Curve di taratura

• Mostra la risposta di un metodo analitico a quantità note di analita.

• La retta ideale ha un andamento lineare, e copre l’intero intervallo di concentrazione nel quale prevediamo ricadano i nostri incogniti.

• Sebbene sia preferibile la risposta lineare (intervallo lineare), è possibile ottenere risultati validi anche nella zona non lineare (intervallo dinamico).

Lo ione Cu2+ assorbe a 600-630 nm

Curve di taratura: minimi quadrati

• IL metodo dei minimi quadrati è la procedura più diffusa per individuare una retta ( o curva) passante per una serie di dati sperimentali.

• L’assunzione è che la incertezza su y (valore misurato) sia maggiore rispetto all’incertezza sulla quantità di analita contenuto negli standard.

• La PENDENZA e l’INTERCETTA della retta possono essere calcolate su Excel, così come l’incertezza su di esse (REGR.LIN)

Curve di taratura: analisi

• Preparare un certo numero di soluzioni contenenti quantità note di analita(soluzioni standard).

• Preparare soluzioni del bianco, ottenute utilizzando gli stessi solventi e reagenti usati per preparare le soluzioni standard, ma senza aggiungere analita.

• Analizzare le soluzioni standard e le soluzioni del bianco con un opportuno metodo strumentale.

• Sottrarre la risposta ottenuta dalle soluzioni standard a quella ottenuta dalle soluzioni del bianco.

• Costruire un grafico di risposta tra quantità note di analita (x) e segnale (y). Calcolare pendenza ed intercetta con il metodo dei minimi quadrati (foglio di calcolo).

• Analizzare soluzioni a concentrazione incognita dell’analita.• Dopo aver sottratto il segnale ottenuto dal bianco, interpolare la risposta

dell’analita (y0) nella retta di taratura, per ottenere il valore della concentrazione incognita (x0).

• Calcolare incertezza e intervallo di confidenza su x0

Incertezza sul valore di x calcolato

Errore standard della stima

Curve di taratura: incertezza

Dopo aver calcolato PENDENZA e INTERCETTA, si può procedere al calcolo dell’incertezza sul valore di xo (la concentrazione incognita che ha fornito il segnale yo). Necessario è, innanzitutto, calcolare l’errore standard della stima ( sono i segnali delle soluzioni standard, sono i valori di y calcolati dalla retta migliore). Altri parametri: j è il numero di repliche di analisi effettuate sull’incognito, n è il numero di analisi totale effettuato sui punti di calibrazione, xi-x medio non è altro che la deviazione standard sui valori di x moltiplicata per i gradi di libertà (n-1).

Metodo delle aggiunte standard

• Utilizzato per minimizzare errori sistematici dovuti ad interferenze ad opera della matrice.

• In questo metodo, è il campione stesso ad essere il solvente nel quale vengono preparate le soluzioni standard.

Se il fattore di risposta è molto diverso tra soluzioni standard e campione, è necessario utilizzare il metodo delle aggiunte standard.

Metodo delle aggiunte standard

Standard internoPer minimizzare l’errore casuale associato ad un particolare strumento, si può fare uso di standard interni. Lo standard interno avrà proprietà chimiche quanto più possibile simili all’analita, e non causerà alcun tipo di interferenza nella lettura del segnale dell’analita. IS sarà addizionato in quantità note ad ogni campione da analizzare (sia soluzione standard che incogniti). Sull’asse y, invece della risposta del segnale, si inserirà il rapporto tra la risposta del nostro analita e quello dello standard interno (corrected peak area ratio).

Metodi Elettrochimici di Analisi

Nei metodi elettrochimici di analisi si misurano grandezze fisiche elettriche, perciò è fondamentale conoscere quali sono i principali legami tra fenomeni chimici e fenomeni elettrici, ed in particolare le grandezze fisiche utilizzate in campo elettrico e le relazioni che esse hanno con le grandezze chimiche (concentrazione, attività ecc)

PotenziometriaLa potenziometria è una tecnica di analisi strumentale in cui si misura la differenza di potenziale tra due elettrodi immersi nella soluzione: un elettrodo di riferimento (a potenziale costante) e un elettrodo di misura, il cui potenziale dipende dalle concentrazioni delle specie chimiche in soluzione (in base alla legge di Nernst)

La misura viene effettuata con un potenziometro o millivoltmetro, in grado di effettuare la misura di d.d.p. in condizioni di corrente praticamente nulla.

