LE PROTEINE POSSONO ESSERE BERSAGLIO DEI FARMACI PROTEINE svolgono molteplici attività STRUTTURALI...

LE PROTEINE POSSONO ESSERE BERSAGLIO DEI FARMACI

PROTEINE

svolgono molteplici attività

STRUTTURALIFUNZIONALI

mantenimento della forma della cellula(microtubuli, microfilamenti)

FARMACIcontrollano l’attività

delle proteine

organizzazione strutturale del DNA(impalcatura del cromosomi)

enzimi, implicati nel metabolismo

proteine recettoriali, informano la celluladegli eventi esterni e sono essenziali perl’attivazione della risposta intracellulare

fattori di trascrizione

……

LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE DEGLI ENZIMI

primaria secondaria terziaria quaternaria

sequenza

amminoacidica

la conformazione lungo la catena, in particolare per quanto riguarda segmenti con conformazione regolare

(alfa-elica, beta-struttura ecc.)

la struttura tridimensionale (3D)di una singola catena ripiegata.E' composta da elementi di struttura secondaria regolare ed irregolare

aggregazione di due o più subunità (catene) proteiche identiche (omo) o diverse (etero)

Energia di attivazione

La conversione X --> Y è termodinamicamente favorevole (Y si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X), ma la reazione non può avvenire se X non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione

Distribuzione di energia in una popolazione di molecole

• Normalmente, le molecole stabili sono per lo più presenti ad un livello di energia relativamente basso

• Solo una piccola frazione di esse possiede sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione

Enzimi: catalizzatori biologici

X

Y

GReazione non catalizzata

G

G*

G*

Reazione catalizzata

• Gli enzimi si combinano transientemente col substrato e ne abbassano l’energia di attivazione

• Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto

• Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di reazione

Struttura generale degli enzimiStruttura generale degli enzimi

APOENZIMA (Parte proteica)

OLOENZIMA

coenzima (vitamina)

ione metallico

gruppo prostetico (legato covalentemente)

Cinetica enzimatica 1

1913: Michaelis e Menten

approccio cinetico basato su: assunzione della velocità iniziale assunzione del “quasi equilibrio” (“equilibrio rapido”)

Assunzione dell’ “equilibrio rapido”: il complesso enzima-substrato è in equilibrio con l'enzima libero ed il

substrato.Questa situazione di equilibrio non è disturbata dallaformazione del prodotto ( k3 <<k2 )


Assunzione della “velocità iniziale”: la velocità della reazione viene valutata per un periodo di tempo

durante il quale la reazione inversa è fisicamente trascurabile (k4=0)


1925: Briggs e Haldane

Assunzione dello “stato stazionario”: durante tutto il periodo di tempo in cui si possono misurare delle

velocità iniziali il complesso [ES] rimane costante perchè la velocità con cui il complesso ES si forma a partire da E+S è uguale alla somma delle velocità con cui si scinde a dare E+P ed E+S. ( k3 non trascurabile rispetto a k2 )

Cinetica enzimaticaEquazione di Briggs-Haldane11e dividendo numeratore e denominatore per k1/ k2 + k3:

Ponendo il rapporto delle costanti cinetiche uguale alla costante di Michaelis:

L’ equazione cinetica può essere scritta nella forma tradizionale:

V=K3 x [ES]Vmax=K3 x [Etot]

Cinetica enzimaticaEquazione di Briggs-Haldane12

Cinetica enzimatica Equazione di Michaelis Menten 19

L’equazione di Michaelis-Menten descrive un’ iperbole rettangolare avente come asintoti Vmax e -Ks ( o -Km).

M

Cinetica enzimatica Equazione di Michaelis Menten 20

Quando [S] = K m, l’equazione diviene:

L'equazione cinetica è di 1°ordine nei confronti dell'enzima totale:

Cinetica enzimatica Significato fisico della Km 22

Km non è una costante di equilibrio e quindi non è una misura dell' affinità dell' enzima per il suo substrato.

