze dei Materiali dell’Università di Milano Bicocca.


Risonanza - strumenti

Esperimento preparato ed effettuato a Crema.

Banco dell’esperimento costituito da:

Microwave Signal Generator Polarad mod. 1105, per generare frequenze tra 0,8 GHz e 2,5 GHz, collegato alla prima antenna.

•Spectrum Analyzer Avantest mod. TR4131, utilizzato come Dip Meter collegato alla seconda antenna per visualizzazione eventuali risonanze.

• due antenne dipolo ¼ d’onda, accordate sulla frequenza di 1,5 GHz, al centro delle quali è posta la soluzione da sottoporre a misura. Struttura collocata in contenitore metallico in mumetal per schermare da segnali esterni.


Risonanza - esperimento

Sottoposti a stimoli elettromagnetici ad alta frequenza si sono messe a confronto le risposte di campioni di:

1. dimero di tubulina in soluzione stabilizzante, 2. Microtubuli ,3. soluzione stabilizzante senza materia cellulare.

Analisi tubulina: nessun cambiamento di picco significativo.

Analisi microtubuli: a 1510 MHz rilevazione di una differenza di ampiezza del picco di 0,30 Hz

Analisi del buffer: nessun cambiamento di picco significativo.


Risonanza - osservazioni

Come misura di controllo è importante il valore della terza analisi: che il buffer stabilizzatore non abbia fatto rilevare cambiamento del picco di riferimento sta a significare che eventuali oscillazioni per altre due soluzioni dipendono esclusivamente dalla materia cellulare campionata.


Birifrangenza - strumenti 1

Esperimento preparato a Crema ed effettuato a Milano.

E’ stato predisposto un polarimetro con la collaborazione del Prof. Giuliano Strini del Dipartimento di Fisica dell’Università di Milano.

Misurazione di due celle contemporaneamente:

•La prima sempre con campo magnetico longitudinale a bassa intensità alla frequenza di 610,1 Hz riempita con acqua distillata, che permette di avere un segnale di riferimento per tutte le misure sulla seconda cella.

•La seconda cella a frequenza 632 Hz contenente la soluzione da esaminare.


Birifrangenza - strumenti 2

A : Laser Elio-Neon (Hughes 3222H-P, 633 nm; np 5 nW max); Nicol polarizzatore; beam splitter per lo stabilizzatoreB : Cuvetta e bobina a 610.1 Hz per la cella di riferimentoC : Cuvetta e bobina a 632 Hz per il campioneD : cella per il campo elettricoE : filtro polarizzanteF : lente per focalizzare il fascio sul fotodiodoG : fotodiodo più amplificateHP : analizzatore di spettro (HP 3582A) per on-line checkCOMP : sistema di acquisizione dati controllato per elaborazione off-line


Birifrangenza - esperimento

Test eseguiti per soluzioni:

a) tubulina in buffer per tubulina;

b) microtubuli in buffer per microtubuli;

c) tubulina in buffer per microtubuli;

d) buffer per microtubuli senza materia cellulare.

Ciascuna soluzione sottoposta a differenti sollecitazioni:

1) campo elettrico;

2) campo magnetico longitudinale;

3) campo magnetico trasversale;

4) assenza di campo (controllo).


Birifrangenza - osservazioni

Già in fase preliminare si è notata una forte risposta al campo magnetico longitudinale di tutti i campioni sottoposti a una frequenza di 632 Hz.

In assenza di campo non si rilevano picchi di reazione.


Birifrangenza - Analisi dei Risultati 1

Analisi approfondita dei risultati raccolti effettuata tramite software.

Parametrizzazioni:

o Hamming windowing (home made software);

o Hann windowing con Hann smooth 15pts (Sigview)

o Hann windowing senza smooth (Sigview)

o Hamming windowing con Hamming smooth 5pts (Sigview)



CE CMT CML SC

610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz 610Hz 632Hz

Mt in buff mt 927.41 24.75 1257.95 101.44 1232.30 2253.10 1148.0 9.87

Tb in buff mt 2229.97 39.46 2013.46 200.63 2047.91 4827.94 2146.92 6.13

Solo buff mt 2996.69 29.72 2842.10 262.97 2893.39 6758.69 2878.20 16.83

Tb in buff tb 3445.27 8.65 884.68 79.21 834.54 1928.90 940.53 3.32

A- Hamming windowing (home made sw)