I valori di potenziale servono a seguire titolazioni e individuare il punto di equivalenza o a determinare parametri chimico-fisici come il pH.

Metodi Potenziometrici

Misure Potenziometriche diretteconfronto tra il potenziale di un elettrodo

indicatore immerso nella soluzione campione, con quello dello stesso elettrodo immerso in una serie di soluzioni standard del componente che si vuol analizzare

Titolazioni Potenziometrichemisura del potenziale di un elettrodo

immerso in una soluzione che si sta titolando. Il punto di equivalenza può essere determinato dalle variazioni di potenziale

La Cella per le Determinazioni Potenziometriche

Elettrodo di Riferimento

E' necessario che il loro potenziale sia noto e costante per tutto il tempo dell'analisi.

Il primo elettrodo a cui possiamo pensare e l'elettrodo normale a idrogeno, essendo l'elettrodo preso come riferimento per la determinazione dei potenziali standard di riduzione ed a cui, per convenzione, è stato assegnato potenziale zero. Questo elettrodo è però di difficile costruzione e manipolazione per cui non viene utilizzato nelle comuni pratiche analitiche.

Si preferiscono altri elettrodi di riferimento, il cui potenziale è comunque sempre riferito allo 0 dell'elettrodo standard a idrogeno.

Elettrodo a Calomelano

Sfrutta la seguente reazione:

Il suo potenziale è funzione del seguente equilibrio:

Questo tipo di elettrodo, oltre che come elettrodo di riferimento, può essere utilizzato come elettrodo indicatore per lo ione cloruro in quanto il suo potenziale dipende dalla concentrazione degli ioni cloruro.

Elettrodo ad Argento/Cloruro d’Argento

Questo è costituito da un filo di argento ricoperto di AgCl immerso in una soluzione di KCl

Il suo potenziale e funzione del seguente equilibrio:

Questo tipo di elettrodo, oltre che come elettrodo di riferimento, può essere utilizzato come elettrodo indicatore per lo ione cloruro in quanto il suo potenziale dipende dalla concentrazione degli ioni cloruro.

Elettrodi indicatori-1° specieIl potenziale dell'elettrodo indicatore deve dipendere direttamente dalla concentrazione di uno o più dei reagenti o dei prodotti della reazione analitica.

Quando durante l'analisi volumetrica si ha la formazione di un precipitato o di un composto stabile, l'elettrodo migliore è quello costituito dall'elemento stesso del catione che partecipa alla reazione (elettrodi di prima specie). Cosi ad esempio, un elettrodo di argento può essere impiegato nella titolazione di ioni argento con ioni cloruro, dato che il suo potenziale dipende dalla concentrazione dello ione argento.

Oltre all’argento, in particolari condizioni (assenza di aria), è possibile utilizzare come elettrodi di prima specie elettrodi di zinco, rame, cadmio, piombo, tallio e bismuto.

Elettrodi indicatori-2° specie

Gli elettrodi metallici servono anche come indicatori per gli anioni che formano precipitati poco solubili con il catione del metallo di cui e costituito l'elettrodo (elettrodi di seconda specie). In questo caso basta saturare la soluzione in esame con il sale poco solubile. Ad esempio è possibile fare in modo che il potenziale dell'elettrodo di argento dipenda dalla concentrazione degli ioni cloruro presenti in soluzione saturando la soluzione stessa con AgCl.

Elettrodo a Membrana• Si basa sulla proprietà di scambio ionico tra il materiale di cui e

costituita la membrana e la soluzione con cui è a contatto.• Il più importante tra gli elettrodi a membrana è l'elettrodo a vetro,

utilizzato per misurare il pH di una soluzione.