Nell’equazione di Briggs-Haldane Km tiene conto delle tre costanti cinetiche

Il significato fisico della Km non può essere dunque affermato Il significato fisico della Km non può essere dunque affermato se non si conosce il valore delle singole costanti cinetiche.se non si conosce il valore delle singole costanti cinetiche.

K2 + K3 = Ks + K3 K1 + K1 K1

Cinetica enzimatica Significato pratico della Km 24

a) è una costante specifica per ogni enzima

Il valore della Km è importante perché:

b) è una stima della concentrazione intracellulare del substrato.

c) lo studio dell' effetto di diversi composti sulla Km permette di identificareeventuali inibitori.

d) conoscendo il valore della Km di un enzima, è possibile misurarne la Vmax ( [S]>>Km ) che è una misura indiretta di [Etot].

V0 = K3 x [Et] = VmaxKcat = Vmax = numero di turnover processi nell’unità di tempo

Et

Misura efficienza catalitica

Cinetica enzimaticaCinetica enzimatica inibizione enzimatica 46

Un inibitoreinibitore è una sostanza che riduce la velocità di reazione Un inibitore reversibile inibitore reversibile forma legami non covalenti con l’enzimaforma legami non covalenti con l’enzima I complessi EI non sono produttiviI complessi EI non sono produttivi Nella trattazione cinetica della inibizione enzimatica si applicano le

assunzioni di Michaelis-Menten anche all'inibitore

Cinetica enzimaticaCinetica enzimatica inibizione competitiva 47

Inibizione competitiva

Un inibitore competitivoinibitore competitivo è una sostanza che si lega all'enzima libero, impedendo così la formazione del complesso ES

Inibizione da analogo del substrato:


Inibizione da analogo del substrato:


Inibizione da substrato alternativo:

Glucosio + ATP Glucosio-6-P +ADPesocinasi

Mannosio + ATP Mannosio-6-P +ADPesocinasi

Fruttosio + ATP Fruttosio-6-P +ADPesocinasi


Inibizione a feedfeed--backback:

AA BB CC DD EE

feedfeed--backback

Un inibitore a feed-back si lega ad un sito diverso dal sito attivo


Derivazione dell’ equazione cinetica in presenza di un inibitore competitivocompetitivo

Gli equilibri che descrivono la competizione e la reciproca esclusione tra S ed I sono i seguenti:


Sostituendo nella (1) ad [ES] e [EI] i loro rispettivi valori all'equilibrio

(1)

e

M


dividendo per [E] e moltiplicando per KS sia il numeratore che il denominatore:

da cui raccogliendo Ks al denominatore:

M

M

M

M

M

M

M

Cinetica enzimatica Cinetica enzimatica inibizione non competitiva 55

Inibizione non competitiva

Un inibitore non competitivoinibitore non competitivo è una sostanza che si lega siaall'enzima libero che al complesso ES

La presenza di I non impedisce ad S di legarsi ( e viceversa)


Derivazione dell’ equazione cinetica in presenza di un inibitore non competitivonon competitivo

Sostituendo nella (1) ad [ES], [ESI] e [EI] i lori rispettivi valori all'equilibrio

(1)

e;M M

M


dividendo per [E] e moltiplicando per KS sia il numeratore che il denominatore:

da cui raccogliendo Ks al denominatore:

dividendo numeratore e denominatore per :

M

M

M

M

M

M

M

M

M

la Km aumenta se l'affinità di E per l'inibitore è maggiore di quella di ES ( > 1),la Km diminuisce se l'affinità di E per l'inibitore è minore di quella di ES ( < 1).


Gli inibitori non competitivinon competitivi (reversibili) possono essere confusi con gli inibitori irreversibiliinibitori irreversibili che inattivano l'enzima, causando una diminuzione di Vmax.


