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M/z: Nozioni di Spettrometria di Massa e di Proteomica Applicata alla Biomedicina Marco Gaspari Laboratorio Proteomica
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M/z: Nozioni di Spettrometria di Massa e di
Proteomica Applicata alla Biomedicina Marco Gaspari
Laboratorio Proteomica
Argomenti
• Nozioni di analisi proteomica
• Gel elettroforesi bidimensionale
• Elementi costitutivi dello spettrometro di massa
• Ionizzazione MALDI
• Ionizzazione ESI
• Analizzatore a tempo di volo
• Spettrometria di massa in tandem
• Identificazione di proteine tramite PMF o MS/MS
Analisi proteomica
Analisi proteomica
Gel elettroforesi 2D: prima dimensione
4 5 6 7
Gradiente di pH
pI = 4.2 pI = 5.2 pI = 6.8
Caricamento del campione
Applicazione voltaggio
Isoelettrofocalizzazione (separazione in funzione
del punto isoelettrico)
+ -
+ -
Gel elettroforesi 2D: seconda dimensione
Aggiunta SDS
Gel elettroforesi 2D: seconda dimensione
+
- C
ampo
ele
ttric
o
SDS PAGE (separazione in funzione delle
massa)
Analisi proteomica
Analisi proteomica
Lista di proteine differenzialmente presenti nel tessuto tumorale
• Determinare il peso molecolare di una grande varieta’ di molecole e biomolecole (peptidi, proteine)
• Fornire informazioni strutturali sulle proteine, e sulle loro modificazioni post-traduzionali.
• Effettuare analisi quantitativa sia di piccole molecole che di biomolecole, fornendo alta sensibilita’ ed elevata specificita’
La spettrometria di massa e’ una sofisticata tecnica analitica in grado di:
Spettrometria di massa
Per effettuare un’analisi mediante spettrometria di massa bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe’ l’analita, e successivamente misurare come le traiettorie dello ione risultante rispondono nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici.
John Fenn, Premio Nobel per la Chimica 2002
Le traiettorie degli ioni dipendono dal loro
rapporto massa/carica m/z
Spettro di massa
4999 32000 59001 86002 113003 140004
m/z 0
100
% In
tens
ity
1D PAGE
M1+
M2+
Componenti di uno spettrometro di massa
Camera di ionizzazione
Analizzatore
Rivelatore
MALDI, ESI
Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo
Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore
Componenti di uno spettrometro di massa
Camera di ionizzazione
Analizzatore
Rivelatore
Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo
Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore
MALDI, ESI
Ionizzazione
Condizione necessaria all’analisi spettrometrica e’ la generazione di specie cariche in fase gassosa. Tale processo e’ detto ionizzazione.
Il processo richiede energia
1900 1925 1950 1975 2000
1984 1966 1985
1981
1907
Costruito il primo spettrometro di massa
EI
ESI FAB MALDI CI
Tipi di ionizzazione (1)
Protonazione
Deprotonazione
M + H+ à MH+
M - H+ à [M-H+]-
-
O
O
+ NH3
Espulsione di elettroni
Addizione cationica
M à M+.
M + Na+ à MNa+
- e-
Tipi di ionizzazione (2)
CH3
+.
OH
OH Na+
Principali tecniche di ionizzazione
Ionizzazione “hard”
• EI (electron impact)
Ionizzazioni “soft”
• MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation)
• ESI (electrospray ionisation)
MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
• La tecnica e’ basata su un’analisi in fase solida, anche se il
campione di partenza e’ in genere in soluzione.
• L’energia necessaria alla ionizzazione del campione e’
fornita sotto forma di radiazione elettromagnetica.