Sottile membrana di vetro sensibile al pH

Elettrodo a Vetro

• La parte attiva di tale elettrodo è la membrana di vetro speciale (silicati di sodio, litio, bario) che ha la particolare proprietà di scambiare gli ioni idrogeno presenti nelle soluzioni con le quali è in contatto con ioni monovalenti presenti nella zona più esterna del vetro.

• Lo strato superficiale della membrana, sia esterno che interno, è carico. L’entità della carica (negativa) è funzione della concentrazione degli ioni idrogeno.

• All'interno del tubicino di vetro è presente una soluzione di concentrazione ioni idrogeno nota ed un elettrodo di riferimento, detto interno, in genere ad Ag/AgCl; all'esterno il tubicino è in contatto con la soluzione della quale si vuol misurare il pH.Elettrodo a vetro: sistema 1 Elettrodo a vetro: sistema 2

Potenziali di Membrana e Misura del pH

Erif1 Erif2 potenziali di riferimento esterno ed interno fissiEj potenziale di giunzioneEb potenziale di interfase legato alla differenza tra i potenziali

E1 ed E2 delle soluzioni interna ed esterna

Il potenziale di interfase varia con il pH della soluzione di analita. I due elettrodi di riferimento forniscono solo i contatti elettrici con le soluzioni così da poter misurare il potenziale di interfase.

Elettrodo a vetro: errori

Errore alcalino: A valori elevati di pH e valori elevati di concentrazione di ioni alcalini, si può verificare che l’elettrodo risponda parzialmente anche alla concentrazione degli ioni alcalini (inducendo un errore negativo nella misura del pH). Ad esempio, una soluzione a pH 12 contenente ioni sodio 0,1 M, darà una lettura di 11,7 unità di pH.

Errore acido: A valori molto bassi di pH (< 1) si avrà una possibile saturazione della superficie del vetro esposta alla soluzione incognita, con conseguente sottostima del valore di pH (errore positivo).

• Comportano la misura del potenziale di un idoneo elettrodo indicatore in funzione del volume di titolante aggiunto

• Sono particolarmente utili per titolazioni di soluzioni torbide e colorate e per rilevare la presenza di specie inattese in soluzione

Titolazioni Potenziometriche

Altri Metodi Elettrochimici di Analisi

Metodi che sfruttano un procedimento elettrochimico come l’elettrolisi per scopi analitici.

Elettrogravimetria: si basa sul fenomeno dell' elettrolisi. Due elettrodi opportunamente conformati sono immersi nella soluzione in esame; a determinati potenziali assunti dagli elettrodi si verifica la scarica (cioè l'ossidazione su un elettrodo e la riduzione sull'altro) delle specie chimiche in analisi, che se si depositano sugli elettrodi possono essere poi determinate per via gravimetrica.

Coulombometria: In questa tecnica si impone una opportuna differenza di potenziale fra due elettrodi e si misura la corrente che circola in un determinato intervallo di tempo in seguito ai fenomeni di elettrolisi che si verificano agli elettrodi.

Spettroscopia

Insieme di tecniche analitiche che sfruttano l’interazione tra la radiazione elettromagnetica e la materia

La grandezza che si misura è il cambiamento di una o più proprietà caratteristiche delle molecole in seguito all’assorbimento della radiazione

La radiazione elettromagnetica, o luce, è una forma di energia che può essere descritta sia attraverso le proprietà delle onde che delle particelle

La Radiazione ElettromagneticaProprietà delle onde

La radiazione elettromagnetica è composta da un campo elettrico ed uno magnetico oscillanti che si propagano attraverso lo spazio ad una velocità costante (velocità della luce o c=2.99 x108m/s).