Gli inibitori non competitivinon competitivi sono poco rappresentati: Hg2+,Ag+

aspirina (inibitore delle cicloossigenasi)

Cinetica enzimatica Cinetica enzimatica inibizione incompetitiva 61

Inibizione incompetitiva

Un inibitore incompetitivoinibitore incompetitivo è una sostanza che si lega reversibilmente solo al complesso ES dando origine al complesso non produttivo ESI


Derivazione dell’ equazione cinetica in presenza di un inibitore incompetitivoincompetitivo

Sostituendo nella (1) ad [ES] e [ESI] i lori rispettivi valori all'equilibrio:

e

(1)

M M


dividendo per [E] e moltiplicando per KS sia il numeratore che il denominatore e raccogliendo [S] al denominatore:

dividendo numeratore e denominatore per :

M

M M

M

M

M


Gli inibitori incompetitiviincompetitivi sono anch’essi poco rappresentati:

Sodio azide (NaN3) per la citocromo-ossidasi

I cianuri per l’ arilsolfatasi

L'inibizione da eccesso di substrato può essere talvolta di tipo incompetitivo: il complesso ESS non è produttivo

Reazioni a due substrati

S1 + S2 P1 + P2Bi—Bi

Uni-Bi Uni-Ter

Meccanismi Sequenziali

Le reazioni sequenziali sono quelle in cui tutti i reagenti si legano all'enzima prima che venga rilasciato il prodotto e possono venire suddivise in due sottoclassi, reazioni ordinate e reazioni casuali. Nel primo caso i reagenti si legano e i prodotti sono rilasciati secondo una sequenza obbligatoria, mentre nel secondo caso non esiste una sequenza di legame obbligatoria.

Meccanismi a Ping-pong

Le reazioni a ping-pong sono quelle in cui almeno un prodotto viene rilasciato prima che tutti i substrati si siano legati

Grafici di Lineweaver-Burk

Si consideri un grafico per un enzima che usa un meccanismo sequenziale:

Qui A agisce da substrato variabile. Sono usati cinque valori di concentrazione di fisso, B, e ognuna dà cinque intercette con gli assi 1/v e 1/[A]. Questi rappresentano differenti valori apparenti di 1/Vmax and 1/KA. I valori veri

sarebbero quelli ottenuti saturando la concentrazione di B, oppure a concentrazione infinita di B. Questi non possono essere misurati direttamente. La stima più vicina sarebbe la misura ottenuta alla più alta concentrazione di B..

Una proteina allosterica

Una proteina allosterica è una proteina che contiene due o più siti di legame topologicamente distinti che interagiscono in modo funzionale l'un con l'altro. Il che significa che ci sono almeno due siti in due differenti posizioni che sono capaci di legare dei leganti (substrati, inibitori...). La formazione di un legame di un legante ad un sito altera le proprietà dell'altro sito.

La maggioranza delle proteine allosteriche sono degli enzimi per il fatto che sono capaci di catalizzare delle reazioni, però alcune, come l'emoglobina, sono semplicemente delle proteine di legame o di trasporto.

La cinetica sigmoidale

Allo stato attuale il grafico iperbolico, della velocità contro la concentrazione del substrato vale per gli enzimi che seguono la legge di Michaelis-Menten,. Un simile grafico per un enzima allosterico dà un tipo di curva differente chiamato sigmoide, o curva ad S.

Cooperatività

Per cooperatività si intende il cambiamento della costante di legame della proteina nei confronti di piccole molecole a causa di una precedente formazione di legami di un'altra piccola molecola.

Se la modificazione aumenta la capacità di legame (o affinità) si parla di cooperatività positiva. Se questa capacità di legame viene diminuita si parla di cooperatività negativa.

Gli inibitori e attivatori allosterici, a cui ci riferiremo come effettori allosterici, sono una delle ragioni principali per l'importanza di detti enzimi. L'alterazione della velocità di catalisi enzimatiche per inibizione o attivazione è la chiave dei metodi di controllo metabolici. Il grafico seguente mostra il modo in cui gli effettori cambiano il grafico cinetico di un tipico enzima che mostra una coopeatività positiva.

Dalle curve è chiaro che tutte tendano al valore di Vmax. Questo vuol dire che gli effettori hanno operato sulla capacità di legare il substrato e di conseguenza sulla Km. Questo sistema è detto Sistema K. Alcuni effettori lavorano cambiando la V max e si parla di Sistemi V.