• La radiazione e’ inviata in pacchetti ad alta intensita’ tramite
un impulso laser
MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
Matrice
Campione (proteina,peptide, acido nucleico, zucchero)
Laser ad azoto, emissione a 337 nm (UV)
OH
HO
COOH
H CN
COOH
DHB CHCA
MALDI- preparazione del campione
Piastra metallica per la deposizione del campione e l’analisi
Soluzione di matrice Soluzione campione
Miscelare (la matrice e’ in forte eccesso)
Depositare sulla piastra metallica (1 µL)
Lasciare cristallizzare
Piastra metallica
Piastra metallica
+
+
+
MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
+
+
+
+
+
+ +
+
+
Proteina
Matrice
Impulso laser + 20 kV
All’analizzatore Piastra m
etallica
MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
10700 20000 24000 m/z
0
100
% In
tens
ity
20900
10451
• Genera per lo piu’ specie monocarica
• Buona tolleranza a contaminanti e Sali
• Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa)
MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
10700 20000 24000 m/z
0
100
% In
tens
ity
20900
10451
[M+H]+
[M+2H]2+
• Genera per lo piu’ specie monocariche
• Buona tolleranza a contaminanti e Sali
• Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa)
Elettrospray - ESI
• La tecnica e’ basata sulla nebulizzazione di una soluzione contenente il campione da analizzare.
• L’energia di ionizzazione e’ fornita da un campo elettrico generato tra l’ago di introduzione del campione e lo spettrometro di massa.
-
+
+
+
+
+ + + + + +
MS inlet +
+ + +
+
+ +
+ + + +
+
+
+
+ +
+ + + +
+ + + +
+ + + + - +
+ +
+ + +
+ + + -
- - - - + + -
+ +
+ +
+ + -
- +
- + + + +
+ + - -
+ - - +
Alimentatore
Elettrospray - ESI
Polo positivo Polo negativo
Campo elettrico sufficiente Ionizzazione
+ - + 1000-5000 V + 50 V
+ -
L’elettrospray genera ioni multicarica
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+ +
+ + +
+ +
+
+
+
+
+ +
+ + +
+
La ionizzazione mediante elettrospray di una soluzione contenente una singola proteina generera’ un segnale multiplo allo spettrometro di massa, dovuto al fenomeno della formazione di ioni multicarica.
Goccia generata da elettrospray
La goccia evapora lungo il tragitto che porta allo spettrometro
La proteina ionizzata entra nello spettrometro di massa
MALDI & ESI: interleuchina 6
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z
0
100
% in
tens
ity
996.48 909.86 872.01 1046.40 951.19
805.03
775.27 1101.28 1162.39
1230.61 747.63 1307.49
1394.65
10700 20000 24000 m/z 0 0
100
% In
tens
ity
20900
10451
MALDI
ESI
Mw=20904
Mw=20899
Componenti di uno spettrometro di massa
Camera di ionizzazione
Analizzatore
Rivelatore
MALDI, ESI
L’analizzatore svolge il compito di separare gli ioni secondo il loro rapporto m/z prima che essi arrivino al rivelatore
Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore
Analizzatore a tempo di volo P
ushe
r, 10
-20
kV
Rivelatore
+
+ +
Ionizzazione
Campo elettrico
Campione
Assenza di campo elettrico
Ek= ½ mv2
Analizzatore a tempo di volo
• In un analizzatore a tempo di volo (TOF), gli ioni vengono separati all’interno di uno spazio di 1-2 metri compreso tra la sorgente di ionizzazione ed il rivelatore, detto tubo di volo.
• Ioni aventi una massa elevata viaggiano nel tubo di volo con velocita’ ridotta, arrivando con ritardo al rivelatore rispetto a ioni piu’ piccoli.
Componenti di uno spettrometro di massa
Camera di ionizzazione
Analizzatore
Rivelatore
Analizzatore a tempo di volo, quadrupolo
Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore
MALDI, ESI
Esempio di rivelatore: moltiplicatore di elettroni
Uno ione dall’analizzatore 106 elettroni
Serie di dinodi
L’urto di un singolo ione proveniente dall’analizzatore causa una cascata di elettroni. L’impulso elettrico viene successivamente digitalizzato
Ionizzazione MALDI TOF
Piastra metallica
Laser
Tempo (m/z)
Inte
nsita’
Segnale amplificato
Spettrometro MALDI-TOF
Rivelatore
Spettro MALDI-TOF di una Fosfoproteina
m/z
Rel
. Int
ensi
ty
23010
22930 23090
m/z
Rel
. Int
ensi
ty
No phosphorylation 2 phosphorylations
1 phosphorylation
Delta mass = 80 Da
MALDI-TOF MS diagnostic patterns
Using a highly optimized peptide extraction and matrix-assisted laser desorption/ ionization–time-of-flight (MALDI-TOF) MS–based approach, we now show that a limited subset of serum peptides (a signature) provides accurate class discrimination between patients with 3 types of solid tumors and controls without cancer. Targeted sequence identification of 61 signature peptides revealed that they fall into several tight clusters and that most are generated by exopeptidase activities that confer cancer type–specific di fferences superimposed on the proteolytic events of the ex vivo coagulation and complement degradation pathways.