CE CMT CML SC


Mt in buff mt 286.7 8.1 391.7 32.8 385.5 712.4 356.5 n/d

Tb in buff mt 694.9 13.7 627.8 63.9 646.7 1525.1 669.8 n/d

Solo buff mt 934.3 11.5 885.6 84.4 902.1 2133.8 897.6 n/d

B - Hann windowing – Hann smoothing



CE CMT CML SC


Mt in buff mt 1141.8 27.2 1547.0 185.0 1517.5 2628.3 1412.1 5.5

Tb in buff mt 2750.1 4.7 2477.4 234.3 2555.9 5629.3 2610.9 2.3

Solo buff mt 3690.6 30.8 3498.0 305.1 3564.8 7883.4 3547.3 8.7

Tb in buff tb 4247.7 7.7 1089.7 92.5 1028.5 2250.7 1158.5 1.3

CE CMT CML SC


Mt in buff mt 748.7 18.68 1015.4 79.3 994.8 1762.5 926.4 9.91

Tb in buff mt 1800.1 31.58 1625.5 157.1 1674.8 3775.6 1733.0 2.34

Solo buff mt 2418.6 21.64 2294.1 204.8 2335.2 5284.8 2323.1 8.19

C - Hann windowing senza smooth

D - Hamming windowing - Hamming smoothing



I valori delle tabelle precedenti sono stati normalizzati per mediante il valore di controllo (val-632/val-610).

Tab. A CE Tab. B CE Tab. D CE Tab. E CE

Mt in buff mt 0.0267 0.0283 0.0238 0.0249

Tb in buff mt 0.0177 0.0197 0.0169 0.0175

Solo buff mt 0.0099 0.0123 0.0083 0.0089

Confronto campo elettrico

•La soluzione con microtubuli ha sempre valore maggiore sia della soluzione con tubulina che della soluzione da sola quando viene attraversata da campo elettrico.

•La soluzione con tubulina assume sempre valore maggiore della soluzione da sola quando viene attraversata da campo elettrico.



Tab. A CMT Tab. B CMT Tab. C CMT Tab. D CMT

Mt in buff mt 0.0810 0.0837 0.0766 0.0781

Tb in buff mt 0.0996 0.1018 0.0946 0.0966

Solo buff mt 0.0925 0.0953 0.0872 0.0893

Confronto campo magnetico trasversale

Il campo magnetico trasversale non influenza in modo differente le varie soluzioni.



Confronto campo magnetico longitudinale

la soluzione con microtubuli ha sempre valore minore sia della soluzione con tubulina che della soluzione da sola quando viene attraversata da campo magnetico longitudinale.

Tab. X CML Tab. Y CML Tab. Z CML Tab. K CML

Mt in buff mt 1.828 1.8480 1.7320 1.7717

Tb in buff mt 2.327 2.3567 2.2025 2.2544

Solo buff mt 2.336 2.3654 2.2115 2.2628



Tab. X CE Tab. Y CE Tab. Z CE Tab. K CE

Mt in buff mt 0.00860 No picco in 632 0.00389 0.01069

Tb in buff mt 0.00285 No picco in 632 0.00088 0.00135

Solo buff mt 0.00585 No picco in 632 0.00245 0.00353

Confronto senza campo applicato

•La soluzione con microtubuli ha sempre valore maggiore sia della soluzione con tubulina che della soluzione da sola quando non viene attraversata da nessun campo elettromagnetico.

•La soluzione con tubulina assume sempre valore minore della soluzione da sola quando non viene attraversata da alcun campo elettromagnetico.


Analisi Statistica

Osservazioni

• Sostanziale equivalenza dei risultati con diverse parametrizzazioni.

•Non abbiamo quindi bisogno di valutare una miglior scelta fra le possibili parametrizzazioni.

•L’uniformità delle diverse analisi suggerisce che queste differenze non siano casuali o dovute al rumore.

•L’analisi di significatività è stata effettuata sui dati elaborati con Hamming window con Hamming smooth 5pts


Analisi Statistica 2

Abbiamo messo a confronto le rilevazioni per le quali abbiamo osservato differenze di comportamento.