Risposta bifasica a inibitori competitivi

Oltre all'inibizione allosterica, gli enzimi allosterici possono subire l'influenza di normali inibitori competitivi come qualsiasi enzima. Gli inibitori classici competitivi funzionano perchè sono chimicamente simili al substrato. In un enzima allosterico con cooperatività positiva da substrato un inibitore competitivo potrebbe essere molto simile al substrato in struttura da avere le stesse proprietà cooperative del substrato. Perciò a basse concentrazioni di substrato un inibitore competitivo aumenta la capacità dell'enzima di legare il substrato e quindi la sua velocità di reazione. Ad alte concentrazioni l'inibitore bloccherà il substrato legandosi al solito modo e rallentando di conseguenza la reazione.

L'inibitore ha perciò un effetto bifasico. A basse concentrazioni sembra attivare, mentre ad alte concentrazioni disattiva come al solito.

http://www-biol.paisley.ac.uk/kinetics/italiano/chapter3_2.html

Ipotesi concertata Questa ipotesi di Monod, Wyman e Changeaux è una spiegazione semplice ed elegante per la cooperatività positiva da substrato e l'influenza degli effettori allosterici che sono comportamenti comuni per gli enzimi allosterici. Si basa sull'idea che un enzima allosterico sia costituito da un certo numero di subunità che possono esistere in due differenti conformazioni. Ci si riferisce alla conformazione Rilasciata, o stato R, e alla forma Tesa, o stato T. Le subunità di un particolare enzima interagiscono in modo tale che devono avere tutte la stessa conformazione. In altre parole l'enzima deve essere costituito o da soli R o da soli T, non sono ammesse miscele delle due. In soluzione le due forme si interconvertono l'una nell'altra secondo un equilibrio. Dal momento che non si possono avere miscele delle due forme, sarà un equilibrio molto semplice tra due forme consistenti di subunità o di solo R o di solo T.

No

Ipotesi sequenziale

L'ipotesi concertata si basava sull'assunzione che una molecola di enzima potesse contenere un solo tipo di subunità, R o T. L'ipotesi sequenziale accetta la possibilità che possano trovarsi enzimi misti,

contenenti cioè entrambe le subunità. Ancora si avrebbe un equilibrio di cui le forme pure R e T rappresentano gli estremi di questo equilibrio.

Inibitori e attivatori

Si può spiegare facilmente l'influenza degli effettori allosterici. Un attivatore lavorerebbe allo stesso modo del substrato, anche se si lega ad un sito differente della subunità, mentre un inibitore avrebbe l'effetto di rendere l'enzima più rigido rendendogli più difficile sottostare al cambio dell'adattamento indotto da R a T.

Metodo spettrofotometrico

A=(p-s). c x lA=(p-s). c x lt t

Micromoli di substrato trasformate al minuti per litro di miscuglio di incubazione nel saggio

c = 1 x 106 x A n=1t n x l p-s t

U = 1 x 106 x A x VL n x l p-s t v

Concentrazione attività enzimaticaAttività specifica purificazione (inibitori)

METODO END POINT

Se la conversione del substrato è completaS P

A

t

A

Acido urico + O2 + H2O Allantoina + H2O + CO2

293=12600 293=nullo

Metodo a dosaggio accoppiato

Modello di reazione accoppiata semplice a singolo substrato

S P P1 Enzima principale Enzima indicatore

Modello di reazione accoppiata ausiliaria a singolo substrato

S P P1 P 2 Enzima principale Enzima ausiliario Enzima indicatore

Reazioni a due Substrati

Sequenziali

Ping-pong

Seguire le variazioni spettrofotometriche di un substrato mantenendo la concentrazione saturante dell’altro

Sampling method (metodo dell’accumulo)

Si procede alla reazione per un tempo t poi si aggiunge un reattivo che denatura l’enzima e di colorare al tempo stesso sia il substrato che il prodotto

Metodi cromatografici

Si differenzia dal precedente solo per la misurazione al posto di uno spettrofotometro viene utilizzato un cromatografo

Metodi radiometrici

In questa maniera si fa in modo di incamerare nel prodotto uno o più radioisotopi

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