MALDI-TOF MS in microbiology
MALDI-TOF MS in microbiology
Spettrometro ESI-TOF
La ionizzazione MALDI e’ pulsata (con la frequenza del laser), percio’ si presta bene per essere collegata ad un analizzatore TOF.
ESI e’ una sorgente continua di ioni.
L’accoppiamento ESI-TOF richiede una speciale geometria che unisca la sorgente continua di ioni con un’analisi TOF di tipo pulsato (geometria ortogonale).
ESI-QqTOF analizzatore ibrido
pusher rivelatore ESI
m/z
Intensita’
0
100
1000
Quadrupolo Quadrupolo
Filmato
Spettrometria di massa in tandem (MS/MS)
• ESI e MALDI generano ioni causando minima frammentazione nelle molecole.
• Questo implica che l’unica informazione ottenibile dall’analisi e’ una misura piu’ o meno accurata del peso molecolare dell’analita.
• Cio’ non e’ sufficiente per una dettagliata caratterizzazione strutturale di peptidi e proteine (struttura primaria, modifiche post-traduzionali).
E’ necessario usare la spettrometria di massa in tandem
Spettrometria di massa in tandem (MS/MS)
La spettrometria di massa in tandem consiste nell’effettuare una doppia analisi di massa su un determinato campione. Per fare cio’, e’ possibile utilizzare due analizzatori in serie, o utilizzare lo stesso analizzatore a tempi diversi.
m/z
Inte
nsita’
0
100
1000 m/z 0
100
1000
MS2: MS/MS su m/z 850.1
Inte
nsita’
MS1: spettro MS da 0 a 1000 m/z
650.4
850.1
401.3 80.4
198.6 678.8
466.7
850.1
Selezione del picco
Qq-TOF : analisi MS/MS pusher Rivelatore
Da ESI
m/z
Relative intensity (%)
0
100
1000
Full scan MS
m/z
Relative intensity (%)
0
100
1000
MS/MS su
Q0: selezione
Q1: Camera di collisione
Newborn Screening workflow
Take supernatant
Flow injection MS
MS spectrum
Free carnitine PKU
CV MSUD
CV
CV
CV
Homocystinuria
CV Citrullinemia
CV GA-I
CV CPT-I/II
CV VLCAD
CV SCAD
CV ASA
CV PMA/MMA
CV
CV CV
CV CV CV CV
CV
CV
CV CV
CV
CV
CV
Identificazione di proteine mediante spettrometria di massa
• La determinazione del peso molecolare della proteina intatta non e’ un’informazione sufficiente.
• Nonostante nuove tecniche basate sulla frammentazione di proteine intatte siano in rapida evoluzione, generalmente l’approccio standard per l ’ identif icazione di una proteina e’ l ’analisi spettrometrica del digerito triptico della proteina stessa.
Identificazione di proteine mediante spettrometria di massa
Digestione triptica
Analisi spettrometrica del digerito
Ricerca in banca dati
Approccio 1: peptide mass fingerprinting (PMF)
• Il peso molecolare dei peptidi ottenuti mediante digestione triptica e’ analizzato tramite spettrometria di massa.
• La lista dei pesi molecolari di un buon numero di peptidi triptici ( > 5) e’ spesso un’informazione sufficiente per identificare una proteina (o, piu’ specificatamente, il gene da cui essa proviene).