Il campo elettrico e magnetico oscillante risultano l’uno perpendicolare all’altro ed entrambi perpendicolari alla direzione di propagazione

La Radiazione ElettromagneticaUn’onda è definita dalle seguenti grandezze:

A ampiezza dell’ondaν frequenza (numero di oscillazioni per unità di tempo)λ lunghezza d’onda (distanza tra due massimi o minimi consecutivi, λ=

c/ν)numero d’onda (inverso della lunghezza d’onda)

I intensità (flusso di energia per unità di tempo ed area attraversata)

ν

La Radiazione Elettromagnetica

Proprietà particellari della radiazioneLa radiazione elettromagnetica può essere

interpretata anche come un fascio di particelle di energia detti fotoni i quali possono essere assorbiti dalla materia. Quando un fotone viene assorbito la sua energia viene acquisita dal campione. I fotoni hanno energia quantizzata e relazionata alla loro frequenza dalla relazione

dove h è la costante di Planck

nln hcchhE === )/(

Suddivisione della radiazione elettromagnetica in funzione dell’energia dei fotoni (e quindi della frequenza o della lunghezza d’onda)

Lo Spettro Elettromagnetico

Interazione Radiazione-MateriaSpettroscopie di assorbimento

Quando un fotone che impatta su una molecola contiene un quanto di energia pari alla differenza esistente tra due livelli energetici successivi di una molecola, viene assorbito e promuove la molecola da uno stato energetico fondamentale ad uno eccitato. L’intensità della radiazione assorbita diminuisce e questa attenuazione, detta assorbanza, viene misurata come segnale.

Interazione Radiazione-MateriaLe molecole possiedono differenti tipi di livelli energetici

I livelli energetici fondamentali ed eccitati relativi alla posizione degli elettroni di valenza (E0 ed E1) sono tra loro a una differenza energetica maggiore di quella esistente tra i livelli energetici vibrazionali (ν0 e ν1)

Il tipo di promozione energetica che avviene nella molecola dipende dall’energia del fotone con cui interagisce

Se l’energia assorbita dall’atomo è sufficientemente alta, l’elettrone può essere definitivamente dissociato dall’atomo formando uno ione con carica positiva. L’energia richiesta per questo processo differisce per ogni elemento e prende il nome di potenziale di ionizzazione. Anche gli ioni così formati possiedono un loro stato fondamentale e differenti stati eccitati attraverso i quali possono assorbire ed emettere energia mediante gli stessi processi di eccitazione e decadimento descritti per gli atomi.

Spettroscopia UV-Vis

Quando una molecola assorbe una radiazione visibile o ultravioletta subisce un cambiamento negli stati elettronici di valenza (σ®σ* o π®π*)

I legami ed i gruppi funzionali della molecola che sono responsabili dell’assorbimento sono detti cromofori

Poiché una transizione tra gli stati elettronici fondamentale ed eccitato coinvolge anche gli stati vibrazionali in essi contenuti, il segnale che si registra non è una riga singola ma una banda

Legge di Lambert-Beer

I = irradianza, o potenza radiante (P). Energia al secondo per unità di superficie del raggio di luce.

Legge di Lambert-Beer

Con questo nome si indica una legge empirica che esprime l’assorbanza A di una soluzione in funzione del coefficiente di assorbimento molare epsilon (in L/mole/cm), la lunghezza del cammino ottico l (in cm) e la concentrazione della soluzione c (mol/L).

Limiti della Legge di Lambert-Beer

Limiti della Legge di Lambert-Beer

All'aumentare della concentrazione aumenta il numero di particelle in soluzione ed aumenta anche il numero di urti fra queste; le forze interioniche e/o intermolecolari aumentano e possono formarsi molecole o aggregati di particelle più complesse, diverse per struttura da quelle in esame, per cui si potrà avere uno spostamento del massimo di assorbimento.

Un’altra condizione di validità della legge di Lambert-Beer è che le radiazioni luminose che devono attraversare la soluzione in esame siano monocromatiche. In realtà le radiazioni impiegate non sono mai rigorosamente monocromatiche a causa, soprattutto, di difficoltà strumentali. E' comunque sufficiente, per ottenere risultati corretti, che la banda continua di radiazioni, centrata attorno ad un valore nominale, sia la più stretta possibile.