Abbiamo eseguito il paired t-test usando il software Minitab.

Per il campo elettrico:1. MT in buffer MT – tubulina in buffer MT2. MT in buffer MT – solo buffer MT3. tubulina in buffer MT – solo buffer MT

Per il campo magnetico longitudinale1. MT in buffer MT – tubulina in buffer MT2. MT in buffer MT – solo buffer MT

In assenza di campo1. MT in buffer MT – tubulina in buffer MT2. MT in buffer MT – solo buffer MT3. tubulina in buffer MT – solo buffer MT


Analisi Statistica 3

Osservazioni.

Tra tutti i test solo quello di confronto per:

tubulina in buffer per MT e buffer da solo senza materia cellulare

entrambi sottoposti a campo elettrico, mostra un valore superiore alla soglia di casualità del 5%.

Tutti gli altri confronti mostrano un'ottima significatività statistica, con p-Value sempre uguale a 0.000 (< 0.0005).

Le differenze riscontrate nei comportamenti delle diverse sostanze in base ai vari campi cui sono stati sottoposti hanno mostrato di essere molto lontane dalla casualità, consentendo di trarre delle conclusioni sui risultati raggiunti.


Conclusioni - 1

Esperimento di risonanza

L’assenza di risposta per la tubulina e per la soluzione di controllo, contrapposta all’oscillazione evidente del

picco di riferimento ottenuto dai microtubuli, suggerisce che la struttura tubolare tipica dei microtubuli sia, se non in tutto, almeno in parte la causa dell’amplificazione del segnale osservato.


Conclusioni - 2

Esperimento di birifrangenza

Dall’analisi dei risultati si deduce che la differenza in birifrangenza non può che essere dovuta alla differenza di struttura microscopica.

In particolare si osserva che l’effetto anomalo più evidente si registra nel caso di campo elettrico.

Campi elettrici

Tab. X CE Tab. Y CE Tab. Z CE Tab. K CE

Mt in buff mt

0.0267 0.0283 0.0238 0.0249

Tb in buff mt 0.0177 0.0197 0.0169 0.0175

Solo buff mt 0.0099 0.0123 0.0083 0.0089


Conclusioni - 3

Significatività statistica

I risultati raggiunti negli esperimenti, confortati dalla significatività statistica, suggeriscono l’ipotesi che la struttura tubolare dei microtubuli possa essere responsabile dei comportamenti anomali riscontrati.

I risultati sperimentali sono l’unica via legittima per validare le diverse teorie quantistiche esistenti sui microtubuli.

I risultati sperimentali sono in linea con i risultati sperimentali precedenti ottenuti dal gruppo, in cui si evidenziava una anomala sensibilità dei neuroni a campi elettromagnetici ultradeboli.


Sviluppi Futuri - 1

• Ripetizione degli esperimenti già effettuati preparando microtubuli e tubulina con ligandi differenti.

• Partecipazione agli esperimenti di ricerca di fenomeno di superradianza per luminescenza nelle sostanze descritte presso il Dipartimento di Scienze dei Materiali dell’Università di Milano Bicocca (Prof. Franco Meinardi).

• Analisi statistica dei risultati. • I risultati sperimentali verranno affiancati dalla simulazione grafica

tridimensionale del folding delle proteine in esame in base ai diversi ligandi per studiarne le differenze conformazionali emergenti e per verificare se il diverso comportamento in caso di differenti ligandi sia da imputarsi effettivamente a differenze conformazionali.

Sulla base dei risultati raggiunti, l’attività di ricerca continuerà secondo queste linee:


Sviluppi Futuri - 2

Il progetto dovrebbe infine pervenire ai seguenti risultati:

• A partire dai risultati sperimentali raggiunti, deduzione di una serie di ragionevoli ipotesi sulle proprietà funzionali dei microtubuli.

• Approfondimento delle conoscenze sulla struttura tridimensionale di queste importanti proteine attraverso la simulazione del loro folding in base alla presenza di differenti ligandi.

• Progressi nella metodologia della predizione del folding attraverso l’analisi critica della letteratura e l’implementazione e la validazione di un software originale.


Grazie per l’attenzione.

Biofisica dei microtubuli

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