PMF: esempio
Digestione triptica
Spettro MALDI-TOF
m/z
Inte
nsita’ (%
)
0
100
2000
650.4
748.6
1378.8
1606.7
1885.2
Pesi molecolari rilevati sperimentalmente
1885.2 1606.7 1378.8 748.6 650.4
Lys, Arg
PMF: esempio
Digeriti triptici in silico: peso molecolare previsto per i peptidi triptici appartenenti a tre proteine “modello”
Citocromo C Mioglobina Lattalbumina
1495.70 1470.69 1168.62 1018.44 964.53 779.45
678.38 634.39 604.35 547.27
1885.02 1853.96 1815.90 1606.85 1502.67 1378.84
1271.66 748.43 708.32 662.33 650.31 631.34
4654.15 1889.77 1642.73 1200.65 1034.49 653.31
650.32 618.34 549.28
La lista di peptidi acquisita sperimentalmente viene confrontata con i digeriti teorici presenti nella banca dati.
1885.2 1606.7 1378.8 748.6 650.4
Dato sperimentale
? ??
MS/MS di peptidi Nello spettrometro di massa, durante esperimenti MS/MS, i peptidi tendono a frammentare in corrispondenza del legame ammidico.
M+ b + y+
b+ + y M+
MS/MS di un peptide
K S A T K S A
S A T
K S
A T
S A
K T
500 m/z
Inte
nsita’
0
100
405
Spettro MS
MS/MS
Spettro MS/MS
m/z
Inte
nsita’
0
100
500
405
353
301
201
170
156
248
Thr-Ala-Ser-Lys
MS/MS di peptidi
H2N
HN
OH
O O
O O
NH
HN
R2
R3
R4
b1 b2 b3
y3 y2 y1
b1 = Mres + H+
b2 = b1 + Mres
bn-1 = MH+ - 18 - Mres
R1
y1 = Mres + 18 + H+
y2 = y1 + Mres
yn-1 = MH+ - Mres
- H2O nel caso di D, E, S, T
- NH3 nel caso di N, Q, K, R
Inoltre: Per un peptide composto da n ammino acidi:
MS/MS di peptidi Per interpretare uno spettro MS/MS di un peptide, si parte in genere da un estremo, superiore o inferiore, dello spettro, cercando di individuare potenziali serie di ioni b o y. Le differenze tra i vari ioni b (o y) nella serie, corrispondono alle masse residue degli amminoacidi componenti la sequenza del peptide.
Attenzione: la frammentazione e’ piu’ o meno favorita in diversi punti della sequenza del peptide; l’intensita’ dei frammenti risultanti sara’ dunque variabile ( e spesso il frammento potrebbe essere assente, interrompendo la serie).
427
314
y4
y2
Intensita’
m/z
y3
200 484 y5
G
L
N
…..GLN…
MS/MS di peptidi b1 = Mres + H+
b2 = b1 + Mres
bn-1 = MH+ - 18 - Mres
y1 = Mres + 18 + H+
y2 = y1 + Mres
yn-1 = MH+ - Mres Ala 71
Pro 97
Leu 113
Asn 114
Thr 101
Val 99
Lys 128
Phe 147
Masse residue di alcuni ammino acidi
592
427 521
574
407
314
279 166
186 M + H+
H2N
HN
OH
O O
O O
NH
HN
R2
R3
R4
b1 b2 b3
y3 y2 y1
R1
Intensita’
m/z
MS/MS di peptidi b1 = Mres + H+
b2 = b1 + Mres
bn-1 = MH+ - 18 - Mres
y1 = Mres + 18 + H+
y2 = y1 + Mres
yn-1 = MH+ - Mres
Ala 71
Pro 97
Leu 113
Asn 114
Thr 101
Val 99
Lys 128
Phe 147
Masse residue di alcuni ammino acidi
592
427 521
574
407
314
279 166
186
Ala – Asn – Lys – Leu - Phe
b2 b3
b4
M + H+
y4
MH+ - H2O
y3
y2 y1
Intensita’
m/z
Identificazione di proteine approccio 2: MS/MS ion search
Digestione triptica
Spettro MS
m/z
Inte
nsita’ (%
)
0
100
2000
650.4
748.6
1378.8
1606.7
1885.2
PMF (1)
MS/MS ion search (2)
Identificazione di proteine tramite MS/MS
m/z
Inte
nsita’ (%
)
0
100
2000
650.4
748.6
1378.8
1606.7
1885.2
m/z
Inte
nsita’ (%
)
0
100
2000
1885.2
m/z
Inte
nsita’ (%
)
0
100
2000
1606.7
1378.8
m/z
Inte
nsita’ (%
)
0
100
2000
748.6
m/z
Inte
nsita’ (%
)
0 2000
650.4
m/z
Inte
nsita’ (%
)
0
100
2000 100
Spettro MS/MS di un peptide acetilato
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z 0
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
1460.5
1250.4 733.2 945.1
1103.4 534.2
846.3 662.2 954.2
781.6 1016.4 1391.4
447.1 1373.4 1174.4 1561.4 348.1
276.9 1355.3 429.0 1665.4
1779.4
y12
y7
y3
y6
y5
y4 y10
y9
y8 y13 y14
b4o b7
b2
822.1
[M+2H-2H2O]+2
[M+2H-H2O]+2
b10o b12
o
b12
b14 b13 b15
Y L S T P I F S K(Ac)L A Q W S N K
y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y12 y13 y14
b2 b4o b7 b10
o b12 b13 b14 b15
HPLC-ESI-MS
Miscele complesse di peptidi non possono essere analizzate direttamente mediante spettrometria di massa. Tali miscele sono analizzate in maniera piu’ efficace tramite cromatografia liquida HPLC accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS).