Assorbimento di specie organiche e inorganiche

Ni2+

Analisi QuantitativaBianco

Analisi QuantitativaRetta di taratura

1ppm0.1ppm

0.01ppm1ppb

1(ppm)

0.10.010.001

Determinazione spettroscopica del ferro

Determinazione del ferro nel siero:

1. Ridurre Fe3+ presente nella transferrina a Fe2+.

2. Precipitare le proteine mediante TCA.

3. Trasferire un volume esatto del sovranatante in un altro contenitore, ed aggiungere ferrozina in eccesso

L’assorbanza è misurata a 562 nm Fe2+ + 3 ferrozina2- → (ferrozina)3Fe4-

Determinazione spettroscopica del ferro

• Il rame è uno ioneinterferente

• L’interferenza è eliminatada un agentemascherante: neocuproina o tiourea.

Spettroscopia UV-vis e aspirina: dosaggio impurezze

Un’applicazione in farmaceutica è la determinazione di impurezzedi acido salicilico nel prodottofinale aspirina. L’analisi viene effettuata in modo tale che il valore di assorbanza a 312 nm, in assenza di impurezze di AS, debba risultare inferiore a 0.02

Aspirina

Acidosalicilico

Spettroscopia UV-vis e aspirina: dosaggio nel visibile

Questo metodo viene utilizzato per la determinazione quantitativadell’aspirina. Il complesso viene analizzato alla lunghezza d’onda di 530 nm.

Analisi QuantitativaScelta della lunghezza d’onda di assorbimento

Spettrofotometro

Uno spettrofotometro può essere schematizzato come segue:

1) Sorgente di radiazione2) Selezionatore di lunghezze d’onda, o monocromatore3) Cella4) Rivelatore

Spettrofotometro

SorgenteÈ la parte dell’apparecchio da cui prende origine la radiazione

policromatica (contenenti cioè tutte le lunghezze d'onda del campo richiesto) che viene diretta sul campione. Negli strumenti che misurano la luce ultravioletta e visibile sono presenti due diverse lampade, in modo che la sorgente copra l’intervallo da 190 – 800 nm:

per la regione del visibile si utilizzano lampade a incandescenza (a filamento di tungsteno, lampade quarzo-iodio o lampade tungsteno-alogeno)

per la regione UV si usano lampade a scarica in un gas (deuterio o a idrogeno); sono costituite da un'ampolla di quarzo contenente il gas rarefatto nella quale viene attivata, tra due elettrodi, una scarica elettrica con la conseguente emissione di radiazioni con spettro continuo.

Gli spettrofotometri UV-visibile avranno quindi al loro interno queste due lampade, che vengono opportunamente intercambiate dal meccanismo interno. Il valore di “cambio – lampada” è in genere intorno a 350 nm.

SPETTROFOTOMETROMonocromatore:

Il monocromatore è il sistema ottico usato per disperdere la luce policromatica in bande monocromatiche, che vengono inviate in successione sul campione.

Esistono due tipi di monocromatori: basati su FILTRI (ottici o interferenziali), che

bloccano una parte della luce e lasciano passare solo la parte desiderata

basati su un ELEMENTO DISPERDENTE (prisma o reticolo), che separano le varie componenti della radiazione e ne permettono la successiva selezione della banda desiderata

SpettrofotometroCelle

È la componente destinata a contenere il campione da esaminare; questo, generalmente in soluzione, viene introdotto in contenitori che sono chiamati cuvette.

Oltre ad essere trasparenti alla radiazione impiegata, devono avere un ben preciso 'cammino ottico' (la lunghezza percorsa dalla radiazione nel campione) che dovrà essere sufficiente ad avere assorbimenti rilevabili dallo strumento.

in UV si utilizzano celle in quarzo (SiO2) nel visibile in vetro o quarzo o alcuni materiali plastici

RivelatoreSono dispositivi capaci di produrre un segnale elettrico che

dipende dall'energia delle radiazioni che lo investono. Tale segnale elettrico (proporzionale all'intensità luminosa) viene poi trasferito a un indicatore analogico o elaborato per via elettronica in modo più o meno complesso. Trattandosi della parte dello strumento che esegue la misura vera e propria, è evidente che ne rappresentano una parte molto importante, in particolare per quanto riguarda sia la sensibilità sia l'accuratezza dello spettrofotometro.