Un normale spettrometro di massa e’ capace di analizzare simultaneamente circa 50-100 peptidi. Utilizzando LC-MS, le miscele peptidiche possono arrivare a contenere migliaia di componenti diversi.
HPLC-ESI-MS
Colonna HPLC
Campione
ESI
Fase mobile
Spettrometro
di
massa
Analisi proteomica
Lo studio qualitativo e quantitativo delle proteine contenute in un dato tessuto, coltura cellulare o fluido biologico. Tale studio puo’ riguardare rapporti quantitativi tra le proteine stesse, modificazioni post-traduzionali, interazioni tra proteine.
Analisi Proteomica Mediante nanoLC-ESI-MS/MS
DIgestione triptica
Miscela di Proteine Miscela di peptidi
nanoLC-ESI-MS/MS analysis
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 0
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
Migliaia di spettri MS/MS
RIcerca in banca dati Identificazione di centinaia/
migliaia di sequenze peptidiche, riconducibili a
centinaia di proteine diverse
Quantitative Phosphoproteomics Reveals a Cluster of Tyrosine Kinases That Mediates Src Invasive Activity in
Advanced Colon Carcinoma Cells
The nonreceptor tyrosine kinase Src is frequently overexpressed and/or activated in human colorectal carcinoma (CRC), and its increased activity has been associated with a poor clinical outcome. Src has been implicated in growth and invasion of these cancer cells by still not well-known mechanisms. Here, we addressed Src oncogenic signaling using quantitative phosphoproteomics. Src overexpression increased growth and invasiveness of metastatic SW620 CRC cells. Proteomic analysis revealed that Src phosphorylates a cluster of tyrosine kinases which were required for its invasive activity. Targeting these tyrosine kinases may be of significant therapeutic value in this cancer.
Cancer Research, 2009 Cellule tumorali
Estrazione proteine
Isolamento fosfoproteine
Identificazione e quantificazione
m/z 0
A G H I pS K P L R
Identification of cardiac myosin binding protein C as a candidate biomarker of myocardial infarction by proteomic analysis.
Molecular & Cellular Proteomics, 2009
Acute myocardial infarction (AMI) is a common cause of death for which effective treatments are available providing diagnosis is rapid. Isolated mouse hearts were perfused with oxygenated protein-free buffer and coronary effluent collected after ischemia or during matched normoxic perfusion. 2D Gel of ischemic and control coronary effluent identified more than 200 asymmetric spots. Perfusing hearts with protein-free buffers provides a platform of graded ischaemic injury that allows detailed analysis of protein release and identification of candidate cardiac biomarkers like myosin binding protein C.
The identification of proteins that are preferentially expressed on the membrane of metastatic tumor cells is of fundamental importance in cancer research. A dramatic increase in abundance at the cell membrane was observed for a broad variety of proteins which were mainly thought to reside in intracellular compartments. F u r t h e r m o r e , w e s h o w e d b y microautoradiographic analysis that certain target proteins can readily be reached by intravenously administered radiolabeled antibodies.
Comparative Analysis of the Membrane Proteome of Closely Related Metastatic and Nonmetastatic Tumor Cells
Metastatic potential
Cancer Research, 2009
